Name: Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Keşfedin, yetişkin insan astrosit çekirdeklerini FANS kullanarak taze dondurulmuş korteksten izole etme yöntemini. Bu protokol, transkriptomik ve kromatin erişilebilirlik analizleri için yüksek saflıkta hücre popülasyonları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki Patoloji ve Nöroşirürji üyelerine, tanımlanmamış beyin dokusunun ve uzman tavsiyesi için ISMMS'nin Akış Sitometrisi CORE'unun tedarikinde yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Çalışma kısmen NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.'ye) ve R61DA048207 (SA'ya) tarafından finanse edildi.

NOT: Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'ndeki (ISMMS) İnsan Deneklerin Korunması Programı ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB), araştırmanın etik olarak yürütülmesini ve federal, eyalet ve kurumsal düzenlemelere uyumu garanti eder. Bu çalışmada, kullanılan tüm ölüm sonrası örnekler kimliksizleştirilmiş, biyodepo yoluyla uygun rıza altında elde edilmiş ve ISMMS'nin IRB'si (HS # 14-01007) tarafından "insan araştırması" tanımından muaf tutulmuştur.
1. Tampon hazırlama
NOT: Aşağı akış RNA dizilimi gerçekleştiriyorsanız, mRNA bozulmasını önlemek için tüm çalışma alanlarını ve aletleri RNaz Dekontaminasyon Çözeltisi ile iyice işleyin.
<ol><li>Lizis tamponu hazırlayın.<ol>
<li>Aşağıdakileri damıtılmış H 2 O'da50 mL'ye kadar çözün: 5,47 g sakkaroz (0,32 M final), 250 μL 1 M CaCl 2 (5 mM final), 150 μL 1 M Mg (CH 3 COO)2 (3mM final), 10 μL 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (0,1 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 50 μL Triton X-100 (%0,1 nihai) ve 17 μL 3 M ditiyotreitol (DTT, 1 mM final, taze ekleyin) (bkz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sakkaroz tamponu hazırlayın<ol>
<li>Aşağıdakileri damıtılmış H 2 O'da50 mL'ye kadar çözün: 30,78 g sakkaroz (1,8 M final), 150 μL 1 M Mg (CH 3 COO)2 (3 mM final), 500 μL 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL3M DTT (1 mM final, taze ekleyin).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dondurulmuş dokunun tek çekirdekli süspansiyona ayrışması
<ol><li>7 mL'lik bir cam doku sıçramacısına (öğütücü) 4 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde tutun. Yaklaşık 200-400 mg taze dondurulmuş insan yetişkin korteksi diseksiyonu, yaklaşık 50x sıçraması ve doku homojenatını 12 mL ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın.</li>
	<li>5 mL'lik bir pipet kullanarak, ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mL buz gibi soğuk sakkaroz tamponu ekleyin ve sakkaroz ile doku homojenatı arasındaki tabakayı bozmamaya özen gösterin. NOT: Ek numuneler işleniyorsa, daha hafif numuneye ilave lizis tamponu ekleyerek tüpleri ağırlığa göre dikkatlice dengeleyin. Ultra santrifüj tüplerinin hassas bir şekilde dengelenmesi, rotorun zarar görmesini önlemek ve uygun hızda dönmeyi sağlamak için çok önemlidir.</li>
</ol>3. Ultrasantrifüjleme
<ol><li>Lisatı 4 °C'de 1 saat boyunca 24.400 rpm'de (101.814 × g) ultrasantrifüj yapın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatant ve kalıntıları dikkatlice aspire edin. NOT: 200 mg'dan az doku ile başlandığında pelet görünmeyebilir.</li>
	<li>Çekirdek peletine 600 μL fosfat tamponlu salin (PBS) (Ca2+, Mg2+ serbest) ekleyin ve yeniden askıya almadan önce 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Buz üzerindeki çekirdek peletini yeniden askıya almak için pipeti 50 kez yukarı ve aşağı doğru çekin.</li>
	<li>Bozulmamış çekirdekleri mikroskop altında görselleştirmek ve bir sonraki adıma geçmeden önce ressüspansiyonun konsantrasyonunun 105 çekirdek / mL'nin üzerinde olmasını sağlamak için bir hemositometre kullanın (yeniden askıya alınan çekirdeklerin 10 μL'sini 10 μL tripan mavisi ile birleştirin).</li>
</ol>4. Antikor inkübasyonu
<ol><li>FANS için numuneyi immünoetiketlemek için, yeniden askıya alınmış numune peletinin 500 μL'sini, 490 μL 1x PBS (Ca2+, Mg2+ serbest), 10 μL % 10 BSA (% 0.1 nihai), AF555'e konjuge edilmiş 1 μL fare anti-NeuN antikoru (NeuN-AF555, 1:1000 son konsantrasyon) ve allofikoksiyanine konjuge edilmiş 1 μL fare anti-PAX6 antikoru (PAX6-APC, 1:1000 nihai konsantrasyon) ekleyin. NOT: Diğer floroforlara konjuge alternatif antikorlar eklenebilir (tartışmaya bakınız). Burada, AF488'e (1:1000 konsantrasyon) konjuge edilmiş fare anti-OLIG2 olumlu sonuçlarla kullanıldı.</li>
	<li>Gerektiğinde numunenin az bir miktarını kullanarak geçit parametrelerini ayarlamak için 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) yalnızca ve tek renkli kontroller gerçekleştirin.<ol>
<li>AF555 tek renk kontrolünü gerçekleştirmek için, 20 μL yeniden askıya alınmış numune peleti, 970 μL 1x PBS (Ca 2+, Mg2+ içermez), 10 μL% 10 BSA (% 0.1 nihai) ve 1 μL NeuN-AF555 antikoru (1:1000 konsantrasyon) ekleyin.</li>
		<li>APC tek renk kontrolünü gerçekleştirmek için, 20 μL yeniden askıya alınmış numune peleti, 970 μL 1X PBS (Ca2+, Mg2+ içermeyen), 10 μL% 10 BSA (% 0.1 nihai) ve 1 μL PAX6-APC antikoru (1:1000 konsantrasyon) ekleyin.</li>
		<li>Yalnızca DAPI kontrolü gerçekleştirmek için, yeniden askıya alınan numune peletinin 20 μL'sini, 970 μL'sini 1X PBS'yi (Ca2+, Mg2+ içermeyen) ve 10 μL'sini %10 BSA'yı (%0,1 nihai) ekleyin (DAPI daha sonra eklenecektir, bkz. 4,4). NOT: İkiden fazla antikor kullanılıyorsa, tek renkli kontrollere ek olarak floresan-eksi-bir (FMO) kontrolünün yapılması önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numuneleri ve kontrolleri karanlıkta 4 °C'de 1 saat boyunca dönerek inkübe edin.</li>
	<li>Tüm örneklere ve denetimlere 1:1000'de DAPI ekleyin ve sıralamaya devam edin.</li>
</ol>5. Floresan ile aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS)
NOT: Akış sitometrisi/ayıklama tekniklerinde zaten yetkin olmadıkça, eğitimli personelin yardımıyla kurumsal bir akış sitometrisi tesisinin kullanılması önerilir.
<ol><li>Kapı aşağıda gösterildiği gibi.<ol>
<li>İlk önce ve her numune için, ileri saçılma (FSC-A) ve karşı kapı yan saçılma (SSC-A), çekirdekler için uygun boyut aralığındaki parçacıkları içerecek şekilde dahil eder, böylece kırmızı kan hücrelerini ve kalıntıları hariç tutar (Şekil 1A). NOT: Çok temiz bir çekirdek preparatı, daha küçük bir enkaz kümesi ile bir çekirdek kümesi arasında ayrım yapabilir.</li>
		<li>Daha sonra ve her numune için, FSC-A ile FSC-W (veya FSC-A ile FSC-H) ve SSC-A ile SSC-W (veya SSC-A ile SSC-H) arasındaki kapı, yalnızca singlet çekirdekleri içerecek şekilde (Şekil 1B).</li>
		<li>Daha sonra ve her örnek için, DAPI tarafından kapı, enkaz (DAPI-düşük, kapılı popülasyonun solunda) ve çiftler (kapılı popülasyonun sağında) hariç olmak üzere bozulmamış çekirdek teklilerini (DAPI-yüksek kapılı popülasyon) içerecek şekilde kapıdır (Şekil 1C).</li>
		<li>FACS grafiklerinde görsel olarak ayrı kümeler olarak belirlenen floresan kontrollerine dayalı olarak daha fazla geçit ayarlayın.<ol>
<li>Antikor yokluğunda popülasyonların arka plan boyamasını belirlemek için yalnızca DAPI kontrolünü çalıştırın (Şekil 1D ve Şekil 2A).</li>
			<li>AF555 kanalındaki NeuN+ boyama için kesintiyi belirlemek üzere yalnızca NeuN-AF555 kontrolünü çalıştırın (Şekil 2B).</li>
			<li>APC kanalında PAX6+ boyama için kesiği belirlemek üzere yalnızca PAX6-APC kontrolünü çalıştırın (Şekil 2C).</li>
			<li>Daha fazla antikor kullanıyorsanız ek tek renkli kontroller çalıştırın (Şekil 2D, E). NOT: İkiden fazla antikor kullanılıyorsa, popülasyonlardaki herhangi bir kaymayı görselleştirmek için bir FMO kontrolü önerilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tüm kontroller çalıştırıldıktan sonra, NeuN+ ve PAX6+ koleksiyonları için kapıları belirlenen eşiklerin üzerine çizin.<ol>
<li>Nöronları toplamak için NeuN + popülasyonunu kapatın (Şekil 1E ve Şekil 2F).</li>
			<li>Astrositleri toplamak için NeuN popülasyonundan PAX6+ popülasyonunu kapatın (Şekil 1E, F ve Şekil 2F).</li>
			<li>NeuN-PAX6- popülasyonundan ek glial popülasyonları (burada OLIG2 + tarafından gösterildiği gibi oligodendrosit progenitör hücreleri gibi) kapılayın ve toplayın (Şekil 1F). NOT: Belirsiz popülasyonlar nedeniyle akış sitometrisi yazılımı ile uygun geçit kesiklerinin belirlenmesinin zor olması durumunda, görselleştirilen olayların sayısını değiştirmek yararlı olabilir (FANS grafiğindeki olay sayısını artırmak veya azaltmak).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amaçlanan aşağı akış analizine dayalı olarak örnekleri uygun şekilde toplayın.</li>
</ol>6. Aşağı akış moleküler analizleri için FANS popülasyonlarının toplanması
<ol><li>Toplu RNA dizilimi için, PBS'de 50.000-500.000 çekirdek toplayın (ayrıca bakınız bölüm 7.1).<ol>
<li>2 mL sakkaroz çözeltisi, 50 μL 1 M CaCl 2 ve 30 μL 1 M Mg (CH3COO)2 ekleyin ve 10 mL'ye kadar PBS ile doldurun.</li>
		<li>15 dakika boyunca buz üzerinde ters çevirin ve inkübe edin, ardından 4 ° C'de 10-15 dakika boyunca 900 × g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin, 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifinde yeniden askıya alın, girdap, kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, örnekleri doğrudan RNA ekstraksiyon reaktifinin 200 μL'sine toplayın. RNA ekstraksiyon reaktifini sıralamadan sonra 1 mL'ye kadar ekleyin ve reaktifin sıralanmış numuneye 1: 1 oranını koruyun. Girdap, kuru buz üzerinde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dizileme (ATAC-seq) kullanılarak transpozaz erişimli kromatin için toplu tahlil için,% 5 sığır serum albümini (BSA) ile kaplanmış bir mikrosantrifüj tüpünde PBS'de 50.000-75.000 çekirdek toplayın. Çekirdekleri kuru buz/-80 °C üzerinde dondurun veya hemen ATAC hazırlığı için kullanın.</li>
	<li>Sn RNA-seq veya ATAC-seq için, PBS'de% 0.04 BSA'da çekirdek toplayın (ayrıca bakınız bölüm 7.2).</li>
</ol>7. Kütüphane öncesi hazırlık ipuçları
<ol><li>Toplu nükleer RNA dizileme kütüphanesi hazırlığı<ol>
<li>RNA ekstraksiyon reaktifinde toplandıktan sonra, fenol / kloroform ekleyerek ve RNA'yı üst sulu tabakadan etanol ile çökelterek, ardından tüp üzerinde DNaz sindirimi (15 dakika) ile standart fenol / kloroform RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.</li>
		<li>RNA temizliği yapın ve son 15 μL su hacminde konsantre olun. NOT: Bu yöntemi kullanarak, 300 mg yetişkin korteks örneğinden temsili geri kazanım, ~ 300.000 NeuN + çekirdeği (temizleme ve konsantrasyondan sonra 15-20 ng / μL toplam RNA) ve ~ 250.000 PAX6 + çekirdeğidir (temizleme ve konsantrasyondan sonra 10-12 ng / μL toplam RNA). Bu temsili verim, numune kalitesine, geçit sıkılığına ve RNA geri kazanımına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir.</li>
		<li>Kanonik astrosit belirteçlerinin (GFAP, SOX9), 10-formiltetrahidrofolat dehidrogenaz (ALDH1L1)) ve nöronal ve diğer hücre soy belirteçlerinin tükenmesine (Şekil 1G) yüksek diferansiyel ekspresyonuna dayanan astrositlerin zenginleştirilmesini doğrulamak için dizilemeden önce kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) gerçekleştirin. NOT: Çift negatif popülasyonun (NeuN-PAX6-) toplanması, astrositlerin göreceli zenginleşmesi için daha doğru, çok katmanlı bir qPCR kalite kontrol analizine izin verir (Şekil 2H).</li>
		<li>Postmortem örneklerden beklendiği gibi, düşük RNA bütünlük sayısı değerleri için önerilen bir kit kullanarak RNA-seq kütüphaneleri oluşturun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek çekirdekli dizileme kütüphanesi hazırlama<ol>
<li>Kurumsal bir sıralama çekirdeği aracılığıyla sn sıralama gerçekleştirin.</li>
		<li>Nanoakışkan bazlı işleme ve dizileme için, önerilen konsantrasyonu 1 × 106 hücre/mL en az 60 μL 1x PBS + %0,04 BSA tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq) için ve sıralama (snATAC-seq) kullanılarak Transpozaz Erişilebilir Kromatin için tek çekirdekli Tahlil için en az 20 μL 1x PBS + %0,04 BSA'da 3 × 106 hücre/mL kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914(2008).</li>
<li>Tome-Garcia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+isolation+and+transcriptomic+profiling+informs+glial+pathology+in+human+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+progenitor+and+mature+human+astrocytes+reveals+transcriptional+and+functional+differences+with+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse.</a> Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+Is+an+astrocyte-specific+nuclear+marker+in+the+adult+brain+outside+the+neurogenic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).</li>
<li>Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70(2015).</li>
<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Özetlenen protokolü takip eden deneysel tasarım, çeşitli biyolojik ve teknik faktörler göz önünde bulundurularak sonuçlandırılmalıdır. Başlangıç doku örnekleri, sabitlenmeden taze dondurulur ve tercihen çekirdek iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için kısa bir postmortem toplama aralığına sahiptir. Deneyime dayanarak, 24 saate kadar bir PMI, yeterli çekirdek geri kazanımına izin verir; Bununla birlikte, bozulmamış çekirdek geri kazanımını optimize etmek için 12 saat veya daha düşük bir PMI tercih edilir. PMI dışında, vü...

İnsan astrositlerinin moleküler karmaşıklığı, birincil dokuda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve hem sağlıkta hem de hastalıkta yüksek çözünürlükte izolasyonları ve karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Bozulmamış insan nöronlarının ve glia'nın nişlerinden ayrılmasının, taze beyin dokusu örneklerinin sınırlı erişimi, glial ve nöronal süreçlerin yoğun bir şekilde birbirine bağlı doğası ve işleme sırasında kaçınılmaz hücresel aktivasyon nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır; bunların hepsi bu hücre tiplerinin moleküler karakterizasyonunu ex vivo1 . Floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS), canlı hücre sıralamaya alternatif olarak ortaya çıkmış ve çekirdek popülasyonlarının donmuş dokudan ayrışmasını ve immün etiketlemesini sağlamıştır. Son on yılda, FANS, çeşitli beyin örneklerinde ve anatomik bölgelerdeinsan nöronal (NeuN +) çekirdek popülasyonlarını izole etmek ve moleküler olarak karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3,4.
Bununla birlikte, spesifik glial çekirdek alt popülasyonlarını insan korteksinden izole etmek için benzer yöntemler sınırlandırılmış ve hem normal hem de hastalıklı dokularda astrosit karmaşıklığının anlaşılmasında göreceli bir karmaşıklık eksikliğine yol açmıştır. Bu amaçla, FANS4 kullanarak insan nöronal popülasyonlarını izole etmek için daha önce yayınlanmış bir protokol uyarlandı ve üçlü bir antikor kombinasyonu kullanarak astrositler (ve oligodendroglial progenitörler) için zenginleştirmek için bir yöntem doğrulandı ve astrositleri hem dinlenme hem de reaktif koşullarda yakaladı5. NeuN fraksiyonundaki astrositler için spesifik olarak zenginleştirmek için, antikorlar astrosit popülasyonları arasında farklı olarak eksprese edildiği bilinen iki transkripsiyon faktöründen birine karşı kullanıldı, PAX6 veya SRY-box transkripsiyon faktörü 9 (SOX9)6,7. PAX6, germinal bölgelerdeki radyal glia benzeri progenitörlerde erken fetal gelişim sırasında yüksek oranda eksprese edilir ve hem nörogenez hem de gliogenez 8,9,10,11'e ve retinal nöronal spesifikasyona katkıda bulunur 12. Yetişkinlerde, PAX6, istirahat eden insan astrositlerinde6 farklı şekilde aşırı eksprese edilir ve insan epilepsi dokusu astrositlerinde glial fibriler asidik protein (GFAP) ile protein birlikte ekspresyonu gösterir13.
Bu protokol, neokortikal nöronal ve astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının FANS tarafından eşzamanlı izolasyonunu tanımlar. Yetişkin korteksten toplanan taze (sabitlenmemiş) çıtçıtlı dondurulmuş (yani, taze-dondurulmuş) postmortem doku ilk önce mekanik ve kimyasal olarak ayrışır. Bir sakkaroz gradyanında lizis ve ultrasantrifüjlemeden sonra, çekirdekler korunurken sitoplazmik ve hücre dışı bileşenler atılır. Çekirdekler daha sonra istenen hedef soylara karşılık gelen floresan konjuge nükleer antikorlarla etiketlenir ve FANS kullanılarak sıralanır. Bu yaklaşımı takiben, astrositlerin zenginleştirilmesi, toplanan PAX6 + NeuN- popülasyonlarında, hem hedeflenen bir qPCR paneli hem de aşağı akış nükleer RNA dizilimi ile doğrulanarak gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>İnvitrojen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>ANTİ-NEUN ANTİKOR KLONU A60</td> Bir <td></td><td>floresan bileşiği AF555'e konjuge fare anti-NeuN MAB377A5MI milipore (uyarma, 553 nm; emisyon, 568 nm)</td><td></td></tr><tr><td>ANTİ-OLIG2 ANTİKOR KLONU 211</td><td>Milipor</td><td>MABN50A4MI</td><td>fare anti-OLIG2, bir floresan bileşiği AF488'e konjuge (uyarma, 499 nm; emisyon, 520 nm)</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümin</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Çizgi Sayma Odası</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür Susuz</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeçleri, 40 & M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol, Dihidroklorür)</td> <td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Kütüphane Kiti</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121 ve ndash; 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Doku Öğütücü</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sıralayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Magnezyum Asetat Tetrahidrat</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TEST</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Temiz & Konsantratör</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dekontaminasyon Solüsyonu</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Örgülü Toplam RNA-Sıralama Kiti Pico Girişli Memeli</td><td>Clontech Laboratuvarları</td><td>635005</td><td>Düşük RIN RNA değerleri için önerildiği gibi 2,5 dakikalık parçalanma süresi.</td></tr><tr><td>Sükroz, kristal sertifikalı, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Sallanan Kovalı Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M Çözelti, pH 8.0, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Ultra Saf</td><td>Termo Bilimsel</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>lizis tamponunda iyonik olmayan yüzey aktif madde</td></tr><tr><td>TRIzol LS Reaktifi</td><td>İnvitrojen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td> RNA Tripan Mavi Çözeltisinin izolasyonu için <td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>reaktifi</td></tr><tr><td>, %0.4</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Damıtılmış Su ( RNAse-, DNAse-free)</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>damıtılmış su olarak adlandırılır</td></tr><tr><td>Ultrapure EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

floresan aktive edilmiş Çekirdekler ayıklama kullanılarak yetişkin İnsan astrosit popülasyonlarının taze dondurulmuş korteksten İzolasyonu

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

İnsan astrositlerinin karmaşıklığı, birincil insan dokusunda zayıf bir şekilde tanımlanmıştır ve izolasyonları ve moleküler karakterizasyonları için daha iyi araçlar gerektirmektedir. Floresan ile aktive edilen çekirdek sıralama (FANS), insan nöronal çekirdek (NeuN +) popülasyonlarını donmuş arşiv dokusundan başarılı bir şekilde izole etmek ve incelemek için kullanılabilir, böylece taze dokuyla ilgili sorunlardan kaçınılır. Bununla birlikte, astroglia'yı nöronal olmayan (NeuN-) elementten benzer şekilde izole etme çabaları eksiktir. Yakın zamanda geliştirilen ve doğrulanmış bir immünoetiketleme stratejisi, zenginleştirilmiş nöronal (NeuN +), astrosit (eşleştirilmiş kutu protein 6 (PAX6) + NeuN-) ve oligodendrosit progenitör (OLIG2 + NeuN-) çekirdek popülasyonlarını hastalıksız, taze (sabitlenmemiş) dondurulmuş postmortem insan temporal neokorteks dokusundan eşzamanlı olarak izole etmek için üç transkripsiyon faktörü antikoru kullanır.
Bu tekniğin primer patolojik epilepsi neokorteksindeki hücre tipine özgü transkriptom değişikliklerinin karakterizasyonunda yararlı olduğu gösterilmiştir. Transkriptomik analizler, PAX6 + NeuN sıralanmış popülasyonların pan-astrosit belirteçleri için sağlam bir şekilde zenginleştirildiğini ve hem dinlenme hem de reaktif koşullarda astrositleri yakaladığını doğruladı. Bu makalede, astrositle zenginleştirilmiş çekirdek popülasyonlarının taze dondurulmuş insan korteksinden, doku ayrışmasının tek çekirdekli (sn) süspansiyona ayrıştırılması da dahil olmak üzere izolasyonu için FANS metodolojisi açıklanmaktadır; çekirdeklerin anti-NeuN ve anti-PAX6 floresan konjuge antikorlarla immünoetiketlenmesi; FANLAR, sıralama sırasında hassasiyeti ve özgüllüğü optimize etmek ve astrosit zenginleştirmesini onaylamak için geçit stratejileri ve kalite kontrol metrikleri; ve toplu veya sn çözünürlükte aşağı akış transkriptom ve kromatin erişilebilirlik sıralaması için önerilen tedarik. Bu protokol, çeşitli patolojileri olan nekrotik olmayan, taze dondurulmuş, insan kortikal örnekleri ve 24 saat içinde önerilen postmortem doku toplanması için geçerlidir.

Çekirdekler taze (sabit olmayan) çıtçıtlı dondurulmuş temporal neokorteks dokusundan toplandı ve postmortem toplama süresi 12 saat idi. Çekirdek süspansiyonuna doku ayrışmasından sonra, örnekler NeuN, PAX6 ve OLIG2'ye karşı antikorlarla inkübe edildi ve Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen kapıya göre sıralandı. Çekirdekler NeuN+, PAX6+NeuN- ve OLIG2+NeuN- sıralanmış popülasyonlardan toplandı (Şekil 1E,F ve <strong clas...

İnsan astrosit popülasyonlarını aşağı akış moleküler analizlerinde kullanılmak üzere taze dondurulmuş dokudan zenginleştiren ve izole eden bir yöntem geliştirdik.

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Bu protokol, insan astrositlerinin moleküler fonksiyonlarını doğal nişlerinde incelemek isteyen bilim insanlarına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan ile aktive olmuş çekirdekleri sıralamayı kullanarak toplu insan beyin dokusu örneklerinden belirli bir hücre tipinin, yetişkin astrositlerin izole edilmesine ve zenginleştirilmesine izin vermesidir. Bu metodoloji, diğer uygun floresan konjuge antikorları kullanarak nöronlar ve oligodendrosit progenitör hücreleri gibi diğer hücre tiplerini insan neokorteksinden izole etmek için uygulanabilir.Taze dondurulmuş bir insan yetişkin korteks doku örneğinden yaklaşık 200 ila 400 miligram doku diseksiyonuna başlayın. Dokuyu buz üzerinde dört mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu içeren yedi mililitrelik bir cam doku dağıtıcısına yerleştirin ve dokuyu yaklaşık 50 kez öğütün. Homojenatı 12 mililitrelik ultrasantrifüj polipropilen tüpe aktarın.Sakkaroz ve doku homojenatı arasındaki arayüzü bozmadan ultrasantrifüj tüpünün dibine 6,5 mililitre buz gibi soğuk sakkaroz tamponu eklemek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Çekirdekleri toplamak için, lizatı 101, 814 kez G'de bir saat boyunca ultrasantrifüj yapın ve peleti rahat

isolation-adult-human-astrocyte-populations-from-fresh-frozen-cortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, yeni doğmuş farelerden saf bir astrosit preparatı elde etme yöntemini açıklıyoruz.

Astrosit İzolasyonu: Fare Kortikal Astrositlerinin Saf Preparatını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Video, murin astrositlerini diğer beyin hücrelerinden izole etmek için basit bir yöntem göstermektedir. Kültürleme sırasında, astrosite özgü ortam kullanarak ve astrositik olmayan hücrelerin yapışmasını inhibe ederek, yöntem astrositleri seçici olarak kültüre eder. Bu kültürlenmiş astrositler, ince süreçlerle yıldız morfolojisi sergiler.

Murin astrositlerini izole etmek ve kültürlemek için basit bir teknik

Bu video, çeşitli nörolojik uygulamalar için farklı hücre popülasyonlarının incelenmesini sağlayan floresanla aktive edilen çekirdek ayıklama (FANS) kullanarak taze donmuş insan beyin dokusundan çekirdekleri izole etme ve ayırma prosedürünü göstermektedir.

Floresanla Aktive Edilen Çekirdek Sıralaması Kullanılarak Beyin Dokusundan Hücre Popülasyonlarının İzole Edilmesi

Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.

Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür

Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.

Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon

Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.

Derin Tek Hücreli RNA Sıralamaiçin Bir Yetişkin Fare Beyin Yarımküre'den Bölgeye Özgü MikrogliaNın İzolasyon

Burada, doğum sonrası farelerin merkezi sinir sisteminin farklı bölgelerinden türetilen astrositlerin yüksek oranda zenginleştirilmiş kültürlerini ve transkripsiyon faktörlerinin zorla ekspresyonu ile fonksiyonel nöronlara doğrudan dönüştürülmelerini sağlamak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Fare Astrositlerinin İzolasyonu ve Doğrudan Nöronal Yeniden Programlanması

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Keşfedin, yetişkin insan astrosit çekirdeklerini FANS kullanarak taze dondurulmuş korteksten izole etme yöntemini. Bu protokol, transkriptomik ve kromatin erişilebilirlik analizleri için yüksek saflıkta hücre popülasyonları sağlar.

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu (Video) | JoVE Journal

Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Ayıklama Kullanılarak Yetişkin İnsan Astrosit Popülasyonlarının Taze Dondurulmuş Korteksten İzolasyonu

Daha fazla video keşfet