Name: In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Keşfedin, fare kemik iliğindeki megakaryositlerin ultra yapısını in situ iletim elektron mikroskopisi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, hücre gelişimini yerel ortamında yüksek çözünürlükle incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar teknik yardım için Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund'a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Avrupa Birliği tarafından Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) ve Grant ANR-17-CE14-0001-01 tarafından H.d.S.'ye desteklendi.

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). protokol şematik olarak Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Kemik iliği toplama ve sabitleme ( Şekil 1A)
DİkKAT: Bu prosedür kanserojen, mutajenik ve/veya toksik maddeleri içerir ve kimyasal ekstraksiyon başlığı altında gerçekleştirilir. Eldiven ve koruma gözlüğü gibi uygun koruyucu ekipmanları giyin.
<ol><li>Cacodylate tamponunda% 2.5 glutaraldehitden oluşan fiksatif çözeltiyi hazırlayın(bkz. Ek Dosya).</li>
	<li>Kemik iliği toplama<ol>
<li>Her iki cinsiyette de yetişkin C57BL / 6 fareleri kullanın 12-18 haftalık. Fareleri CO2 boğulma ve servikal çıkık ile ötenazi.</li>
		<li>Bir çift ince makasla, uyluğun etrafındaki cildi kesin ve cildi soymak için cımbız kullanın. Pençenin ekstremitesini çıkarın ve ardından kalça ve uyluk arasında kesin. Diz eklemlenmesinde keserek kaval kemiğini uyluk kemiğinden ayırın ve neşter kullanarak kaval kemiği ve uyluk kemiği üzerindeki yapışık dokuyu çıkarın.</li>
		<li>Epifizleri keskin bir jiletle çıkarın. Uyluk kemiğini cımbızla tutarken, kemik iliğini 2 mL kakodylat tamponu ile dolu 15 mL'lik bir tüpe yıkamak için 21 G iğneli kakodylat tamponu ile dolu 5 mL şırınga kullanın. Bunu yapmak için, iğnenin eğimini kemik iliği açıklığı içine yerleştirin ve ilik dışarı atılana kadar pistona yavaşça bastırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fiksatif içine hızlı daldırma ile kemik iliği fiksasyonu.<ol>
<li>Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirini oda sıcaklığında 60 dakika boyunca 1 mL taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine (daha önce 1,1'de hazırlanmış) aktarmak için plastik bir pipet kullanın. NOT: Dokuyu korumak için kemik diseksiyonundan fiksasyon adımına kadar tüm işlemin 10 dakikadan kısa sürede tamamlandığından emin olun. Fiksasyon için, ısı şokunu önlemek için fiksatif çözeltinin oda sıcaklığında olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kemik iliğini agarose içine gömmek
NOT: İlik dokusu farklı yıkama adımları sırasında bütünlüğünü korumak için yeterince uyumlu değildir ve malzeme kolayca kaybolabilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ilik dehidrasyondan önce bir agar jeli ile kaplanır.
<ol><li>Agarose çözeltisini Ek Dosya 'da açıklandığı gibi hazırlayın.</li>
	<li>Bölüm 1.3'teki sabit iliği kaktüs tamponunda yıkayın ve plastik bir pipet kullanarak dikkatlice cam bir slayda aktarın. Ilık bir pipet kullanarak, kemik iliği silindirine hızlı bir şekilde% 2 sıvı agar damla uygulayın. NOT: Agar soğurken hızlı bir şekilde katılanın. Kemik iliğinin homojen bir şekilde kaplanmasını sağlamak için, agar çözeltisinin kaydırağa birikene kadar sıcak tutulması gerekir.</li>
	<li>Agar katılanıncaya kadar (1-2 dk) kaydırağı hızla buza yerleştirin.</li>
	<li>Mikroskop altında, bu bölgelerdeki olası doku sıkışması nedeniyle kemik iliği silindirinin ekstremitelerini kesmek ve atmak için keskin bir jilet kullanın. İlik bloklarını 1 mL kakadodylat tampon içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.</li>
</ol>3. Kemik iliğini reçineye gömmek
DİkKAT: Reçine bileşenleri toksiktir; bazıları kanserojendir ve kimyasal ekstraksiyon başlığı altında özenle ele alınmalıdır. Eldiven ve koruma gözlüğü gibi uygun koruyucu ekipmanları kullanın. Osmiyum tetroksit oda sıcaklığında oldukça uçucudur ve buharları göz, burun ve boğaz için çok zararlıdır. Atılmadan önce, % 2 osmiyum tetroksit, bitkisel yağ hacminin iki katı eklenerek nötralize edilmelidir.
<ol><li>Ek Dosya 'da açıklandığı gibi epoksi reçinesini hazırlayın.</li>
	<li>Reçine gömme NOT: Osmiyum, uranil asetat ve etanol ardışık banyolarda inkübasyonlar sırasında numuneleri aynı mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Üstleri pasteur pipetle aspire edin. Her banyo için kullanılan çözelti hacmi, numunenin hacminin en az 10 katını eşit olmalıdır.<ol>
<li>Blokları 4 °C'de 1 saat boyunca kaktüs tamponunda% 1 osmiyum ile sabitle, bir kez cacodylate tamponunda ve sonra bir kez damıtılmış suda yıkayın.</li>
		<li>Damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile 1 saat leke, damıtılmış suda iki kez yıkayın.</li>
		<li>Damıtılmış suda dereceli bir etanol serisinden susuzluk: 5 dakika boyunca% 75 etanolde 4 kez, ardından 20 dakika boyunca% 95 etanolde 3 kez ve ardından 20 dakika boyunca% 100 etanolde 3 kez. Bu adımda, dondurucudan bir şırınna epoksi reçinesi alın. NOT: Protokol 1 saat boyunca% 100 etanolde duraklatılabilir.</li>
		<li>İliğin içindeki epoksi reçinesinin tek tip infiltrasyonunu ve polimerizasyonunu elde etmek için, önce 15 dakika boyunca 2 ardışık propilen oksit banyosundaki blokları kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>% 100 propilen oksit ve epoksi reçine karışımı ekleyin ve 1 saat kuluçkaya yatırın. Numuneleri oda sıcaklığında yavaş bir döner çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
		<li>% 100 epoksi reçine ekleyin, numuneyi ajitasyon altında gece kuluçka için bırakın.</li>
		<li>2 saat inkübasyon için% 100 epoksi reçine ekleyin, hala ajitasyon altında.</li>
		<li>Mikroskop altında, ilik bloklarını düz silikon kalıplara yerleştirin. Tüm kemik iliğinin daha sonra transversal kesitlerine izin vermek için örnekleri yönlendirin. Kalıpları epoksi reçine ile doldurun ve 48 saat boyunca 60 ° C'ye yerleştirin. NOT: Numunelerin kirlenmesini önlemek için tüm çözeltiler (etanol ve propilen oksit hariç) 0,22 μm filtreden süzülür. Reçinenin yeterli polimerizasyonunu sağlamak için kalıpları doldururken kabarcıklardan kaçının.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ultra ince kesitleme (Şekil 1B)
NOT: İletim EM, elektronların hücrelerin iç kısmının, yapısının ve iç organellerin (granüller, endoplazmik retikulum, Golgi) organizasyonu ve hücre içi hücre zarlarının düzenlenmesinin projeksiyon görüntüsünü oluşturabileceği ince doku bölümleri gerektirir.
<ol><li>Numune bloğunu ultra mikrotom desteğine monte edin. Örnek tutucuya koy. Dönen bir elmas veya tungsten frezeleme kesicisi ile doku etrafındaki reçine fazlalığını gidermek için numuneleri 45 ° 'de kırpın.</li>
	<li>Numuneleri su tankı ile donatılmış elmas bıçak bıçağı ile ultramikrotom üzerine monte edin. Histolojik ve TEM analizleri için sırasıyla 500 nm ve 100 nm kalınlığında enine kesitler kesin. Su yüzeyinde yüzen bölümleri bir döngü ile toplayın.</li>
	<li>500 nm kalınlığındaki bölümü cam bir kaydırağa ve 100 nm kalınlığındaki bölümleri altında kağıt filtre bulunan 200 örgü ince çubuk bakır ızgaralara yatırın. Bir koşul için beş ızgara hazırlayın: önce iki ızgarayı lekelenin ve gerekirse kalan üç ızgarayı yedek olarak tutun.</li>
</ol>5. Histoloji için Toluidin mavi boyama
NOT: Histoloji için lekeleme bölümleri üç nedenden dolayı önemlidir: 1) reçinenin değil, dokunun gerçekten kesildiğinden emin olmak, 2) inklüzyonun kalitesini kontrol etmek ve 3) ilik örneğini hızlı bir şekilde değerlendirmek. Bu doğru değilse, bloğun daha derinini kesin.
<ol><li>Yarı ince bölümleri bir ısı plakasında (60 °C) kaydırın.</li>
	<li>Slaytlara damıtılmış suya filtrelenmiş% 1 toluidin mavisi / % 1 sodyum borat ekleyin ve 1-2 dakika boyunca sıcak bir plakada (60 ° C) ısıtın. Slaytları damıtılmış suyla yıkayın ve ısı plakasında kurumasına izin verin.</li>
	<li>Bölümleri bir damla Poli (butil methakrilat-co-metil methakrilit) montaj ortamı ile kapaklara monte edin ve hafif bir mikroskop altında inceleyin.</li>
</ol>6. TEM gözlemi için ağır metal boyama (Şekil 1C)
NOT: Kontrast için, ızgaraların üst tarafı, ardışık her banyonun 100 μL damlasına bir döngü ile ters çevrilir. Kullanmadan önce, her çözelti 0,22 μm filtrelenmiştir. Bir filtre kağıdı üzerinde ızgara tarafına hafifçe temas derek her banyo arasındaki fazla sıvıyı çıkarın.
<ol><li>5 dakika boyunca damıtılmış suda% 4 uranil asetat ile leke.</li>
	<li>Damıtılmış suda 3 kez 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>3 dakika boyunca kurşun sitratlı leke.</li>
	<li>Damıtılmış suda 3 kez 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Izgaraları kurumasını sağlamak için filtre kağıdıyla temas halinde alt tarafa yatırın. NOT: Ağır metaller karbondioksit varlığında reaksiyona sokur. Çökeltmeleri en aza indirmek için kontrast sırasında havanın yer değiştirmesini önleyin, konuşmayın, ortamı sakin tutun ve klimayı kapatın.</li>
</ol>7. TEM (Şekil 1E)
NOT: Bölümler TEM mikroskopunda tanıtılır ve 120 kV'da incelenir.
<ol><li>İlk olarak, preparatın genel yönünü takdir etmek için düşük büyütmedeki bölümleri (< 500x) inceleyin (reçinede delik olmaması, bölümlerde kıvrımlar / sıkıştırma, lekelenme nedeniyle çökeltiler).</li>
	<li>Daha sonra bölümleri daha yüksek büyütmede inceleyin (~ olgunlaşma aşamasını ayırt etmeye izin vererek~ 2000x). Olgunlaşmanın her aşamasındaki megakaryositleri tüm transversal bölümler üzerinde manuel olarak sayın (bkz. Her aşamanın görsel olarak nasıl tanımılacağına ilişkin Temsili Sonuçlar). NOT: Izgaraların her karesi inceleme alanı olarak tanımlanır (200 örgü bakır ızgara için 16000 μm2'ye eşittir).</li>
	<li>Megakaryosit sayısını değerlendirmek için, yalnızca bir bölümle tamamen kaplı kareleri ölçün. Bunu yapmak için aralıkların taranmasını temel alan bir model kullanın. Bölümün bir ekstremitesinden diğerine, daha sonra aynı şekilde başka bir aralık vb. Bu prosedürü kullanarak, tüm ilik transversal bölümünü kare kare tarayın.</li>
	<li>Her kare için Aşama I, II veya III megakaryosit sayısını puanla. NOT: Granülleri, DMS organizasyonunu, sitoplazmik bölgelerin boyutunu ve polilobulatlanmış çekirdeği analiz etmek için daha yüksek büyütmeler gereklidir.</li>
</ol>

<ol><li>Machlus, K. R., Italiano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+incredible+journey%3A+From+megakaryocyte+development+to+platelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation.</a> The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).</li>
<li>Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+the+megakaryocytes+of+patients+infected+with+the+human+immune+deficiency+virus+%28HIV-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1).</a> American Journal of Pathology. 134 (6), 9(1989).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+demarcation+membrane+system+%28DMS%29+in+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes.</a> Blood. 123 (6), 921-930 (2014).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. , 1-10 (2020).</li>
<li>Behnke, O., Forer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+megakaryocytes+to+platelets%3A+platelet+morphogenesis+takes+place+in+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream.</a> European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets+and+Megakaryocytes%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+membrane+extrusion+sites+drive+megakaryocyte+migration+into+bone+marrow+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels.</a> Life Science Alliance. 1 (2), 201800061(2018).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+use+in+vivo+podosome-like+structures+working+collectively+to+penetrate+the+endothelial+barrier+of+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024(2020).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivesicular+Bodies+Are+an+Intermediate+Stage+in+the+Formation+of+Platelet+%CE%B1-Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules.</a> Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).</li>
<li>Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emperipolesis%2C+entosis+and+cell+cannibalism%3A+Demystifying+the+cloud%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92(2017).</li>
<li>Centurione, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+pathologic+emperipolesis+of+neutrophils+within+megakaryocytes+associated+with+marrow+fibrosis+in+GATA-1low+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice.</a> Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Megakaryositlerin kendi ortamlarında doğrudan incelenmesi, megakaryopoez ve trombosit oluşumunu anlamak için gereklidir. Bu yazıda, kemik iliğinde gerçekleşen megakaryosit morfogenezinin tüm sürecinin morfoloji özelliklerini yerinde inceleyerek kemik iliği yıkama ve fiksasyonunu daldırma ile birleştiren bir iletim elektron mikroskopi yöntemi sunuyoruz.
Kemik iliğinin yıkanması bu yöntemin kritik bir adımıdır, çünkü yüksek kaliteli bir yıkamanın başarısı operatörün uygulamasına ve eğit...

Megakaryositler, kemik iliğinde lokalize, trombosit üretiminden sorumlu özel büyük poliploid hücrelerdir1. Sitoplazma ve çekirdek2'dekapsamlı eşlik eden morfolojik değişikliklere uğrarken, megakaryosit öncüllerinin giderek arttığı karmaşık bir olgunlaşma süreci yoluyla hematopoetik kök hücrelerden kaynaklanırlar. Olgunlaşma sırasında, megakaryositler aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi ayırt edilebilir yapısal eleman geliştirir: polilobürlenmiş bir çekirdek, sınır membran sistemini (DMS) oluşturan yüzey zarının invaginasyonları, aktin bazlı sitoskeletal ağ ile çevrili organellerden yoksun bir periferik bölge ve α granüller, yoğun granüller, lizozomlar ve çoklu Golgi kompleksleri dahil olmak üzere çok sayıda organel. Ultrayapı düzeyinde, gözlenen önemli bir değişiklik, DMS3tarafından sınırlandırılan ayrık bölgelere sitoplazmik bölmelemedir. Bu geniş membran kaynağı, trombosit üretiminin ilk aşamasında uzun sitoplazmik süreçlerin uzatılmasını körükleyecek ve daha sonra sirkülasyonun içindeki trombositlere dönüşecektir. Megakaryosit farklılaşması ve olgunlaşması sırasındaki herhangi bir kusur trombosit sayısı ve/veya trombosit fonksiyonu açısından trombosit üretimini etkileyebilir. 
İnce tabaka iletim elektron mikroskopisi (TEM), trombopoezis4,5fizyolojisi anlayışımızı şekillendiren megakaryositlerin yüksek kaliteli ultrayapısını sağlayan onlarca yıldır tercih edilen görüntüleme yaklaşımıdır. Bu makale, herhangi bir kemik iliği hücre tipini analiz etmek için de temel teşkil edebilecek, yerli kemik iliği mikroçevriminde in situ meydana gelen trombosit biyogenez sürecini yakalamaya izin veren standartlaştırılmış bir TEM yöntemine odaklanmaktadır. Sitoplazmik süreçleri sinüzoidlerin mikrosirkülasyonuna genişleten olgunlaşmamışlıktan tamamen olgunluğa kadar megakaryositlerin gelişiminin ultrayapısal örneklerini sunuyoruz6. Ayrıca, kemik iliğinin rejenerasyon ve trombosit üretim kapasitesi konusunda talimat veren farklı megakaryosit olgunlaşma aşamalarını ölçmek için kolay bir prosedür açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>2,4,6-Tri (dimetilaminometil) fenol (DMP-30)</td> <td>Ladd Araştırma Endüstrileri, ABD</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz tipi LM-3 Düşük Erime Noktalı Agar</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri, ABD</td><td>1670-B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Kalsiyum klorür hekzahidrat</td><td>Merck, Almanya</td><td>2083</td><td></td></tr><tr><td>Bakır ızgaralar 200 gözenekli ince çubuk</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientifics, İngiltere</td><td>T200-CU</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilarsinik asit sodyum tuzu trihidrat</td><td>Merck, Almanya</td><td>8.20670.0250</td><td></td></tr><tr><td>Dodecenyl Süksinik Anhidrit (DDSA)</td><td>Ladd Research Industries, ABD</td><td>21340</td><td></td></tr><tr><td>Çift Kenarlı Paslanmaz Tıraş Bıçağı</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri-EMS, ABD</td><td>EM-72000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR Uluslararası, Fransa</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>Filtresi kağıt, 90 mm çap</td><td>Whatman, İngiltere</td><td>512-0326</td><td></td></tr><tr><td>Düz gömme silikon kalıp</td><td>Oxford Instrument, Agar Scientific, İngiltere</td><td>G3533</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehit %25</td> <td>Elektron Mikroskobu Sciences-EMS, ABD</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Isı plakası Leica EMMP</td><td>Leica Microsystems GmbH, Avusturya</td><td>705402</td><td></td></tr><tr><td>Histo Elmas Bıçak 45&deg;</td><td>Diatome, İsviçre</td><td>1044797</td><td></td></tr><tr><td>JEOL 2100 Plus TEM mikroskobu</td><td>JEOL, Japonya</td><td>EM-21001BU</td><td></td></tr><tr><td>Kurşun sitrat - Ultrostain 2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Avusturya</td><td>70 55 30 22</td><td></td></tr><tr><td>LX-112 reçine</td><td>Ladd Araştırma Endüstrileri, ABD</td><td>21310</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Sigma, Fransa</td><td>M2393-100g</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı - Poli (bütil metakrilat-ko-metil metakrilat)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri-EMS, ABD</td><td>15320</td><td></td></tr><tr><td>Nadik Metil Anhidrit (NMA)</td> <td>Ladd Araştırma Endüstrileri, ABD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit 2%</td> <td>Merck, Almanya</td><td>19172</td><td></td></tr><tr><td>Propilen oksit (1.2-epoksipropan)</td> <td>Sigma, Fransa</td><td>82320-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Salin enjekte edilebilir çözelti % 0.9 NaCl</td><td>CDM Lavoisier, Fransa</td><td>MA 575 420 6</td><td></td></tr><tr><td>Neşter Cerrahi çelik bıçak</td><td>Swann-Morton,</td> <td>İngiltere.0508</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum tetraborat - Boraks</td><td>Sigma, Fransa</td><td>B-9876</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Merck, Almanya</td><td>84100-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi 0.2 ve mikro; m</td><td>Pall Corporation, ABD</td><td>514-4126</td><td></td></tr><tr><td>Toluidin mavisi</td><td>Ladd Araştırma Endüstrileri, ABD</td><td>N10-70975</td><td></td></tr><tr><td>Giyotin EM TRIM2</td><td>Leica Microsystems GmbH, Avusturya</td><td>702801</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome Ultracut UCT</td><td>Leica Microsystems GmbH, Avusturya</td><td>656201</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>Ladd Araştırma Sanayi, ABD</td><td>23620</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ İletim elektron mikroskopisi kullanılarak murine megakaryopoez keşfi

In Situ Exploration of Murine Megakaryopoiesis using Transmission Electron Microscopy

Megakaryositlerin farklılaşması ve olgunlaşması, kemik iliğinin hücresel ve hücre dışı bileşenleri ile yakın ilişki içinde ortaya çıkar. Bu işlemler, poliploid ve polilobulat çekirdek gibi megakaryosit sitoplazmasındaki temel yapıların, sınır membran sistemi (DMS) adı verilen bir iç membran ağının ve dolaşımdaki trombositlerde bulunacak yoğun ve alfa granüllerinin kademeli olarak ortaya çıkması ile karakterize edilir. Bu yazıda, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak murine megakaryositlerin yerinde ultrayapısal çalışması için standartlaştırılmış bir protokol açıklanmış haline getirilmiş ve kemik iliğindeki olgunlaşma evrelerini ve hücresel yoğunluklarını tanımlayan temel özelliklerin tanımlanmasını sağlamaktır. Kemik ilikleri yıkanır, sabitlenir, etanolde susuzlur, plastik reçineye gömülür ve kesitler oluşturmak için monte edilir. Histolojik ve TEM gözlemleri için sırasıyla yarı ince ve ince bölümler hazırlanır. Bu yöntem herhangi bir kemik iliği hücresi için, herhangi bir EM tesisinde kullanılabilir ve aynı fare üzerinde birkaç görüntüleme yaklaşımının kombinasyonuna izin sağlayan küçük örnek boyutları kullanma avantajına sahiptir.

Kemik iliği histolojisi Kemik iliği toluidin mavi histolojisinin hafif bir mikroskop altında gözlemlenmesi, doku kompaktlığı, mikrovessel sürekliliği ve megakaryositlerin büyüklüğü ve şekli açısından genel doku mimarisini hızlı bir şekilde analiz etmek için anahtardır (Şekil 1D). Kemik iliği bloğunda daha derin kesme ihtiyacını belirlemek için ultra ince bölümlerden önce gerçekleştirilir. Dev boyutları ve nükleer lobülasyonları nedeniyle, daha olgun megak...

Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.

In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Differentiation and maturation of megakaryocytes occur in close association with the cellular and extracellular components of the bone marrow. These ...

Bu prosedürün genel amacı, fare kemik iliği içinde bulunan megakaryositlerin ultra yapısını gözlemlemek ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskopisi kullanarak farklı olgunlaşma aşamalarını ölçmektir. Ana avantaj, bildiğimiz gibi tam olgunlaşma seviyesine ulaşmayan in vitro kültürlü megakaryositlerden farklı olan megakaryositlerin doğal ortamda doğrudan incelenmesidir. Tibia ve uyluk kemiğini standart protokollere göre 12 ila 18 haftalık C57BL/ 6 fareleri hasat ettikten sonra, her kemikteki epifizleri çıkarmak için keskin bir jilet kullanın.Her kemiği cımbızla tutarak, kemiğin bir ucuna kakodylat tamponu ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırıngaya bağlı 21 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve kemik iliğini iki mililitre taze kakadit tamponu içeren 15 mililitrelik bir toplama tüpüne yıkayın. Yıkamadan hemen sonra, kemik iliği silindirlerini oda sıcaklığında 60 dakikalık bir inkübasyon için bir mililitre taze glutaraldehit fiksatif çözeltisine aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Kemik iliğinin agarose'a gömülmesi için, sabit örnekleri taze kakadodylate tamponunda yıkayın ve kemik iliğini dikkatlice cam bir kaydırağa aktarmak için plastik bir pipet kullanın.Sıcak bir pip

in-situ-exploration-murine-megakaryopoiesis-using-transmission

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Monosit arteriogenesis periferik arter hastalığı bağlamında önemli arabulucu vardır. Bu iletişim kuralı bir membran benzeri matris ve intravital mikroskobu kullanarak, monosit enjeksiyon femoral arter ligasyonu fare modeli sonra monosit izleme ve tümör ile ilgili angiogenez inceler.

Monosit posta ve tümör ile ilgili angiogenez periferik arter hastalığı, bir fare modeli intravital mikroskobu

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Burada, megakaryosit farklılaşmasının karakterizasyonu için bir immünofenotyping stratejisi sunuyoruz ve bu stratejinin floresan ile aktive edilmiş bir hücre sıralayıcısı ile megakaryositlerin farklı aşamalarda sıralanmasına nasıl izin verdiğini gösteriyoruz. Metodoloji insan birincil dokularına uygulanabilir, aynı zamanda kültür in vitroundaüretilen megakaryositlere de uygulanabilir.

İnsan Birincil Kaynaklarından veya Hematopoetik Progenitörlerden Farklılaştırılmış In Vitro'dan İnsan MK'larının İmmünofenoping ve Hücre Sıralama

Burada hemostatik trombüs oluşumu için bir ponksiyon yarası prosedürü sunulmaktadır. Oluşan trombüsler büyüktür ve yüzlerce mikron çapındadır. Bu nedenle, hacim görüntüleme yaklaşımları uygundur. Geniş alanlı transmisyon elektron mikroskobunun birçok kişi için mevcut olan yüksek çözünürlüklü bir yaklaşım olarak monte edilmesini ve hazırlık protokolünü detaylandırmasını öneriyoruz.

Delinme Yara Hemostazı ve Montajlı Geniş Alan Elektron Mikroskobu Analizi için Örneklerin Hazırlanması

Keşfedin, fare kemik iliğindeki megakaryositlerin ultra yapısını in situ iletim elektron mikroskopisi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, hücre gelişimini yerel ortamında yüksek çözünürlükle incelemeyi sağlar.

In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Daha fazla video keşfet