Name: Eksositozun Otomatik Tespiti ve Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Keşfedin, MATLAB tabanlı otomatik yazılım ile TIRF mikroskobisi görüntülerinde eksositik olayları tespit ve sınıflandırma yöntemini. Bu hesaplamalı yaklaşım, nörobiyoloji araştırmalarında verimliliği ve tekrarlanabilirliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dustin Revell ve Reginald Edwards'a test kodu ve GUI için teşekkür ederiz. R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ve F31NS103586 (FLU) dahil olmak üzere bu araştırmayı destekleyen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finansman sağlanmıştır.

1. Veri kümelerini ve dizini seçin
<ol><li>Analiz için veri kümelerini seçmek üzere Veri Kümelerini Bul düğmesini (Şekil 2A, kırmızı kutu 1) tıklatarak verilerin yatırıldığı klasöre (örneğin RawData klasörü) gidin. Veri Dosyaları, Veri Dosyalarını liste olarak otomatik olarak doldurur. Klasörde birden fazla veri kümesi olabilir.</li>
	<li>Dizin Seç düğmesini tıklatın ve analiz edilen dosyaların yatırılacağı dizini (örneğin, Test) seçin (Şekil 2A, kırmızı kutu 2) . Çözümleme düğmesine basıldığında, bu dizinde bir dizi klasör ve bitmiş çözümleme dosyasının yanı sıra ara geçici görüntüler oluşturulur. Bir dizin seçilmezse hatalar üretilir.</li>
</ol>2. Piksel boyutunu ve kare hızını ayarlama
<ol><li>Görüntülerin uygun kare hızını ve piksel boyutunu uygun "Kare Hızı" veya "piksel boyutu" kutusunda(Şekil 2A, yeşil kutu)doldurun. Hiçbir değer sağlanmazsa (varsayılan "0" olarak ayarlanır), program dosyayla ilişkili meta verileri kare hızı ve piksel boyutu için arar. Bu değerler bulunamazsa, program varsayılan olarak ölçüm için piksel başına ve zaman noktaları için kare başına olarak olur. NOT: Sağlanan örnekte kare hızı 100 ve piksel boyutu 0,08'dir.</li>
</ol>3. Maske seçin veya yapın
<ol><li>Dosya veri kümesi listesindeki veriler için otomatik olarak hücre maskeleri oluşturmak üzere Maske Oluşturucu düğmesini kullanın (Şekil 2A, mavi kutu). Maske Oluşturucu düğmesini kullandıktan sonra, seçilen dizinde MaskFiles adlı yeni bir klasör oluşturulur. "Çalıştır göstergesi" çalışırken sararacak ve tamamlandığında yeşile dönecektir. NOT: Veri Dosyaları listesindeki her dosya için bir maske, görüntü dosyasının ilk 10 karesinden (veya görüntü dosyasında 10'dan küçükse tüm çerçevelerden) oluşturulur ve uygun adlandırma şeması kullanılarak MaskFiles klasörüne yatırılır (aşağıda açıklanmıştır).</li>
	<li>Maske dosyalarının Maske Dosyaları listesini otomatik olarak doldurduğundan emin olun. Kullanıcı doğrudan analize geçebilir. NOT: Maske dosyalarını her zaman görsel olarak kontrol edin ve tüm ilgi çekici bölgeyi yakaladıklarını onaylayın. Veri dosyasının ve maske dosyasının ilk karesi seçildiğinde kullanıcı arabiriminde görüntülenir. (Şekil 2B). Maske Oluşturucu, düşük sinyalden gürültüye durumunda hatalar üretebilir, bu nedenle maske dosyalarının uygun olduğunu doğrulamak kalite kontrolü için kritik öneme sahiptir.</li>
	<li>Maske Oluşturucu'nun kullanımına alternatif olarak, görüntülerin gürültüsüne sinyal yetersizse, ImageJ'de maskeleri el ile oluşturun.<ol>
<li>İlk olarak, ham görüntü dosyasını ImageJ'de açın (Şekil 3A).</li>
		<li>Çokgen Seçimi düğmesini tıklatın ve hücrenin etrafına maske çizmek için tıklatın. Tamamlandığında, çokgeni tamamlamak için son noktayı çift tıklatın.</li>
		<li>Tamamlandığında, | Düzenle'ye gidin Seçim | Maske Oluştur (Şekil 3B). Çokgen çizime göre yeni bir ters maske oluşturulacaktır. Maskeleri seçili dizinde belirlenmiş bir MaskFiles klasörüne kaydedin. Maske dosyası adlandırma düzeni, "_mask_file" tarafından izlenen ilgili tek tek veri dosyalarıyla eşleşmelidir. Örneğin, bir veri dosyası "VAMP2_488_WT_1.tif" olarak adlandırılırsa, karşılık gelen maske dosyasının "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif" olarak adlandırılması gerekir.</li>
		<li>Yatırılan özel maske dosyalarının seçilen klasörüne gitmek için Maske Dosyalarını Bul düğmesini kullanın. Maskeler, Maske Dosyalarını liste olarak doldurur. NOT: Analizi çalıştırmadan önce her veri dosyası için bir maskeye sahip olmak önemlidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analiz ve özellik çıkarma
<ol><li>Dizin seçildikten ve Veri Dosyaları listesi ve Maske dosyaları listesi doldurulduktan sonra, Çözümleme düğmesini (Şekil 4A) tıklatın. Eksosit olayların sınıflandırılması gerekiyorsa, 5. NOT: Analiz düğmesi tıklatıldığında, verileri analiz etmek için bir dizi otomatik görev gerçekleştirilecektir. Analiz edilen verileri yatırmak için seçilen dizinde tek tek klasörler oluşturur. Çalışırken, "çalıştırma göstergesi" yeşilden sarıya değişecektir (Şekil 4A, kırmızı kutu). Analiz bittikten sonra, bu yeşile dönecektir.</li>
	<li>Her veri dosyasına göre adlandırılmış tam çözümleme dosyası kümesine (ayrıca daha sonra sınıflandırmada kullanılacak özellik ayıklama dosyaları) sahip bir DataFiles klasörü(Şekil 4B)bulun. NOT: Bu analiz dosyalarının açıklaması aşağıda Temsili Sonuçlar bölümünde yer almaktadır.</li>
</ol>5. Ekzosit olayların sınıflandırılması
<ol><li>Eksosit olayların otomatik algılama ile eşzamanlı sınıflandırmasını gerçekleştirmek için Analiz düğmesine tıklamadan önce Sınıflandırma onay kutusunu işaretleyin. Her eksosit olay için, her sınıf için 0-1 arasında bir olasılık puanı atayın. Eksosit olay, bu sınıfın olasılık puanı 0,5'> ise dört sınıftan biri olarak sınıflandırılır. NOT: Çözümleme tamamlandıktan sonra, seçilen dizinde yeni bir veri dosyası klasörü görünecektir. Klasör, her görüntü dosyasına karşılık gelen analiz dosyalarını içerir.</li>
</ol>6. Ripley'in K değerlerini kullanarak eksositozun mekansal analizi
<ol><li>Ayrı bir "neurite" ve "soma" maske dosyası oluşturun. İlk olarak, somayı neurite'den bölümlendir. Soma'yı nötroritlerden bölümlere ayırmak için tarafsız bir yöntem yoktur, bu nedenle kullanıcı şartlandırma deneyine kör edilmeli ve en iyi yargıyı kullanmalıdır; belirgin neurit uzantıları olmayan bir elipsoid önerilir.</li>
	<li>ImageJ/Fiji'yi açın.</li>
	<li>Maske dosyasını sürükleyip bırakın veya Dosya |'nı kullanın Maske dosyasını açın ve seçin.</li>
	<li>Renk seçici aracını kullanın ve rengi siyaha ayarlamak için maskenin arka planındaki siyah piksellerden herhangi birine tıklayın.</li>
	<li>Somanın etrafına bir anahat çizmek için çokgen seçim aracını veya serbest el kullanın, onu neurites'ten ayırın. Bu, manuel karar vermeyi gerektirir.</li>
	<li>| Düzenle'yi tıklatın Seçim | Maske Yap. Görüntünün geri kalanından daire içine alınmış soma ile yeni bir görüntü açılacaktır. Bu bir soma maske dosyası oluşturacaktır.</li>
	<li>Çizilen bölgeyi taşımadan, özgün maske dosyasının başlığını tıklatın.</li>
	<li>| Düzenle'yi tıklatın Daire içine alınmış somayı doldurmak için doldurun, böylece sadece neurites maske olarak kalır.</li>
	<li>Ayrı neurite ve maske dosyaları elde edildikten sonra, Her iki maske dosyasını da kaydedin. </li>
	<li>Matlab'da "neurite_2D_network" açın.</li>
	<li>MATLAB'da, tüm çözümleme verilerini içeren dizine gidin.</li>
	<li>"Maske adı" yolunu neurite maskesinin adıyla, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif" olarak değiştirin</li>
	<li>"csv_file_name" dosyasını fluorescent_traces.csv bulunduğu yere, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv" olarak değiştirin.</li>
	<li>Neurite maske dosyasını iskeletleştirmek için Çalıştır'ı tıklatın. Bu, neurite maske dosyasının iskeletleştirilmiş bir sürümünü oluşturur ve maskfiles klasörünün altına CSV dosyası olarak yatırır.</li>
	<li>Ardından, soma için bir CSV dosyası oluşturun. Matlab'da "CSV_mask_creator.m" açın.</li>
	<li>Soma maskesinin adına "maske adı" için yola koyun, yani "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Oluşturulacak "writematrix"i csv dosya adı olarak değiştirin, yani "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>Çalıştır 'ıtıklatın. Bu, yeni VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv dosyasını oluşturur.</li>
	<li>Her maske dosyası için 6.14'i yineleyin.</li>
</ol>7. RStudio kurulumu
<ol><li>Rstudio'yu açın ve ripleys_k_analysis açın. R dosyası.</li>
	<li>Araçlar |'ne giderek RStudio'ya "spatstat" paketini yükleyin Paketleri Yükle ve "spatstat" yazarak ardından Yükle 'yitıklatın. NOT: Bunun Rstudio Kurulumu başına yalnızca bir kez yapılması gerekir.</li>
	<li>Her oturumun başında kitaplık spatstat çalıştırın.</li>
	<li>Bu durumda iki ana değişkene dikkat edin: "neuron_mask" ve "neuron_datapoints." Nöron Maskesi, çalıştıracak maske dosyaları kümesine, yani soma maske dosyalarına işaret ediyor." NOT: Neurite maske dosyalarından ayrı olarak tüm soma maske dosyalarını birlikte çalıştırın ve bunun tersi de geçerli.</li>
	<li>Analiz edilecek nöronların her biri için maske dosyalarının .csv okuyun.</li>
	<li>Ek neuron_mask_n+1 kopyalayarak aynı anda birden çok dosya çalıştırın. Bu, bölüm 8'de açıklanan komut dosyasını kullanarak Ripley'in analizini bir araya getirmek için izin verecektir.</li>
	<li>Şimdi ikinci değişken olan "neuron_datapoints"ı kontrol edin.</li>
	<li>Okuma." X_fluorescent_traces.csv" dosyası analiz programı tarafından oluşturulan (tüm extracted_R dosya özelliklerine göre) ekzosit olayların x,y, t konumları ve 2D ağ için x,y konumlarının neurite özgü dosyası ile. Bu "neuron_datapoints" pozisyonuna geçer.</li>
	<li>RStudio'da Kod | Seç Bölge | Çalıştır Hepsini çalıştır. Bu, gruplanmış Ripley'in K değerlerinin yanı sıra yoğunluk çizimleri de dahil olmak üzere çeşitli çizimler oluşturur.</li>
	<li>Dışa Aktar |'ne giderek çizimleri kaydetme Görüntüyü | Olarak Kaydet Uygun görüntü biçimini ve dizini seçin ve uygun dosya adını girin, sonra Kaydet 'itıklatın. NOT: Isı eşlemleri için çizim işlevi komut dosyasında "plot(density(soma_data,0.4)" kullanılarak çağrılır. Buradaki "0,4" sayısı, yoğunluk işlevinin ne kadar yumuşatılmış olması gerektiğini temsil eder. Kullanıcı verilerine anlamlı bir şekilde uyacak şekilde değiştirilebilir, ancak farklı ısı eşlemleri arasında karşılaştırmalar yapılacaksa, sayı aralarında aynı olmalıdır.</li>
	<li>
Rstudio'dan görüntüyü dışa aktar veya kaydet. Isı haritası daha fazla düzenleme gerektiriyorsa, uygun bir dosya türü (SVG veya EPS) seçin.</li>
</ol>8. Ripley'in analizi
NOT: Ripleys_k_analysis. R dosyası ayrıca Ripley'in k değer çizimlerini otomatik olarak oluşturdu. Tüm komut dosyasını çalıştırmak aşağıda belirtilen işlevleri otomatik olarak çalıştırır, ancak komut dosyasının her bölümünü ayrı ayrı çalıştırmak veya çözümlemede değişiklik yapmak isterse ayrıntılı olarak dahil edilir.
<ol><li>İlk olarak, her hücre için zarf işlevini çalıştırın. Bu işlev, ekzosik olay noktası deseninin Ripley'in K değerini test etmek için tam uzamsal rastgeleliği (KSS) simüle etti. Data_envelope_1 = zarf(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = DOĞRU) Data_envelope_2 = zarf(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = DOĞRU)</li>
	<li>Ardından, bu zarfları bir araya getirin ve grup için bir KSS tahmini oluşturun: Pool_csr = havuz(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) Ardından, tüm veri noktaları için Ripley'in K işlevini çalıştırın. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, oran = DOĞRU) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, oran = DOĞRU)</li>
	<li>Tamamlandığında, Ripley'in K değerlerini bir araya toplayın ve güven aralıklarını aşağıdaki komutla önyükleyin: Veri havuzu = havuz(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrap aşağıdaki komutla: Final_Ripleys_K = varblock(eğlence = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Verileri çizin.</li>
	<li>Sabit istatistiksel bir fark gerekiyorsa, puan desenleri grupları arasındaki farkı test etmek için öğrencileştirilmiş permütasyon testi spatstat paketine dahil edilir: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ grup, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Yazarlar açıklayacak bir şey beyan etmezler.

Eksosit algılama ve analiz yazılımını kullanırken, lütfen programın yalnızca kayıpsız sıkıştırma .tif dosyalarını giriş olarak kabul ettiğini düşünün. .tif görüntü dosyaları 8 bit, 16 bit veya 32 bit gri tonlamalı (tek kanallı) görüntüler olabilir. Diğer görüntü biçimleri giriş öncesi bu türlerden birine dönüştürülmelidir. Başvuru için, burada kullanılan örnekler 16 bit gri tonlamalı görüntülerdir.
Otomatik algılama işleminin doğasında bulunan timelapse görüntü kümeleri, otomatik arka plan çık...

VAMP-pHluorin yapıları veya transferrin reseptörü (TfR)-pHuji yapıları, bu pH'a duyarlı floroforlar veziklin ve plazma zarı arasındaki füzyon gözenek açıklığı üzerine hemen asit veziklin lümeni ve floresan içinde söndürüldüğünden, ekzosit olayların mükemmel belirteçleridir1. Füzyon gözenek açıklığını takiben, floresan katlanarak bozunur ve füzyon olayı hakkında bilgi veren bazı heterojenlikler ortaya çıkardı. Burada, eksosit olayları otomatik olarak algılayan ve analiz eden bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) uygulaması açıklanmıştır. Bu uygulama, kullanıcının pH hassas işaretleyiciler2 tarafından ortaya çıkan ekzositik olayları otomatik olarak algılamasına ve sınıflandırma amacıyla kullanılabilecek her olaydan özellikler oluşturmasına izin verir3 (Şekil 1A). Ek olarak, Ripley'in K işlevi kullanılarak ekzosit olay kümeleme analizi açıklanmıştır.
Ekzosit olayların farklı ekzosit modlarına otomatik sınıflandırılması yakın zamanda bildirilmiştir3. İki eksositoz modu, tam vezikül füzyonu (FVF) ve öpücük ve çalıştırma füzyonu (KNR) eksositozu daha öncetanımlanmıştır 4,5,6,7. FVF sırasında füzyon gözenekleri genişler ve vesicle plazma zarına dahil edilir. KNR sırasında, füzyon gözenekleri geçici olarak açılır ve daha sonra 4 ,5,8,9,10'u yeniden kaydırır. Gelişen nöronlarda ikisi FVF, ikisi KNR ile ilgili olmak üzere dört eksositoz modu saptandı. Bu çalışma, hem FVF hem de KNR'nin füzyon gözenek açıklığı veya floresan çürümesi başlamadan önce füzyon gözenek açılmasından sonra gecikme gösteren eksosit olaylardan sonra floresan çürümesine (FVFi ve KNRi) hemen ilerleyen füzyon olaylarına daha da bölünebileceğini göstermektedir (FVFd ve KNRd) (Şekil 1B). Sınıflandırıcı, her füzyon olayı için eksositoz modunu tanımlar. Burada bu analiz, Windows ve Mac tabanlı işletim sistemlerinde MATLAB'a yüklenebilen bir GUI'ye dahil edilmiştir. Tüm analiz dosyaları https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing veya https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>R R</td><td>Çekirdek Ekibi</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

eksositozun otomatik tespiti ve analizi

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Vezikül SNARE proteinlerine bağlı pH'a duyarlı GFP (pHluorin) timelapse TIRF mikroskopisi, hücre kültüründe tek vezikül ekzosit olaylarını görselleştirmek için etkili bir yöntemdir. Bu tür olayların tarafsız, verimli bir şekilde tanımlanması ve analizini yapmak için MATLAB'da bilgisayar görüşüne dayalı bir yaklaşım geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Analiz ardışık düzeni bir hücre segmentasyonu ve eksosit olay tanımlama algoritması oluşur. Bilgisayarla görme yaklaşımı, floresan çürümesinin yarı ömrü ve ΔF/F zirvesi de dahil olmak üzere tek olayların birden fazla parametresini araştırmak için araçlar ve eksositoz sıklığının tam hücre analizi içerir. Bu ve diğer füzyon parametreleri, farklı füzyon modlarını ayırt etmek için bir sınıflandırma yaklaşımında kullanılır. Burada yeni oluşturulan bir GUI, analiz işlem hattını baştan sona gerçekleştirir. Ripley'in R Studio'daki K işlevinin daha fazla uyarlaması, hem uzay hem de zamandaki füzyon olaylarının kümelenmiş, dağılmış veya rastgele oluşumunu ayırt etmek için kullanılır.

Burada GUI (Şekil 2A) TIRF (total iç yansıma floresan) mikroskopisi kullanılarak 3 DIV'de nöronları ifade eden üç VAMP2-pHluorin ekzositik olayları analiz etmek için kullanılmıştır. E15.5 kortikal nöronlar izole edildi, ardından Winkle ve ark., 2016 ve Viesselmann ve ark., 2011 11,12'debelirtildiği gibi protokoller kullanılarak VAMP2-pHluorin ve kaplama ile transfeksiyon yapıldı. Görüntüleme parametrelerinin metodolojisi Urbina ve ar...

pH'a duyarlı floresan probların işaretlediği eksosit olayları tespit etmek için otomatik bilgisayar görme yazılımı geliştirdik. Burada, füzyon olaylarını tespit etmek, füzyonun mekansal parametrelerini analiz etmek ve görüntülemek ve olayları farklı füzyon modlarında sınıflandırmak için grafiksel bir kullanıcı arayüzü ve RStudio'nun kullanımını gösteriyoruz.

Eksositozun Otomatik Tespiti ve Analizi

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

Eksositoz Yazılımının Otomatik Algılayışı ve Analizi, kullanıcının pH'a duyarlı floroforların eksosit olaylarını ve TIRF görüntü dizilerini otomatik olarak algılamasını sağlayacaktır. Ayrıca, mekansal dağılım veya frekans gibi eksositozun özelliklerinin yanı sıra, arka plan üzerindeki yarı ömür veya floresan değişikliği gibi eksositotik olayların bireysel özelliklerini otomatik olarak çıkacaktır. Ek olarak, eksositozis olayları daha önce literatürde açıklanan dört eksositoz moduna sınıflandırmak için bir seçenek dahildir.Exocytosis yazılımının Otomatik Algılanmasını ve Analizini kullanmak için önce veri kümesini bul düğmesine tıklayacak ve verilerinizin nereye yatırıldığına gidecek ve ham veri adlı bir klasöre koymak isteyeceksiniz. Veri dosyalarınız listeyi burada otomatik olarak doldurur ve bu klasörde istediğiniz sayıda veri dosyası olabilir. Ardından, analiz dosyalarınızın yatırılacağı bir dizin seçmek isteyeceksiniz.Burada test adında bir dizin seçtim. Ayrıca, resimlerinizin kare hızını ve piksel boyutunu doldurmak isteyeceksiniz. Burada kare hızlarım kare başına yüz milisaniye, piksel boyutum sekiz nanometre.Son olarak, Exocytosis yazılımının Otomatik Algılanmasını ve Analizini çalıştırmak için maske dosyalarına ihtiyacınız olacaktır. Veri dosyalarınızdan otomatik olarak maske dosyaları oluşturmak için birlikte verilen maske üreticisi düğmesini kullanabilirsiniz. Maske üreticisinin çalışması tamamlandığında çalışma göstergesi sarıya döner ve sonra yeşile döner.Maskeniz, seçtiğiniz dizindeki maske dosyaları adlı yeni bir klasöre yatırılır. Ve unutmayın, maske dosyaları listeyi otomatik olarak burada doldurur. Maske dosyalarınızın veri dosyalarınız için uygun şekilde yapıldığını kontrol etmek isteyeceksiniz ve bunu listedeki veri dosyalarından herhangi birini ve ilgili maske dosyasını vurgulayarak yapabilirsiniz.Veri dosyanızın ilk karesi ve seçilen maske dosyası da görünecektir. Burada. Maske dosyalarımızın eldeki analiz için uygun olduğunu görebiliyoruz. Maske dosyaları kullanıcı tarafından ayrı olarak da sağlanabilir.Geçerli bir veri dosyasından maske dosyası yapmak istediğinizde, bunu yapmak için Image J.In kullanmanızı öneririz, önce maske dosyası yapmak istediğiniz görüntüyü Image J'de açın. Daha sonra hücrenin kenarını tıklatarak etrafta bir maske dosyası oluşturmaya başlamak için çokgen seçim aracını kullanabilirsiniz. Maskenizi tamamladığınızda, çokgenin tamamına bağlanmak için çift tıklatın.Bu tamamlandıktan sonra, düzenlemeye, seçmeye ve maske oluşturmaya başlayacaksınız. Ters çevrilmiş bir maske oluşturulacak. Bu maske dosyasını, veri dosyasıyla aynı adı kullanarak ve ardından _mask_file.Şimdi, kendi özel maske dosyalarınızı sağlarsanız, otomatik algılama yazılımının bu maske dosyalarının nerede olduğunu bilmesini sağlamak önemlidir. Bunu yapmak için maske dosyalarını bul düğmesini tıklatacak ve içinde maske dosyalarınız olan dizine gideceksiniz. Yeni maske dosyaları daha sonra listeyi burada doldurur.Çözümleme çalıştırılmadan önce her bir veri dosyası için bir maskeniz olması önemlidir. Şimdi, veri kümenizi yükledikten, maske dosyalarınızı, kare hızınızı ve piksel boyutunuzu doğru ayarladıktan ve seçilen bir dizini yükledikten sonra, analizinizin bir parçası olarak sınıflandırma eklemek isteyip istemediğinize sonunda karar verebilirsiniz. Sınıflandırma düğmesini değiştirdiğinizde, eksosit olayları algılamanın yanı sıra, her eksosit olay dört sınıftan birinde sınıflandırılır.Analizinizin nasıl yürütülebileceğine karar verdikten sonra, analiz düğmesine tıklayarak analize başlayabilirsiniz. Çalıştırma göstergesi, analizin devam ettiğini belirtmek için sarıya döner ve analiziniz tamamlandığında yeşile döner. Analiz tamamlandıktan sonra, çalışma göstergenizin sarıdan yeşile değişmesiyle belirtildiği gibi, seçtiğiniz dizinde yeni bir veri dosyaları klasörünün göründüğünü fark edeceksiniz.Veri dosyaları klasöründe, analiz çalıştırmanızda ayarlanan her görüntüye karşılık gelen analiz dosyalarını bulacaksınız. Ek olarak, görüntü kümelerinin her biri için eksositoz sıklığı gibi özet bilgileri içeren bir hücre istatistik dosyası buradadır. Her görüntü kümesi için, dış olayların meydana geldiği yer için X konumu, Y konumu ve çerçeve numarası hakkında bilgi içeren bir floresan izleme dosyanız vardır.Ek olarak, her eksositoz olayının etrafındaki ilgi çekici bir bölgedeki ortalama floresan hem eksositoz öncesi, hem de sırasında ve sonrasında sunulur. Buna ek olarak, X, Y ve zamansal pozisyonların benzer bilgilerini içeren bir izleme dosyası da vardır. Ancak, sınıflandırma onay kutusu işaretlenirse, ayrıca, dört sınıftan birine ait eksosit olayının olasılığını gösteren dört ek sütun olacaktır.Ya tam vesicle füzyonu anlık, tam vezikli füzyon gecikmeli, öp ve çalıştır anında ya da öp ve koş gecikmeli. Eksosit olay, 0,5'ten büyükse ve yönetilen dört sınıf içindeki en yüksek olasılıksa, dört sınıftan birine aittir. Bu durumda, buradaki ilk ekzositik olay, dört sınıfın üzerindeki en yüksek sayı olduğu ve 0,5'ten büyük olduğu için tam vesicle fusion instantaneous sınıfına aittir.Ek olarak, her görüntü seti için eksositoz sınıflandırması sırasında kullanılan ve daha fazla analiz için ilgi çekici olabilecek bir dizi başka özellik dosyası vardır. Son olarak, eksositozun mekansal-zamansal organizasyonunu tespit etmek için Ripley'in K analizini kullanmak istiyorsak, ilk olarak maske dosyamızı neurite bir maske dosyasına ve soma maske dosyasına bölerek başlayacağız. Bunu ilk olarak Image J.'de maskemizi açarak yapacağız Bir arka plan pikseli seçmek için renk seçiciyi kullanmak isteyeceğiz.Ve bu şekilde, maske dosyasını doldurduğunuzda, doğru değerdir. Daha sonra çokgen seçim aracını kullanacağız ve somatik bölgeyi özetleyeceğiz. Şimdi bu biraz öznel, manuel karar verme gerektiriyor.Kaba bir elipsoid öneriyoruz. Bunu tamamladıktan sonra düzenlemeye, seçmeye ve maske oluşturmaya gideceksiniz. Son olarak, orijinal maske dosyamıza geri gelecek ve soma doldurmak için düzenleme ve doldurmayı kullanacaksınız ve şimdi daha sonra kaydedeceğiniz ayrı bir neurite ve soma maske dosyamız var.Ayrı neurite ve soma maske dosyanızı kaydettikten sonra, burada, neurite için maske dosyası alt çizgi neur olarak var ve soma'nın altını çiziyor, MATLAB'a geleceğiz ve neurite 2D ağ MATLAB dosyasını açacağız. Burada, mevcut klasörde tüm analiz verilerimizi yatırdığımız dizine yönlendireceğiz. Bunu yaptıktan sonra, maske adı yolunu neurite olan yeni maske dosyamıza değiştirmiş olacağız.Bu durumda, maske dosyaları klasörünün altında neurite maske dosyam var. Daha sonra CSV dosya adını floresan izleme dosyamızın bulunduğu yere değiştireceğiz. Bu durumda, hala veri dosyaları klasöründedir ve bu nedenle veri dosyaları eğik çizgi ve floresan adı CSV dosyasını izler.Bu tamamlandıktan sonra, çalıştır tuşuna basabilirsiniz. Bu daha sonra neurite maske dosyasının iskeletleştirilmiş bir sürümünü oluşturacak ve burada görebildiğimiz maske dosyaları klasörünün altına bir CSV dosyası olarak yatıracaktır. Daha sonra soma için de bir CSV dosyası oluşturacağız.Bunu yapmak için CSV maske oluşturucu dosyasını açın. Soma maskeniz ve oluşturulacak CSV dosyası için bir ad için yola koymak isteyeceksiniz. Burada sadece devam ettim ve aynı dosya adını kullandım, sadece nokta CSV eklenmiş olarak.Çalıştır'a bastığınızda, neurite ile birlikte yeni bir soma CSV dosyasının oluşturulduğunu göreceksiniz. Hem neurite maskesi hem de soma maskesi için CSV dosyalarını oluşturduktan sonra Ripley'in K analizini yapabiliriz. Bunu yapmak için R Studio'ya gideceğiz ve Ripley'in K analiz R dosyasını açacağız.Burada dikkat etmesi gereken iki ana değişken vardır: nöron maskesi ve nöron veri noktaları. Nöron maskesi, çalıştırmak istediğiniz maske dosyalarını gösterecektir. Bu durumda, ilk olarak soma maske dosyalarını çalıştırıyorum.Tüm soma maske dosyalarınızı tüm neurite maske dosyalarınızdan ayrı olarak çalıştırmak isteyeceksiniz. Burada, bu analiz için kullan olacağım iki nöron var. Ancak, Ripley'in K analizi için istediğiniz kadar kullanabilirsiniz, sadece nöron maskesi için bu kodu kopyalayıp yapıştırmak ve değişkeni üçe ve ileriye doğru değiştirmek isteyeceksiniz.İkinci değişken nöron veri noktalarıdır. Burada, tüm ayıklanmış R dosyanızın özellikleri tarafından oluşturulan dosyaya işaret etmek istiyorsunuz. Şimdi benimkine füzyon istatistikleri adı verildi.Belirtildiği gibi, ripley'in K'sını bir araya getirebilmemiz için birlikte analiz edilen ikinci bir soma maske dosyam ve nöronum var. Bu yolları doğru yol olarak değiştirdikten sonra, kod kullanacak, bölgeyi çalıştıracak ve tüm yolları çalıştıracaksınız. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, gruplanmış Ripley'in K değerlerinin yanı sıra yoğunluk çizimleri de dahil olmak üzere çeşitli çizimler oluşturulacaktır.Bunlar dışa aktarmaya giderek, görüntüyü farklı kaydederek ve uygun görüntü biçimini, dizini, dosya adını seçerek ve son olarak kaydet tuşuna basarak kaydedilebilir. Burada, TIRF mikroskopisi kullanılarak iki günlük in vitro olarak görüntülenmiş flora havalandırmayı ifade eden 12 murine kortikal nörondan temsili sonuçlar görüyoruz. A'da eksositoz sıklığını sınıfa göre ikiye böldüğünü görüyoruz.Burada tam vesicle füzyon an öncesinin diğer sınıflara göre daha sık meydana geldiğini görebiliriz. B'de, tam vezne füzyonunun tüm olayların yarısından fazlasını oluşturan modun dağılımını görebiliriz. C'de eksositozun mekansal dağılımını bir ısı haritası olarak belirleriz.Ekzosit olayların çoğunun soma yakınlarındaki bir sıcak noktada ve nötrotların distal uçlarında kümelendiğini görebiliriz. D'de eksosit olayların istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde kümelendiğini ve bu kümelerin boyutunun yarım mikrondan bir mikrona kadar değiştiğini belirleyebiliriz. Eksosit olayları tarafsız bir şekilde doğru bir şekilde tanımlamak ve analiz etmek için otomatik bir analiz programının kullanılması analiz verimliliğini arttırır ve tekrarlanabilirliği ve titizliği artırır.Algılamanın doğruluğunu sağlamak için, görüntüleme sırasında gürültüye karşı yüksek bir sinyal sağlamak önemlidir. Eksosit olayları veya diğer pH'a duyarlı geçici olayları yakalamak, tüm olayları yakalamak ve floresandaki yarı ömür veya tepe değişimi gibi tahminleri iyileştirmek için yeterince hızlı bir görüntüleme frekansı gerektirir. Bu programın sadece gelişmekte olan nöronlarda pH'a duyarlı floresan yakalamak için değil, aynı zamanda diğer hücre tiplerinde de işe yaradığını gösterdik.Ancak, başka bir hücre türü kullanıyorsanız, diğer hücre türlerindeki geçici olayların farklı davranışları nedeniyle doğruluk farklılıklarını kontrol etmek önemlidir. Bu sınıflandırma bugüne kadar sadece nöronların geliştirilmesinde kullanılmıştır. Ve gerçekten de bu süreçlerin diğer hücre tiplerinde veya nöronlarda daha sonraki gelişimsel zaman noktalarında var olduğunu bilmiyoruz.

automated-detection-and-analysis-of-exocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, mast hücrelerinde ekzositozu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. Hücreler, asidik pH'ın floresansını söndürdüğü salgı granülleri (SG'ler) içindeki hücreler tarafından alınan bir floresan raportör olan FITC-dekstran ile inkübe edilir. Granül ekzositozunun uyarılması üzerine, ortamın daha yüksek pH'ı, bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilen kaynaşmış SG'lerin içinde raportör floresansını indükler.

Mast Hücrelerinde Salgı Granüllerinin Ekzositozunu Görselleştirmek için İn Vitro Bir Teknik

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Pek çok farklı yöntem akış sitometrik (FCM) ile hücre dışı veziküller (EVS) ölçülmesi için vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Ölçüm EVs için iki protokoller bireysel algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Sinaptik vezikül endositoz sinaptik vezikül protein ile erimiş pHluorin ışık mikroskobu ve elektron mikroskobu vezikül Alım tarafından algılanır.

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

Ozmotik stres ekzositozu ve bu işlem sırasında serbest nörotransmitter miktarını etkiler. Biz nasıl transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte elektrokimyasal yöntemleri birleştirerek ekstraselüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu etkinlik, vezikül quantal boyut ve serbest nörotransmitter miktarı incelemek için kullanılabileceğini göstermek ekzositozu sırasında.

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Burada biz ayrıntılı olarak düzenlenmiş ekzositozu canlı hücre görüntüleme için bir yöntem. Bu yöntem lysosome ilgili organelleri içinde birikir, FITC-dextran muhabir olarak kullanır. Bu basit yöntem aynı zamanda genetik olarak işlemek zor olan hücrelerdeki düzenlenmiş ekzositozu farklı modları arasında ayrım sağlar.

Düzenlenmiş ekzositozu için muhabir olarak FITC dextran görüntüleme

Efferocytosis, apoptotik hücreler, fagositik kaldırılması homeostazı korumak için gerekli ve reseptörleri ve tanıma, engulfment ve apoptotik hücreler içselleştirilmesi için izin sinyal yollar tarafından yönetilir. Burada, biz efferocytosis miktar ve efferocytic sinyal yolları etkinlik için bir floresans mikroskobu Protokolü mevcut.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.

Mikro Desenli Hücrelerde Hücresel Eksositozun Spatiotemporal Parametrelerinin Ölçülmesi

Bu protokol, C. elegans hücreleri tarafından membrana bağlı ekophers şeklinde üretilen büyük agrega ve/veya organel ekstrüzyonların (~4 μm) tespiti ve niceliği için yaklaşımları açıklamaktadır. Bu enkaz kovma mekanizmasının diseksiyonunu kolaylaştırmak için gerekli suşları, büyüme koşullarını, puanlama kriterlerini, zamanlamayı ve mikroskopi hususlarını tanımlıyoruz.

C. elegans'ta Büyük Ekofher Veziküllerde İnvivo Nöronal Agrega ve Organel Ekstrüzyon Puanlama da Kantitatif Yaklaşımlar

Keşfedin, MATLAB tabanlı otomatik yazılım ile TIRF mikroskobisi görüntülerinde eksositik olayları tespit ve sınıflandırma yöntemini. Bu hesaplamalı yaklaşım, nörobiyoloji araştırmalarında verimliliği ve tekrarlanabilirliği artırır.

Eksositozun Otomatik Tespiti ve Analizi

Daha fazla video keşfet