Name: Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Keşfedin, insan iPS hücrelerinden 3D akciğer organoidleri üretme protokolünü. Bu yöntem, akciğer gelişimi ve hastalıklarının in vitro modellenmesi için yenilenebilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Kaliforniya Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) tarafından desteklendi.

Bu çalışma protokolü UCSD İnsan Araştırma Koruma Programı Kurumsal İnceleme Kurulu (181180) tarafından onaylanmıştır.
1. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden kesin endoderm indüksiyonu (Gün 1 - 3)
<ol><li>Büyüme faktörünü yavaşça çözün (GFR)-bodrum membran (BM) matris ortamı kullanılmadan 30 dakika önce buz üzerinde. Soğuk DMEM/F12'de, GFR BM matris ortamını bu ortamın% 50'sini oluşturacak şekilde seyreltin. P1000 pipet uçlarını kullanmadan önce soğuması için dondurucuya yerleştirin.</li>
	<li>Buz gibi DMEM/F12'de hazırlanan 500 μL%50 GFR-bodrum membran matris ortamı ile 12 kuyulu bir plakanın her kuyusunu kapla. İstenilen kuyu sayısı kaplandıktan sonra, kuyulardan fazla orta karışımı ve/veya kabarcıkları çıkarın ve plakayı ayarlamak için 20 dakika boyunca 4 °C'de buz veya buzdolabına yerleştirin. Daha sonra, tabağı jelleşmek ve kurumak için gece boyunca 37 ° C'de inkübatöre taşıyın.</li>
	<li>HiPSC'ler% 70-90 izdiah süresine ulaştığında, ayrışmadan bir saat önce 10 μM Rho ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 ekleyin. Ortamı aspire edin ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın. Hücre ayırma ortamı (0,5 mL / 12 kuyu plakası kuyusu) ekleyerek hiPSC'leri ayırın ve % 5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Plakaları inkübatörden çıkarın ve kuyulara 0,5 mL/12 kuyu kök hücre geçirme ortamı (Tablo 1) ekleyin; tek hücreli süspansiyon elde etmek için P1000 ucu kullanarak hücreleri hafifçe üçe katlayın. Ayrışmış hücreleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın; 300 x g'da 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Ortamı epire edin ve hücre peletini 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 1 mL mTeSR Plus ortamla yeniden canlandırın. Hücre sayısı gerçekleştirin. 12 kuyulu GFR bodrum membranlı orta kaplamalı plakanın kuyusu başına ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL mTeSR'ye 2,0 x 105 hiPSC ekleyin. Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır. NOT: Hücre tohumlama numarası hücre çizgisi başına en iyi duruma getirilmelidir. Kaplamadan 24 saat sonra, kuyular% 50-% 70 bir arada olmalıdır.</li>
	<li>1. günde, mTeSR Plus'ı epire edin ve 100 ng/mL insan aktivin A ve 5 μM GSK3 inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 ile desteklenmiş Kesin Endoderm (DE) indüksiyon ortamı (Tablo 1) ekleyin. NOT: Başarılı farklılaşma için GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 ile DE ortamı 1.</li>
	<li>2. gün ve 3. NOT: DE farklılaşması toplam 72 saati geçmemelidir, aksi taktirde etkinlik azalacaktır. 4. günde, büyük hücreli ölüm gözlenirse, toplam DE ortam maruz kalma süresini 6-12 saat azaltın.</li>
	<li>DE verimliliğini analiz etmek için, FOXA2 ve/veya SOX17'nin akış sitometrisi veya immünopluoresans analizi yoluyla %90'dan fazla CXCR4 ve/veya cKit ekspresyonunun doğrulanmış olması (Şekil 2a).</li>
</ol>2. Ön ön ön endoderm (AFE) indüksiyonu (Gün 4 - 6)
<ol><li>4. günde, medyayı AFE indüksiyonu için 10 μM SB431542 ve 2 μM Dorsomorphin ile desteklenmiş serumsuz bazal ortama (SFBM) (Tablo 1) değiştirin. AFE medyayı 3 gün boyunca günlük olarak değiştirin (4. gün, 5. gün ve 6. gün).</li>
	<li>AFE verimliliğini analiz etmek için, immünofluoresans boyama yoluyla SOX2, TBX1 ve FOXA2'nin sağlam ifadesini onaylayın (Şekil 2b).</li>
</ol>3. Akciğer progenitör hücre (LPC) farklılaşması (Gün 7 - 16)
<ol><li>7. günde, GFR-bodrum membran matris ortamını buz üzerinde çözün. AFE medyasını epire edin ve 1x PBS ile iyice yıkayın. 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücre müfrezesi çözeltisi içeren kuyulara 1 mL söndürme ortamı (DMEM/F12'de %2 FBS) ekleyin. Hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyarak agrega olarak tutun. Tüm hücrelerin yerinden çıkıp 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarıldığından emin olun. 300 x g'da 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 ng/mL insan rekombinant kemik morfojenik protein-4 (BMP4), 0,1 μM all-trans retinoik asit (RA), 3 μM GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR99021 ile desteklenmiş söndürme ortamında yeniden canlandırın, ve 10 μM Kaya inhibitörü Y-27632.</li>
	<li>Hücre sayısı gerçekleştirin. 100 μL soğuk GFR-bodrum membran matris ortamına 2,5 x 105 hücre ekleyin, iyice karıştırın ve damlacıkları 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin. Ortanın polimerize olmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de 30-60 dakika kuluçkaya bırakın. Orta damlanın tamamen batırılmasını ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatmasını sağlamak için kuyu başına 10 μM KAYA inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL LPC ortam ekleyin.</li>
	<li>LPC indüksiyonu sonrası 8, 24 saat sonra, ROCK inhibitörü Y-27632'yi çıkarmak için LPC ortamını değiştirin. Toplam 9-11 gün boyunca LPC ortamını her gün değiştirin. NOT: Ortam 24 saat içinde sararırsa, her gün ortayı değiştirin.</li>
	<li>LPC verimliliğini analiz etmek için hücre içi transkripsiyon faktörü NKX2-1'in sağlam ekspresyonunu onaylayın veya CD47hi/CD26low15 veya CPM18 yüzey belirteçleri için akış sitometrisi gerçekleştirin (Şekil 2c). Brüt olarak, LPC küreselleri yuvarlak ve şeffaf olmalıdır (Şekil 2c). NOT: NKX2-1'in verimliliği %30'un altındaysa akciğer organoid farklılaşmasına devam etmeyin.</li>
</ol>4.3D akciğer organoid indüksiyonu (Gün 16 - 22)
<ol><li>17. günde, GFR-bodrum membran matrisi ortamını buz üzerinde çözün. LPC indüksiyon ortamını aspire edin. Daha sonra kuyuya 2 μg/mL dispaz (1 mL) ekleyin ve orta/dispaz karışımını bir P1000 pipetle yeniden biriktirin. 15 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Karışımı tekrar üçe ayırın ve 37 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Dispaz ve hücreleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Kuyuyu yıkamak ve dispaz/hücre karışımını yeniden kullanmak için soğutulmuş PBS (2-3 mL) kullanın. 400 x g'da 5 dakika santrifüj. Orta / hücre pelet tabakasını dağıtmamaya dikkat derek, üst düğmeyi manuel olarak çıkarın. Soğutulmuş PBS yıkamayı tekrarlayın ve konik santrifüj tüpünü 400 x g'da 5 dakika daha santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı manuel olarak çıkarın ve ardından konik santrifüj tüpüne 2 mL tripsin bazlı ayrışma çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 12 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, hücreleri P1000 pipet ucuyla yeniden biriktirin. Ardından konik santrifüj tüpüne eşit miktarda söndürme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g'da aşağı doğru döndürün. Süpernatant ve resuspend hücreleri söndürme ortamı + 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632'de epire edin. NOT: Başarılı akciğer organoid indüksiyonu, hücreler tek hücre olarak değil, agrega olarak gömildiğinde, pipetleti buna göre ayarladığında ortaya çıkar.</li>
	<li>Hücre sayısı gerçekleştirin. Kuyu başına 5,0-8,0 x 104 hücre elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. LPC hücresinin 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüjler halinde 400 x g'da 5 dakika boyunca bir araya toplanır. Hücre peletini çalkalatmamaya dikkat derek fazla üstnatantı çıkarın. Sadece 10 μL artık ortam bırakın.</li>
	<li>Hücre peletini 200 μL soğuk GFR-bodrum membran matris ortamında yeniden askıya alın ve hücre kültürü membran kesici uçlarına ekleyin (6,5 mm çapında, 0,4 μm gözenek, polyester membran). GFR-bodrum membran matrisi ortamının polimerize olmasını sağlamak için plakayı 37 °C'de 30-60 dakika kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Fibroblast büyüme faktörü-7 (FGF7) (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β inhibitörü ile desteklenmiş 1 mL 3D organoid indüksiyon ortamı (Tablo 1) ekleyin /Wnt aktivatör CHIR (3 μM), epidermal büyüme faktörü (EGF) (10 ng/mL) ve 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 membran kesici ucun bazolateral odasına. Ortamı 6 gün boyunca iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>5.3D Akciğer organoid dallanma (Gün 23 - 28)
<ol><li>23. günde FGF7 (10 ng/mL), FGF10 (10 ng/mL), GSK3β inhibitörü/Wnt aktivatör CHIR9902 ile birlikte 3D dallanma ortamına (Tablo 1) yapılan değişiklik 1 (3 μM), RA (0,1 μM), EGF (10 ng/mL) ve vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) / plasental büyüme faktörü (PlGF) (10 ng/mL). Ortamı 6 gün boyunca iki günde bir değiştirin. NOT: 3D dallanma farklılaşması 6. günde birden fazla dallanma organoidi olmalıdır (Şekil 2).</li>
</ol>6.3D akciğer organoid olgunlaşması (Gün 29 - 34)
<ol><li>29. günde, 3D olgunlaşma ortamına (Tablo 1) değiştirin, bu da 3D dallanma ortamıyla aynıdır, ancak deksametazon (50 nM), cAMP (100 μM) ilavesiyle ve 3-izobütil-1-metiloksinatin (IBMX), fosfodizeraz inhibitörü de izobutilksantin (100 μM) olarak adlandırıldı. Ortamı 6 gün boyunca iki günde bir değiştirin. NOT: 3D olgunlaşmadan sonra 24 saat içinde, dallanan organoidler genişlemeli ve şeffaf kürelere dönüşmelidir.</li>
</ol>7.3D Akciğer organoid immünosikokimyası
<ol><li>3D tüm akciğer organoid analizi için, 4 °C'de 1 saat boyunca %4 paraformaldehit (PFA) ile membran uçlarındaki GFR-bodrum membran matris ortamını sabitleyin. Parafin balmumuna gömün ve yayınlanan standart protokollere göre slaytlara monte edin.</li>
	<li>Boyamadan önce antijen alımını gerçekleştirin. Hava yolu belirteçleri arasında KRT5, MUC5AC ve SCGB3A2 bulunur. Alveolar belirteçler SP-C, SP-B, HTII-280, HTI-56 ve HOPX'u içerir (Şekil 3).</li>
</ol>8. Tüm akciğer organoidlerinin geçiş, FACS veya kriyoprezervasyon için GFR-bodrum membran matris ortamından çıkarılması
<ol><li>Organoidleri GFR-bodrum membran matris ortamından ayrıştırmak için bazal hazneden medyayı çıkarın ve apikal hazneye 2 μg/mL dispaz (1 mL) ekleyin.</li>
	<li>Orta / dispaz karışımı bir P1000 pipetle hafifçe üçe katlayın ve 15 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Karışımı tekrar hafifçe üçe ayırın ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>1 mL soğutulmuş PBS (4 °C) ekleyin ve matris ortamına sahip organoidleri 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika boyunca 400 x g'da döndürün. Hücre peletini rahatsız etmemek için üstnatant dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>1 mL soğutulmuş PBS ile bir kez daha yıkayın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da aşağı doğru döndürün. Orta/ hücre karışımını rahatsız etmemek için üstnatant dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Konik santrifüj tüpüne 1 mL hücre dekarakment çözeltisi ekleyin, GFR-Basement membran matrisi orta / hücre karışımını hafifçe yeniden kullanın. Hücreleri agrega olarak geçirmek veya kriyoprezervasyon için 12 dakika veya tek hücreli süspansiyon için 20 dakika inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Eşit miktarda söndürme ortamı ekleyin ve 5 dakika boyunca 400 x g'da aşağı çevirin. Söndürme ortamı + 10 μM KAYA inhibitörü Y-27632'de yeniden kullanılabilir. NOT: Bu adımda tüpte artık bodrum membran ortamı görülmemelidir. Kalan ortam kalırsa, 8.5 ve 8.6 adımlarını yineleyin.</li>
	<li>Hücre sayısı gerçekleştirin. Aşağı akış uygulamaları için gereken birimi hesaplayın.</li>
</ol>

<ol><li>Ten Have-Opbroek, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Lung development in the mouse embryo.</a> Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).</li>
<li>Perl, A. K., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis.</a> Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).</li>
<li>Leibel, S., Post, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+and+exogenous+stem%2Fprogenitor+cells+in+the+lung+and+their+role+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+pediatric+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease.</a> Frontiers in Pediatrics. 4, 36(2016).</li>
<li>Hines, E. A., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+crosstalk+in+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue crosstalk in lung development.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).</li>
<li>Montoro, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+airway+epithelial+hierarchy+includes+CFTR-expressing+ionocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes.</a> Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).</li>
<li>Barkauskas, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+alveolar+cells+are+stem+cells+in+adult+lung%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).</li>
<li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm.</a> Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).</li>
<li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+anterior+foregut+endoderm+from+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).</li>
<li>Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+3+activates+transcription+of+thyroid+transcription+factor+1+in+respiratory+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells.</a> Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).</li>
<li>Schittny, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the lung.</a> Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).</li>
<li>Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+in+lung+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%3A+Journal+of+the+International+Society+for+Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Elastin in lung development and disease pathogenesis.</a> Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).</li>
<li>Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+10+%28FGF10%29+and+branching+morphogenesis+in+the+embryonic+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung.</a> Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).</li>
<li>Bellusci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Sonic+hedgehog+%28Shh%29+in+mouse+embryonic+lung+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis.</a> Development. 124 (1), 53-63 (1997).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Hawkins, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+NKX2-1-expressing+human+lung+progenitors+derived+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).</li>
<li>McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51(2018).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Huang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Endale, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal%2C+spatial%2C+and+phenotypical+changes+of+PDGFR%CE%B1+expressing+fibroblasts+during+late+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development.</a> Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+organoids+and+their+use+to+study+cell-cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pathobiology+Reports%22%5BJournal%5D)">Lung organoids and their use to study cell-cell interaction.</a> Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).</li>
<li>Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+iPSC+to+modelling+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+on+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of iPSC to modelling of respiratory diseases.</a> Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).</li>
<li>McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+mesenchyme+directs+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">The pulmonary mesenchyme directs lung development.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).</li>
<li>Blume, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+crosstalk+between+airway+epithelial+and+endothelial+cells+regulates+barrier+functions+during+exposure+to+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).</li>
<li>Leibel, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+surfactant+protein+B+deficiency+in+patient+specific+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+lung+organoids+by+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13450(2019).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTII-280%2C+a+biomarker+specific+to+the+apical+plasma+membrane+of+human+lung+alveolar+type+II+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).</li>
<li>McCauley, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+profiling+of+pluripotent+stem+cell-derived+SCGB3A2%2B+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).</li>
<li>Sekine, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+detection+of+undifferentiated+iPSC+among+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10293(2020).</li>
<li>Jacquet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+the+creation+of+clinical+grade+hESC+line+banks+that+HLA-match+a+target+population%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).</li>
<li>Mattapally, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I+and+II+knockout+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cells%3A+universal+donor+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

3D tüm akciğer organoidlerinin (WLO) başarılı farklılaşması, büyüme faktörlerine ve küçük moleküllere maruz kalma süresi, geçtikten sonra hücresel yoğunluk ve hiPSC'lerin kalitesi de dahil olmak üzere detaylara dikkat edilen çok adımlı, 6 haftalık bir protokole dayanır. Sorun giderme için tablo 2'ye bakın. hiPSC'ler yaklaşık%70-%80 bir arada olmalı, ayrışma öncesinde %5'ten az spontan farklılaşma olmalıdır. Bu protokol "mTeSR artı" ortamını gerektirir; ancak, düz "mTeSR" ortamı da karşılaştırılabilir son...

Akciğer, embriyonik, psödooglandular, kanaliküler, sakküler, alveolar ve mikrovasküler olgunlaşma1,2 olmak üzere altı farklı aşamada gelişen karmaşık, heterojen, dinamik bir organdır. İkinci iki evre insan gelişiminde prenatal olarak gerçekleşirken, ilk dört aşama sadece fetal gelişim sırasında meydana gelir, tabii preterm doğum gerçekleşmediği sürece3. Embriyonik faz endodermal mikrop tabakasında başlar ve trakea ve akciğer tomurcuklarının tomurcuklanmasıyla sonuçlanır. Akciğer gelişimi kısmen epitel ve mezenkimal hücreler arasında sinyal yoluyla gerçekleşir4. Bu etkileşimler akciğer dallanması, çoğalması, hücresel kader tespiti ve gelişmekte olan akciğerin hücresel farklılaşması ile sonuçlanır. Akciğer iletken bölgelere (terminal bronşiollere trakea) ve solunum bölgelerine (alveollere solunum bronşiolleri) ayrılmıştır. Her bölge benzersiz epitel hücre tipleri içerir; hava yolunda bazal, salgı, siliated, fırça, nöroendokrin ve iyonosit hücreleri5, ardından solunum epitelinde alveolar tip I ve II hücreleri dahil olmak üzere6. Çeşitli hücre tiplerinin gelişimi ve yaralanmasına yanıt hakkında hala çok şey bilinmemektedir. iPSC türevi akciğer organoid modelleri, insan akciğer gelişimini yönlendiren mekanizmaların incelenmesini, genetik mutasyonların pulmoner fonksiyon üzerindeki etkilerini ve hem epitel hem de mezenkimlerin primer insan akciğer dokusuna ihtiyaç duymadan enfeksiyöz ajanlara yanıtlanmasını sağlar.
Embriyonik farklılaşmanın çeşitli aşamalarına karşılık gelen belirteçler arasında kesin endoderm (DE)7 için CXCR4, cKit, FOXA2 ve SOX17, ön ön endoderm (AFE)8 için FOXA2, TBX1 ve erken akciğer progenitor hücreleri için NKX2-1 bulunur9. Embriyonik akciğer gelişiminde, foregut dorsal yemek borusu ve ventral trakeaya bölünür. Sağ ve sol akciğerlerin tomurcukları, trakeal tomurcuk10 etrafında iki bağımsız çıkıntı olarak görünür. Dallanma morfogenez sırasında, epitel çevreleyen mezenkim elastik doku, düz kas, kıkırdak ve vaskülür üretir11. Epitel ve mezenkim arasındaki etkileşim normal akciğer gelişimi için gereklidir. Bu, FGF1012'nin epitel tarafından üretilen mezenkim ve SHH13 tarafından salgılanmasıdır.
Burada, hiPSC'lerin üç boyutlu (3D) tüm akciğer organoidlerine (WLO) yönlendirilmiş farklılaşması için bir protokol açıklıyoruz. Alveolar benzeri 14,15 (distal) organoid veya hava yolu16 (proksimal) organoid yapmak için LPC aşamasında tasnif yoluyla akciğer progenitör hücrelerinin izolasyonunu içeren benzer yaklaşımlar olsa da, veya insan akciğer organoidlerini alveolar hücre ve mezenkimal belirteçleri ve tomurcuk ucu progenitor organoidlerini ifade eden hale getirmek için ventral-ön sferoidler üretin17 , bu yöntemin gücü, akciğer dallanma morfogenez, olgunlaşma ve genişleme in vitro için hem akciğer epitel hem de mezenkimal hücre tiplerinin örüntülenmesi ve düzenlenmesidir.
Bu protokol, pluripotent kök hücrelerin ayırt ediciliğini kesin endoderm, ön ön ön endoderm ve akciğer progenitör hücreleri yoluyla yönlendirmek için küçük moleküller ve büyüme faktörleri kullanır. Bu hücreler daha sonra dallanma ve olgunlaşma da dahil olmak üzere önemli gelişimsel adımlarla 3D tüm akciğer organoidlerine indüklenir. Farklılaşma protokolünün özeti Şekil 1a'da, Şekil 1b'de gösterilen endodermal ve organoid farklılaşmanın temsili parlak alan görüntüleriyle gösterilmiştir. Şekil 1c, endodermal farklılaşmanın gen ekspresyon detaylarının yanı sıra farklılaşmayı tamamladıktan sonra akciğer epitel hücrelerinin hem proksimal hem de distal popülasyonlarının gen ekspresyonunu gösterir.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Hücre Kültürü< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu uçlar, 0.4um, yarı saydam</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojisi</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>askorbik asit</td><td>Sigma</td> Retinoik asit içermeyen <td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA) Fraksiyon V,% 7.5 çözelti</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life </td><td>Jambon 35050061</td><td></td></tr><tr><td>Teknolojiler s F12</td><td>Canlandırıcı</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Modifiye Dulbecco' s Orta (IMDM) + Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Değişimi (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Monotiyokliserol</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kiti (10/kutu)</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Kaya İnhibitörü)</td><td>R& D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Büyüme Faktörleri/Küçük Moleküller</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A Ar-Ge</td><td> D Sistemleri</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoik asit (RA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Sistemleri</td><td>314-BP / CF</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorfin</td><td>R& D Sistemleri</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>251-KG/CF</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-İzobtil-1-metilksantin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>VEGF/PIGF</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>297-VP / CF</td><td></td></tr> < <tr><td>güçlü > Birincil antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>< güçlü > seyreltme oranı< / güçlü ></td></tr><tr><td>CXCR4-PE</td><td>R& D Sistemleri</td><td>FAB170P</td><td>1:200 (F)</td></tr><tr><td>HOPX</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-398703</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>HTII-280</td><td>Teras Biyoteknoloji</td><td>TB-27AHT2-280</td><td>0.145833333</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab52635</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>0.25</td></tr><tr><td>NKX2-1-APC</td><td>LS-BIO</td><td>LS-C264437</td><td>1:1000 (F)</td></tr><tr><td>proSPC</td><td>Abcam</td><td>ab40871</td><td>0.215277778</td></tr><tr><td>SCGB3A2</td><td>Abcam</td><td>ab181853</td><td>0.25</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-014</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>R& D Sistemleri</td><td>AF3075</td><td>0.180555556</td></tr><tr><td>SPB (yetişkin)</td><td>7 Hills</td><td>48604</td><td>1: 1500 (F) 1:500 (W)a</sup</td></tr><tr><td>>SPC (olgun)</td><td>LS Bio</td><td>LS-B9161</td><td>1:100 (F); 1:500 (W) A</td></tr></tbody></table>

akciğer gelişim biyolojisi ve hastalığının modellenerek İndüklenen pluripotent kök hücrelerden 3d bütün akciğer organoidlerinin Üretimi

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Biyolojik olarak ilgili in vitro model sistemlerin eksikliği nedeniyle insan akciğer gelişimi ve hastalığının incelenmesi zor olmuştur. İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) adım adım hem epitel hem de mezenkimal hücre popülasyonlarından oluşan 3D çok hücreli akciğer organoidlerine ayırt edilebilir. Embriyonik gelişimsel ipuçlarını, kesin endoderm, ön ön endoderm ve daha sonra akciğer progenitör hücreleri verimli bir şekilde üretmek için çeşitli büyüme faktörleri ve küçük moleküller sunarak yeniden kapsülleriz. Bu hücreler daha sonra büyüme faktörü azaltılmış (GFR)-bodrum membran matris ortamına gömülür ve dış büyüme faktörlerine yanıt olarak kendiliğinden 3D akciğer organoidlerine dönüşmelerini sağlar. Tüm bu akciğer organoidleri (WLO) deksametazon, siklik AMP ve izobutilksantin maruziyeti sonrası dallanma morfogenez ve olgunlaşma dahil olmak üzere erken akciğer gelişim evrelerinden geçer. WLO'lar KRT5 (bazal), SCGB3A2 (club) ve MUC5AC (goblet) belirteçlerini ifade eden hava yolu epitel hücrelerinin yanı sıra HOPX (alveolar tip I) ve SP-C'yi (alveolar tip II) ifade eden alveolar epitel hücrelerine sahiptir. Düz kas aksin (SMA) ve trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü A (PDGFRα) dahil olmak üzere mezenkimal hücreler de mevcuttur. iPSC türevi WLO'lar aylarca 3D kültür koşullarında tutulabilir ve belirli bir hücre popülasyonunun saflaştırılması için yüzey belirteçleri için sıralanabilir. iPSC türevi WLO'lar, akciğer epitel ve mezenkim arasındaki sinyaller de dahil olmak üzere insan akciğer gelişimini incelemek, insan akciğer hücresi fonksiyonu ve gelişimi üzerinde genetik mutasyonları modellemek ve enfektif ajanların sitotoksikliğini belirlemek için de kullanılabilir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62456/62456fig1v5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_...

Makalede, indüklenen pluripotent kök hücrelerin mezenkim ile birlikte hem proksimal hem de distal epitel akciğer hücrelerini içeren üç boyutlu tüm akciğer organoidlerine yönlendirilmiş adım bilgeliği açıklanmaktadır.

Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...

Bu protokol, insan akciğer hastalığını ve bir tabaktaki gelişimi modellemek için indüklenmiş pluripotent kök hücreleri akciğer hücrelerine ayırt etmek için kullanır. Bu protokol önemlidir, çünkü birincil insan akciğer dokusunu elde etmek ve kültüre etmek zordur. Akciğer hücrelerini pluripotent kök hücrelerden ayırt ederek temel avantajları, insan akciğer gelişimini ve hastalığını incelemek için sürekli olarak belirli akciğer hücrelerinin tedarik edilmesidir.Bu hücreler hücre kültüründe uzun süre korunabilir, gelecekteki uygulamalar için kriyoprezizonlanabilir ve gen mutasyonlarını incelemek için genetik olarak manipüle edilebilir. Prosedürü gösteren rachel McVicar olacak, laboratuvarımdan bir doktora adayı. Deneye başlamadan önce, azaltılmış bir büyüme faktörünü veya GFR'yi buz üzerinde bodrum membran matris ortamını yavaşça çözün ve eşit miktarda soğuk DMEM F12'de seyreltin.P1000 uçlarını kullanmadan önce soğuması için dondurucuya yerleştirin. Daha sonra, 12 kuyu plakasının her kuyusunu% 50 GFR bodrum membran matris ortamının 500 mikrolitresi ile kaplayın ve fazla orta karışımı ve kabarcıkları kuyulardan çıkarın. Kuyu plakalarını 20 dakika ayarlamak için ıslak buzun veya dört santigrat derecede bir buzdolabının üzerine yerleştirin, ardından plakayı bir gecede 37 santigrat derece inkübatöre taşıyın.Yüksek PSE'ler %70 izdiah süresine ulaştığında, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere 10 mikromoler ROCK inhibitörü Y27632 ekleyin ve ayrışmadan önce bir saat bekleyin. Ortamı emiş edin ve hücreleri PVS ile bir kez yıkayın. Kuyu başına 500 mikrolitre hücre ayırma ortamı ekleyerek IPSC'leri ayrıştırın ve %5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra kuyu başına 500 mikrolitre kök hücre geçirme ortamı ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için P1000 ucu kullanarak hücreleri hafifçe pipetler. Daha sonra ayrışmış hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe ve santrifüje 300 kez G.Santrifüjasyonu takiben beş dakika boyunca aktarın, ortamı epire edin ve hücre peletini 10 mikromoler ROCK inhibitörü ile desteklenmiş bir mililitre mTeSR Plus medya ile yeniden biriktirin.Hücreleri saydıktan sonra, 12 kuyu GFR orta kaplamalı plakanın her kuyusuna beşinci IPSC'lere iki kez 10 ekleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kesin endoderm veya DE indüksiyon ortamı eklemeden önce mTeSR Plus'ı aspire edin. İkinci ve üçüncü günlerde DE indüksiyon medyasını değiştirin.Dördüncü gün, DE indüksiyon ortamını serumsuz bazal ortamla değiştirerek AFE indüksiyona başlayın. Altıncı günün sonunda AFE verimliliğini analiz etmeden önce üç gün boyunca AFE ortamını günlük olarak değiştirin. Yedinci günde, GFR bodrum membran matris ortamını daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde çözün.Aynı zamanda, AFE medyasını aspire ederek ve kuyuları PVS ile yıkayarak akciğer progenitör hücre farklılaşmasına devam edin. Kuyuya bir mililitre hücre müfreze çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre ayırma çözeltisi içeren Kuyulara bir mililitre söndürme ortamı ekleyin.Yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yaparak hücreleri agrega olarak tutun. Tüm hücrelerin yerinden olduğundan emin olun, ancak beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için. Üstnatant çıkarın ve hücre peletini LPC indüksiyon ortamında yeniden diriltin.Hücreleri sayın ve 100 mikrolitre soğuk GFR bodrum membran matrisi ortamına beşinci hücrelere 2,5 çarpı 10 ekleyin ve iyice karıştırın. Bir damlayı 12 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, kuyu başına bir mililitre LPC ortamı ekleyerek orta düşüşün tamamen suya batırılıp gece boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatmasını sağlayın.Sekizinci günde, ROCK inhibitörü Y27632'yi çıkarmak için LPC ortamını değiştirin. Medyayı her gün değiştirmeye devam edin ve 16. 17. günde kuyuları yıkayın ve mililitre dispaz başına iki mikrogramdan 500 mikrolitre ekleyin.Dispaz karışımını bir P1000 pipet ile pipetleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın, ardından karışımı pipetleyin ve 15 dakika daha kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, kuyuları içeren dispaziye söndürme ortamlarından bir mililitre ekleyin ve hücreleri konik tüplere aktarın. Santrifüjleyin ve peleti bir mililitre soğutulmuş PVS'de yeniden diriltin, ardından santrifüjü tekrarlayın.Daha sonra peleti bir mililitre hücre ayırma ortamına yeniden ayırın. Hücreleri 37 santigrat derecede 12 dakika kuluçkaya bırakın, ardından eşit miktarda söndürme ortamı ve santrifüj ekleyin. Peletin bir mililitre söndürme ortamı ve 10 mikromoler ROCK inhibitörü Y27632'de yeniden dürt.Kuyu başına sekiz kez 10 ila dördüncü hücreleri elde etmek için gereken birimi hesaplamak için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Daha sonra aliquot, 1,5 mililitre mikro santrifüj tüplerine LPC hücre agregalarının hacmini ve 300 kez beş dakika boyunca santrifüj gerektirir G.Hücre peletini karıştırmadan fazla süpernatantı çıkarın ve 10 mikrolitre artık ortam bırakın. Hücre peletini 200 mikrolitre soğuk GFR bodrum membran matrisi ortamına yeniden depoleyin ve hücreleri hücre kültürü membran uçlarına aktarın.30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Kuluçkadan sonra, kesici ucun bazolateral odasına bir mililitre 3D organoid indüksiyon ortamı ekleyin ve altı gün boyunca her gün taze ortamla değiştirin. 23. günde, ortamı 3D dallanma ortamına geçirin, ardından altı gün boyunca her gün ortamı değiştirin.29. günde, 3D olgunlaşma ortamına geçin ve önümüzdeki altı gün boyunca ortamı iki günde bir değiştirmeye devam edin. DE indüksiyonunun dördüncü gününde, bağlı hücreler kompakt bir parke taşı morfolojisi gösterir. Çekirdekle kaplanmış kesin endoderm belirteçleri CXCR4 ve SOX17 ifade edildi ve endodermal farklılaşma doğrulandı.Ön ön indüksiyon, daha sıkı sıkıştırılmış hücreler gösteren morfoloji ile yedinci günde doğrulandı ve FOXA2 ve SOX2 belirteçleri çekirdekle kaplandı. 3D akciğer progenitör hücrelerinin üretimi 3D sferoidler ve bir muhabir hücre hattında NKX2-1 GFP'nin endojen ekspresyonu ile doğrulandı. Üç haftalık bir farklılaşmadan sonra tüm akciğer organoidlerine, akciğer belirteçleri immünostokimya ile analiz edildi.Organoidlerde çekirdeklerin kaplatığı morfogenez SOX2 ve SOX9 dallanma belirteçleri gözlendi. Bazal hücrelerin her ikisi de belirteç olan proksimal akciğer belirteçleri P63 ve KRT5, kulüp hücreleri için bir belirteç olan SCGB3A2 ile birlikte başarıyla tespit edildi. Distal akciğer belirteçleri Alveolar Tip II hücreleri için Pro SPC ve SPB belirteçlerini indükler.Ve Alveolar Tip I hücrelerinin HOPX işaretleyicileri. Ek olarak, NKX2-1 ve ZO1 çekirdeklerle kaplanmış olarak ifade edildi. Sox9 ile birlikte ifade edilen fibroblastlar için bir belirteç olan Mezenkime akciğer hücresi belirteçleri PGFR Alpha distal mezenkimi temsil etti.Vimentin de ifade edildi ve akciğere dağıldı. Bu işlemden sonra akciğer organoidlerine indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş endotel ve immün hücreler ile yatırım yapılabilir. Akciğer gelişimi ve hastalığı, epitel ve mezenkimal hücre popülasyonları arasında bir sinyalle ortaya çıkar, aynı zamanda endotel hücrelerinden ve makrofajlardan da kaynaklanır.3D akciğer dokusu modeli sistemi klinik olarak insan hastalığı ve terapötikleri incelemekle ilgilidir.

generation-3d-whole-lung-organoids-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Burada, biyolojik ve biyomedikal çalışmalarda 3D akciğer doku kültürleri modeli insan akciğer hastalıkları için oluşturmak için uygun özel dolu insan hassas kesim akciğer dilimleri rezeke hasta dokusundan hazırlanması için bir iletişim kuralı mevcut.

Hastalık modelleme için insan 3D akciğer doku kültürleri (3D-LTCs) nesil

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Burada, insan pluripotent kök hücrelerini kendi kendine örgütlenerek verimli bir şekilde kullanarak gelişimsel olarak ilgili insan kalbi organoidleri (hSO'lar) oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, gelişimsel ipuçlarının sıralı aktivasyonuna dayanır ve son derece karmaşık, işlevsel olarak ilgili insan kalp dokuları üretir.

Pluripotent Kök Hücrelerden Elde Edilen Kendi Kendine Monte Edilen İnsan Kalbi Organoidlerinin Üretilmesi

Protokol, insan akciğer organoidlerini birincil akciğer dokularından türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve insan hava yolu epitelini sadık bir şekilde fenotoskopik eden 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir yöntem sunar.

Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması

Bu protokol, kimyasal karsinogenez yoluyla indüklenen normal, preneoplastik ve skuamöz hücreli karsinom lezyonlarını temsil eden murin oral-özofagus 3D organoidlerini üretmek ve karakterize etmek için anahtar adımları açıklamaktadır.

3D Organoidlerde Oral-Özofagus Skuamöz Hücreli Karsinomun Modellenmesi

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Burada besleyici hücreler olmadan lentiviral sistemi kullanılarak, hastaya türetilmiş fibroblast benzeri sinoviyositler insan kaynaklı-pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Romatoid Artrit Hastalarının Mafsallar İzole fibroblast benzeri sinoviyosit kullanma Kaynaklı-pluripotent Kök Hücre Üretimi

Bu protokolün amacı, melanom tümörüne sızan lenfositlerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanması için protokolü göstermektir.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Keşfedin, insan iPS hücrelerinden 3D akciğer organoidleri üretme protokolünü. Bu yöntem, akciğer gelişimi ve hastalıklarının in vitro modellenmesi için yenilenebilir bir platform sunar.

Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi (Video) | JoVE Journal

Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi

Daha fazla video keşfet