Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Zebra balığı karaciğer kanseri modellerimiz ve protokolümüz, intravital mikroskopi kullanarak karaciğer mikroçevresini ve bağışıklık manzarasını invaziv olmayan bir şekilde in vivo olarak görselleştirmek için eşsiz bir fırsat sunar. Zebra balığı larvalarının şeffaflığı şüphesiz bu sistemin temel avantajıdır, bu da invaziv olmayan intravital mikroskopi yapmamıza ve karaciğer gibi derin bir doku ve organın mikro çevre ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu hakkında fikir edinmemize olanak tanır. Diyete bağlı nefrotik modelimiz ve bu protokolde açıklanan görüntüleme teknikleri, metabolik sendrom ve kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere diğer karaciğer hastalıklarında veya araştırma alanlarında kıvrımlı hücre-hücre etkileşimlerine kolayca uygulanabilir.

Prosedürü gösterenler, laboratuvar teknisyenimiz Cassia Michael ve laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Francisco Juan Martinez-Navarro olacak. Başlamak için, zebra balığı larvaları için dört gram ticari kuru gıda diyetini, biri normal diyet için, diğeri % 10 yüksek kolesterol diyeti veya HCD için olmak üzere iki adet 25 mililitrelik cam beherde tartın. 10 mililitrelik bir cam beherde 0,4 gram kolesterol tartın ve beheri folyo ile örtün.

Bir duman davlumbazında, 20 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak beş mililitre dietil eter ölçün. Daha sonra, dietil eteri normal diyet kabına ekleyin ve hemen bir spatula kullanarak kuru yiyeceklerle karıştırın. Aynı şırınga ve iğneyi kullanarak beş mililitre dietil eter daha ölçün ve HCD içeren beherin içine ekleyin.

Şırınga ile yukarı ve aşağı aspire ederek hemen karıştırın. Kolesterol çözeltisini HCD kabına hızlı bir şekilde ekleyin ve çözelti düzgün olana kadar hemen bir spatula ile karıştırın. Dietil eteri tamamen buharlaştırmak için beherleri kaputta 24 saate kadar bırakın.

Ertesi gün, diyetleri bir havane ve harç kullanarak ince parçacıklar halinde öğütün. Her diyeti küçük, etiketli bir plastik torbaya veya 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Birinci günde eksi transgenik balık hatları kurun.

Sıfır gününde, balıklar yumurtladıktan sonra bir ağ süzgeçte yumurta toplayın. E3'lü bir yıkama şişesi kullanarak, yumurtaları iyice durulayın ve dikkatlice E3 orta boy 10 santimetrelik Petri kaplarına aktarın. Mikroorganizmaların kontrolsüz büyümesini ve larva gelişiminde ortaya çıkan kusurları önlemek için ölü veya döllenmemiş yumurtalar da dahil olmak üzere üreme kutularında birikmiş olabilecek tüm kalıntıların plakalarını temizleyin.

Daha sonra yumurtaları, 25 mililitre E3 içeren yemek başına 70 veya 80 yumurta yoğunluğunda bölün. İlk gün, ölü embriyoları veya gelişimsel kusurları olan embriyoları, bir transillumination tabanı ile donatılmış bir diseksiyon kapsamı altında kontrol edin ve temizleyin. Beşinci günde, tüm yemeklerden larvaları 15 santimetrelik bir Petri kabında birleştirin ve metilen mavisi olmadan E3 ekleyin. Larvaları besleme kutularına bölün ve metin el yazmasında açıklandığı gibi besleyin.

Larvaları zebra balığı odasında veya bir inkübatörde karanlık-ışık döngüsünde 28 santigrat derecede tutun ve 5. günden 12. güne kadar günde iki kez besleyin. Bir mililitrelik pipet ucuna bağlı bir vakum sistemi kullanarak gıda artıklarını günlük olarak ve ortamın %90 ila 95'ini temizleyin. Ardından, larvalara zarar vermemek için metilen mavisi içermeyen yeni E3'ü dikkatlice besleme kutusunun bir köşesine dökün.

Alternatif olarak, larvalar sistem suyu ile üç litrelik tanklara bölünebilir ve düşük su akışına sahip bağımsız bir sistem ünitesi olarak yerleştirilebilir. Bu alternatif, günlük temizlik işlemi için gereken zamandan tasarruf sağlar ve filtreleme sistemi larvaların son noktaya kadar sağlıklı kalmasına yardımcı olur. 13. günde, kurulan deneysel koşulların sayısına göre toplama yemekleri hazırlayın.

Her yemeğin altını örtmek için metilen mavisi olmadan yeterince E3 dökün. Daha sonra, dikkatli bir şekilde, vakum sistemini kullanarak, suyu besleme kutularından aspire edin. Su seviyesi düşmeye başladığında, larvaların köşelerden birine yüzmesini sağlamak için besleme kutusunu yavaşça kaldırın, ardından ters yönde aspire edin.

Sıvının sadece yaklaşık 20 ila 30 mililitresi kaldığında, larvaları hazırlanan koleksiyon Petri kabına dikkatlice boşaltın ve etiketli bandı besleme kutusundan tabağın kapağına yerleştirin. Bir floresan stereomikroskopta, istenen floresan belirteçleri için anestezi altındaki larvaları tarayın. Daha sonra yaralama ve tuzak cihazının odalarına trikain E3 ekleyin.

Hava kabarcıklarını odalardan ve kısıtlama kanalından bir P-200 mikropipet kullanarak çıkarın. Tüm fazla trikain E3'ü çıkarın, sadece odaları doldurmak için yeterli hacim bırakın. Daha sonra, anestezi uygulanmış bir larvayı yaralama ve tuzak cihazının yükleme odasına aktarın ve bir kirpik aleti kullanarak sol lobun görüntülenmesi için konumlandırın.

Metin yazısında açıklandığı gibi karaciğerdeki gerekli tüm hücrelerin morfolojisini konfokal mikroskop altında görüntüleyin. Fiji yazılımını açın. Ardından görüntü dosyasını açın ve Kanalları böl Bio-Format İçe Aktarma Seçenekleri sekmesinden seçenek.

Her kanal için maksimum yoğunluk projeksiyonları oluşturduktan sonra, larva karaciğerini çevreleyen bir ROI oluşturun ve karaciğer alanını ölçün. Ardından, referans olarak bir ölçek çubuğu ekleyin ve karaciğer alanını ve çevredeki alanın 75 mikrometresini içeren ikinci bir yatırım getirisi oluşturun. Eklentiler menüsünde, Analiz Et seçeneğini ve ardından Hücre Sayacını seçin ve işe alım alanındaki bağışıklık hücrelerini sayın.

İşe alınan bağışıklık hücrelerinin sayısını bir elektronik tabloya kaydedin. Karaciğer alanı başına düşen bağışıklık hücresi sayısını normalleştirerek nötrofil, makrofaj ve T hücresi yoğunluklarını hesaplayın. Normal bir diyetle beslenen HCC zebra balığı larvaları, Yağ Kırmızı O boyama ile ölçüldüğü gibi hepatik steatoz göstermez.

Bununla birlikte, HCD ile beslenen HCC larvaları, hepatik steatozda önemli bir artış göstermektedir. Kolesterol fazlalığına sekiz gün maruz kaldıktan sonra, HCC larvalarında karaciğer büyümesi gözlendi. Hepatomegali değerlendirmek için karaciğer alanı, karaciğer yüzey alanı ve karaciğer hacmi değerlendirildi.

Alkolsüz steatohepatit ilişkili HCC'de, hepatosit alanı, nükleer alan ile birlikte ve nükleer-sitoplazmik oran artmıştır. Yüksek yağlı diyetle beslenen HCC grubunda nükleer döngüsellikte de önemli bir azalma gözlenmiştir. H2B-mCherry belirteci kullanılarak, HCD ile beslenen HCC larvalarında daha büyük bir mikroçekirdek insidansı tespit edildi.

Hepatik vaskülatür değerlendirmesi, HCD ile beslenen HCC larvalarında damar yoğunluğunda anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir. HCD larvaları ile beslenen hem HCC hem de HCC'de makrofajların ve nötrofillerin infiltrasyonu meydana geldi. Karaciğer ve çevresindeki makrofajlardaki nötrofillerin miktarı, HCD ile beslenen HCC larvalarındaki hücrelerin sayısında ve yoğunluğunda önemli bir artış göstermiştir.

Buna karşılık, HCD ile beslenen HCC larvalarında toplam sayıda T hücresi yoğunluğunda anlamlı bir azalma gözlenmiştir. Tankların temizlenmesi ve beslenmesi, larvaların yaşayabilirliğini sağlamak ve suyun kalitesizliği veya yanlış beslenme nedeniyle kontrollerde steatoz veya karaciğer ve sistemik kronik inflamasyon gelişmesini önlemek için en önemli adımlardır. Hızlandırılmış mikroskopi ve karaciğeri dolduran farklı hücreler arasındaki etkileşimin analizi gibi diğer yöntemler de yapılabilir.

Ek olarak, farklı karaciğer kanseri evrelerinde disseke edilmiş karaciğerlerin tek hücreli RNA araması, karaciğer bağışıklık manzarasının hastalık progresyonu ile nasıl geliştiğini tam olarak anlamak için gerçekleştirilebilir.