Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

NTA sonuçları operatör önyargısına çok eğilimlidir. Bu protokol, değiştirilen NTA parametrelerinin elde edilen sonuçlar üzerindeki etkilerini gösterir. Standartlaştırılmış bir yöntem, NTA analizinde titizliği ve tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olacaktır.

Bir cuvette örnek analiz her videoda istatistiksel olarak rastgele bir örnek yakalanmasını sağlar. Bu, daha tekrarlanabilir veriler ve çok çeşitli boyutlardaki parçacıkların görselleştirilmesiyle sonuçlanır. Önerilen partikül konsantrasyon aralığında bir örnek almak zor olabileceğinden, ideal seyreltme faktörünü tanımlamak için seri bir seyreltme gerçekleştirdiğinden emin olun.

Prosedürü gösteren kişi Anthony Ferrante'nin laboratuvarından doktora öğrencisi Kungheng Cai olacak. Cuvette'i nanopartikül izleme analizine hazırlamak için, liflerin cuvettes'e girmesini önlemek için çalışma alanını tüy bırakmayan bir malzemeyle örtün. Eldiven giyerek, manyetik cuvette jig üzerine bir karıştırma çubuğu içeren bir cuvette yerleştirin.

Kesici ucu cuvette'in önünde görünen kesici ucun çentiğiyle cuvette içine yerleştirmek için bir kanca aracı kullanın. Bir pipet kullanarak, kesici uçtaki delikten cuvette üzerine 400 ila 500 mikrolitre saflaştırılmış vezikül eklemek için bir pipet kullanın ve hava kabarcıkları sokmadan hafifçe pipetleme yaparak numuneyi karıştırın, ardından cuvette'i kaplayın, kabarcıklara gerektiği gibi dokunun ve cuvette'in dış yüzeyini silmek için tüy bırakmayan bir bez kullanın. Seyrelticinin veya bir numunenin parçacık konsantrasyonu analiz etmek için bilgisayar iş istasyonunu ve aleti açın ve parçacık izleme analiz programını başlatın.

İstendiğinde, NTA'yı tıklatın ve kayıt sekmesini açın. Gerekli tüm örnek bilgileri doldurmak için ekrandaki yönergeleri izleyin. EV izleme analizi için seyrelticiyi PBS olarak ayarlayın.

Tuzluluk% 9'a otomatik olarak doldurulur Seyreltici veya örnek parçacık konsantrasyonu elde etmek için, cihaz kapağını açın ve cuvette'in yerleştirileceği koruyucu kapak kaplamasını çıkarın. Cuvette'i fotoğraf makinesine bakan kesici ucun çentiğiyle doğru yönde cihaza yükleyin ve kapağı ve enstrüman kapağını değiştirin. Kamerayı açmak için akış okını tıklatın ve kayıt ayarlarını genişletmek için köşeli çift ayraç okını tıklatın.

Nispeten küçük parçacıklar açıkça görünene kadar odağı ayarlayın. Küçük bir EV niceleme için analizi ayarlamak için kare hızını saniyede 30 kareye, 15 milisaniyeye, karıştırma süresini beş saniyeye, bekleme süresini üç saniyeye, mavi, yeşil ve kırmızı lazer güçlerini sırasıyla 210, 12 ve 8 miliwatt'a, video başına kareleri 300'e ve kazancı 30 desibel'e ayarlayın. Nispeten küçük parçacıklar açıkça görünene kadar odağı ayarlayın.

Yakınlaştırmayı ve/veya kazancı artırmak parçacık odaklamada yardımcı olabilir. Ancak kazancı artırırsanız, kaydetmeden önce 30 desibel olarak ayarlamayı unutmayın. Parçacıklar netlemedeyken, bant genişliğinden tasarruf etmek ve kayıp karelerini önlemek için yakınlaştırma ayarını 0,5X olarak ayarlayın ve videoyu kaydetmeye başlamak için kayıt'ı tıklayın.

Videoların kaydedildiğini belirten bir istem göründüğünde, kaydı tamamlamak ve işlem sekmesini seçmek için Tamam'ı tıklatın. Kayıt yaparken herhangi bir videoda çok büyük parçacıklar görünüyorsa, kaydedilen videoların dizinine gidin ve işlemeden önce sorunlu videoları kaldırın. Ses algılamayı devre dışı bırak geçersiz kılma kutusunu işaretleyin ve özellik çapını 30 olarak ayarlayın.

Video işlemeyi başlatmak ve canlı bir dağıtım grafiği görüntülemek için işlem'i tıklatın. İşlem tamamlandığında Tamam'ı tıklatın ve çizim sekmesini seçin. EV'ler için ana grafiği günlük kutusu silikası olarak görüntüleyin.

Grafiğin, üretilen figürün entegrasyonu için alanı ayarlamak üzere x eksenini değiştirmek gibi diğer özellikleri özelleştirilebilir. Sonuçların PDF raporunu oluşturmak için rapor düğmesini tıklatın. Seyreltme faktörü ve dağılım genişliği için ayarlanan ortalama, ortanca, mod boyutu ve konsantrasyon görüntülenir.

Seyrelticinin NTA'sı herhangi bir numuneden önce yapılmalıdır, böylece bu boşluğun konsantrasyonu EV numune parçacık konsantrasyonundan çıkarılabilir. Analizden sonra cuvetteleri temizlemek için, cuvette'i boşaltın ve cuvetteleri 10 ila 15 kez deiyonize suyla ve üç kez% 70 ila 100 etanol ile doldurarak artık numuneyi çıkarın. Cuvettes'in dışını tüy bırakmayan bir mikrofiber bezle kurulayın ve içini basınçlı hava tozlayıcı ile kurulayın.

Kesici uçları temizlemek ve çubukları karıştırmak için malzemeleri% 70 ila 100 etanol içeren bir cam scintillation şişesine yerleştirin ve şişeyi kuvvetlice çalkalayın. Daha sonra kesici uçları durulayın ve çubukları gösterildiği gibi sallayarak deiyonize suda karıştırın ve tüy bırakmayan bezler kullanarak kurutun. Kuruduktan sonra, bir sonraki analize kadar tüm temiz bileşenleri derhal depoya yerleştirin.

Bir analiz yapmadan önce, elde edilen verilerin geçerliliğini sağlamak için polistiren boncuklar kullanılarak cihaz kalibrasyonu test edildi. Gözlemlendiği gibi, parçacık izleme cihazı 100 nanometre manodisperse boncukunun boyutunu doğru bir şekilde bildirdi, ancak sadece 400 nanometre boncukunun boyutunu yakından bildirdi. Bu nedenle, bu protokolün cihaz ayarları daha küçük parçacıklar için daha doğru, 100 nanometreye yakın boyuttaydı.

Bu ayarları kullanarak, cihazın teknik kopyalar arasında çok az değişkenlik ile çeşitli seyreltmelerde parçacık konsantrasyonunu doğru bir şekilde tespit edebildiğine dair seyreltme faktörü ile rapor edilen parçacık konsantrasyonu ölçeklenir. Mililitre fare dokusundan türetilmiş EV örneği başına 4,41 çarpı 10 ila 10.partiküller için optimum seyreltmenin 1.000 ila 3.000 arasında olduğu belirlendi. Bu analizde, kazancı artırmak kameranın hassasiyetini artırarak daha fazla sayıda küçük parçacığın görselleştirilmesinde bir artışa izin verir.

Mavi lazer gücünü 70'ten 210 miliwatt'a yükseltirken yeşil ve kırmızı lazer güçlerini sabit tutmak, bildirilen ortalama parçacık boyutunu 122'den 105 nanometreye kaydırdı ve bildirilen toplam parçacık konsantrasyonu 1,1 çarpı 10'dan sekizinciye 1,7 kat sekizinciye yükseltti. Kırmızı lazerin gücünü artırmak, bildirilen ortalama partikül boyutunu 175'ten 246 nanometreye yükseltti ve bildirilen toplam parçacık konsantrasyonu azalttı. Yeşil lazer gücünün artırılması, bildirilen ortalama partikül boyutunda bir azalmaya ve bildirilen toplam partikül konsantrasyonunda bir artışa neden oldu.

Bir numuneyi en uygun algılama aralığına yerleştirmek için doğru seyreltmeyi bulmak her örnek için birkaç deneme yapabilir. Cuvette temizliği de ekstra dikkatli kullanım gerektirir. EV partikül boyutu ve konsantrasyon ölçümleri için birden fazla ortogonal yöntem uygulanmasını öneririz.

EV'leri karakterize etmek için dinamik ışık saçılımı, dirençli darbe algılama, iletim elektron mikroskopisi ve tek parçacıklı interferometrik reflektör görüntüleme algılaması da yapılabilir.