Name: Fare Taze Kemik İliği Eksplantlarının Proplatelet Formasyon Dinamikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Keşfedin fare kemik iliği eksplantlarında proplatelet formasyonunu gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu hızlı ve tekrarlanabilir protokol, megakaryosit davranışlarını ve trombofilik hastalık mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert'e teknik yardım için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 ve ANR-18-CE14-0037 tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg).
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Tablo 1'de açıklandığı gibi reaktifleri hazırlayın.<ol>
<li>Stok I için her tozu ayrı ayrı çözün. Preparatın osmolaritesinin 295 mOsm/L'den yüksek olduğundan emin olun. Bu çözelti bir yıl boyunca 4 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>Tyrode'un tampon hazırlığı için, çözeltiyi Tablo 1'deaçıklandığı gibi yapın, hacmi damıtılmış su ile 100 mL'ye ayarlayın ve 0,1 g susuz D (+) sakkaroz ekleyin. Gerektiğinde 1 N HCl ve osmolarite kullanarak pH 7.3'e 295 mOsm/L'ye ayarlayın. Bakteri üremesini önlemek için 10 U/mL son konsantrasyonda penisilin G ve 0,29 mg/mL son konsantrasyonda streptomisin sülfat ekleyin. Son çözeltiyi 0,22 μm gözeneklerle filtreleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Deneysel kurulumun hazırlanması
<ol><li>Deney günü, Tirodun tamponu 37 ° C'de ısıtın ve sıcaklığı 37 ° C'ye getirmek için mikroskobun ısıtma odasını açın.</li>
	<li>Zamanlayıcı, kuluçka odaları, 5 mL şırıng, 21 G, forseps, jilet, Pasteur pipetler, cam kaydıraklar ve 15 mL santrifüj tüpü gibi gerekli tüm araçları hazırlayın(Şekil 1A).</li>
</ol>3. Fare kemik iliğinin izolasyonu
<ol><li>Co2 boğulma ve servikal çıkık ile 8-12 haftalık C57BL/6 fareleri ötenazi. Bu, yetkin ve nitelikli bir kişi tarafından hızlı bir şekilde yapılmalıdır.</li>
	<li>Mikrobiyal kontaminasyonu önlemek için, uyluk kemiğini çıkarmadan önce fare gövdesini% 70 (v / v) etanol içine batırın. Diseksiyon için% 70 etanolde dezenfekte edilmiş aletler kullanın. İki uyluk kemiğini toplayın ve herhangi bir yapışık dokuyu çıkararak temizleyin. Etanolde hızlı daldırmadan sonra, 2 mL Tyrode tamponu içeren 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Keskin bir jilet kullanarak epifizleri kesin ve 2 mL Tyrdode tamponu ile dolu 5 mL şırınna kullanarak kemik iliğini yıkayın. Bunu başarmak için, uyluk kemiğinin açıklığı içine 21 G'lik bir iğne takın (diz tarafında) ve sağlam bir ilik silindiri almak için pistona yavaşça basın (Şekil 1B, C). İlik toplama seansını mümkün olduğunca kısa tutun (10 dakikanın altında).</li>
</ol>4. Kemik iliği kesiti ve inkübasyon odasına yerleştirilmesi
<ol><li>Sağlam kemik iliğini dikkatlice ve hafifçe cam bir kaydırağa aktarmak için 3 mL plastik pipet kullanın. Kurumasını önlemek için numunelerin tamponla kaplanması önemlidir (Şekil 1D). NOT: Dokuyu ayrıştırabilecek kesmeleri en aza indirmek için akış yeniden akışından kaçının.</li>
	<li>Stereomikroskop (10x) altında, yıkama sırasında sıkıştırılmış olabilecek iliğin uçlarını kesin. Daha sonra keskin bir jiletle transversal bölümleri kesin. Bölümler ayrıntılı bir gözleme izin vermek için yeterince ince olmalı, ancak megakaryositlerin sıkıştırmadan zarar görmemesini sağlamalıdır (genellikle 0,5 mm civarında kalınlık) (Şekil 1E,F). NOT: Bölümler keskin bir jiletle ve kalınlıklarını yaklaşık 0,5 mm'ye ayarlamak için bir büyüteç altında yapılır. Sadece tekdüze kalınlıkta bölümler seçilir. Bu prosedür karmaşık değildir, ancak standardizasyonu biraz deneyim gerektirir.</li>
	<li>Plastik bir pipet kullanarak, Tirode tamponu içeren 1 mL tüpe 10 bölüm toplayın (Şekil 1G).</li>
	<li>Bölümleri dikkatlice 13 mm çapında bir kuluçka odasına aktarın(Şekil 1H).</li>
	<li>Tamponu epire edin ve hacmi % 5 fare serumu ile desteklenmiş 30 μL Tyrode tamponu olarak ayarlayın. NOT: Bu aşamada farmakolojik ajanlar eklenerek proplatlet oluşumu üzerindeki etkileri değerlendirilebilir.</li>
	<li>Bölümleri mesafeye yerleştirin. Kendinden yapışkanlı hazneyi 22 x 55 mm boyutunda bir kapakla kapatın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yapışırken kapak sapını eğimli hale(Şekil 1I).</li>
	<li>Odayı 37 °C'de ısıtma odasına yerleştirin. Şu andan itibaren kronometre başlatılır (T= 0 h). Deney 37 °C'de (T= 6 h) 6 saat çalışır.</li>
</ol>5. İlik eksplantlarının gerçek zamanlı gözlemi
<ol><li>Kemik iliğinin eksplantlarını gözlemlemek için bir video kameraya bağlı ters faz kontrast mikroskobu (büyütme için 40x lens) kullanın. Gözleme başlamadan önce hücrelerin 30 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin. Gözlemlerken, odağı ayarlamak gerekir, çünkü megakaryositler hareket eder. NOT: Diğer gözlem modları mümkündür (örneğin, megakaryositleri endojen bir floresan işaretleyiciyi ifade eden fareler kullanılarak DIC, floresan), ancak faz kontrastı mikroskopisi, uzun ve ince megakaryosit uzantılarını net bir şekilde görselleştirmek için en uygun olanıdır ve kesin niceleme sağlar. 30 dakika sonra, ilik hücreleri yavaş yavaş eksizyonun çevresine göç ederek bir monolayer oluşturur. 1 saat inkübasyondan sonra, megakaryositler büyük boyutları ve polilobulated çekirdekleri ile tanımlanabilir (Şekil 1J,K). 3 saat inkübasyondan sonra, megakaryositlerin sayısı artar ve bazılarının uzun uzantıları vardır.</li>
	<li>Megakaryositlerin dönüşümlerini kaydetmek için videolar yapın.</li>
</ol>6. Proplatelet uzatan megakaryositlerin nicelleştirilmesi
<ol><li>Kuluçka odasındaki her bölümü yerelleştirmek için bir harita çizin (Şekil 1K).</li>
	<li>1 saat sonra, her bölümün çevresindeki görünür megakaryositleri (yani dev polilobulated hücreleri) tanımlayın ve çizimdeki konumlarını çizin. Bu işlemi 3 ve 6 saat sonra tekrarlayın. NOT: Çizime dayanarak, her megakaryosit zaman içinde kolayca bulunabilir ve morfolojilerinin evrimi analiz edilebilir (ör. boyut, deformasyon, proplatlet uzantısı vb.). Başka bir olasılık, belirli bir navigasyon yazılımının kullanılmasıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Bessis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+platelet+genesis%3B+in+vitro+study+by+cinemicrophotography%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography.</a> Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).</li>
<li>Becker, R. P., De Bruyn, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmural+passage+of+blood+cells+into+myeloid+sinusoids+and+the+entry+of+platelets+into+the+sinusoidal+circulation%3A+A+scanning+electron+microscopic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation.</a> American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).</li>
<li>Muto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scanning+and+transmission+electron+microscopic+study+on+rat+bone+marrow+sinuses+and+transmural+migration+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archivum+Histologicum+Japonicum%22%5BJournal%5D)">A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells.</a> Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).</li>
<li>Cramer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+platelet+formation+by+human+megakaryocytes+cultured+with+the+Mpl+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand.</a> Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Kaushansky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+megakaryocyte+progenitor+expansion+and+differentiation+by+the+c-Mpl+ligand+thrombopoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin.</a> Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).</li>
<li>Scandola, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electron+microscopy+to+study+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Use of electron microscopy to study megakaryocytes.</a> Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+megakaryocyte+development+in+the+native+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment.</a> Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
<li>Ortiz-Rivero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3G%2C+through+its+GEF+activity%2C+induces+megakaryocytic+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation.</a> Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease%3A+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238-250 (2012).</li>
<li>Malara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+structure+and+nano-mechanics+determine+megakaryocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function.</a> Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).</li>
<li>Balduini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+receptors%2C+extracellular+proteins+and+myosin+IIA+orchestrate+proplatelet+formation+by+human+megakaryocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması ilan değil.

Burada, kemik iliğinde yetişen proplateletleri genişletmek için megakaryositlerin verimliliğini değerlendirmek için basit ve düşük maliyetli bir in vitro yöntemi açıklıyoruz. Fare için kemik iliği eksplant modelinin dört ana avantajı vardır. İlk olarak, gelişmiş teknik becerilere gerek yoktur. İkincisi, megakaryosit uzatıcı proplateletler elde etmek için gereken süre oldukça kısadır, eksplant yöntemi için sadece 6 saattir, fare atalarından başlayan geleneksel bir kültür yöntemi için en az 4 gün. Üçüncüsü, sadece...

Kemik iliği eksplant tekniği ilk olarak 1956 yılında Thiéry ve Bessis tarafından trombosit oluşumunda ilk olay olarak sıçan megakaryosit sitoplazmik uzantılarının oluşumunu tanımlamak için geliştirilmiştir1. Faz kontrastı ve sinematografik teknikleri kullanan bu yazarlar, olgun yuvarlak megakaryositlerin dinamik uzama ve daralma hareketlerini gösteren sitoplazmik uzantılı "kalamar benzeri" trombositojenik hücrelere dönüşümünü karakterize ettiler. Bu kollar, kollar boyunca ve uçlarda küçük şişliklerle filiform olana kadar giderek daha ince hale gelir. İn vitro ve sıvı ortamda elde edilen bu tipik megakaryosit uzamaları, megakaryositlerin sinüzoid duvarlardan kan dolaşımına uzun uzantılar gösterdiği sabit kemik iliğinde gözlenen trombositlerle belirli benzerliklere sahiptir2,3. 1994 yılında TPO'nun keşfi ve klonlaması, kemik iliği eksplantlarında açıklananlara benzeyen proplatelet uzantıları oluşturabilen kültürdeki megakaryositlerin ayırt edilmesine izin verildi4,5,6. Bununla birlikte, megakaryosit olgunlaşması kültür koşullarında çok daha az verimlidir, özellikle kemik iliği olgunlaşmış megakaryositlerin geniş iç zar ağı kültürlü megakaryositlerde az gelişmiştir, trombosit biyogenez mekanizmaları üzerindeki çalışmaları engeller7,8.
Thiéry ve Bessis'e dayanan kemik iliği eksplant modelini, kendi ortamlarında tamamen olgunlaşmış fare megakaryositlerinin gerçek zamanlı proplatlet oluşumunda takip etmek, böylece olası in vitro eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için detaylandırırız. Vahşi tip yetişkin farelerde elde edilen sonuçlar, megakaryositlerin proplateletleri genişletme yeteneğini, morfolojilerini ve proplateletlerin karmaşıklığını göstermek için sunulmuştur. Ayrıca megakaryosit kayıt sürecinde veri doğruluğu ve sağlamlığı sağlamak için kalite doğrulaması için hızlı bir niceleme stratejisi sunuyoruz. Burada sunulan protokol, daha önce kitap bölümü olarak yayınlanan yöntemin en son sürümüdür9.

<table><tbody><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS + 05S1</td><td></td></tr><tr><td>21 gauge iğneler</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td> CaCl < <td></td></tr><tr><td>sub>2.6H 2 O</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Kapak Duvar İnkübasyon Odaları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70324-02</td><td>Derinlik : 0,2 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td>pH ayarlı 7.5'e</td></tr><tr><td>kadar İnsan serum albümini</td><td>VIALEBEX</td><td>yetkili ilaç: n&deg; 3400956446995</td><td>%20 (200mg/mL -100mL)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>BVBW8448</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Kapaklı Cam Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72200-40</td><td>22 mm x 55 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Almanya</td><td>DMI8 - 514341</td><td>hava lens</td></tr><tr><td>mikroskobu kamera</td><td>Leica Microsystems SA, Westlar, Almanya</td><td>K5 CMS GmbH -14401137</td><td>görüntü çözünürlüğü : 4.2 megapiksel</td></tr><tr><td>Fare serumu</td><td></td><td>BioWest S2160-010</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>1037-016</td><td>10.000 birim/mL penisilin, 10.000 &mu; g/mL streptomisin ve 29.2 mg/mL glutamin</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz D (+)</td> <td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr></tbody></table>

fare taze kemik İliği eksplantlarının proplatelet formasyon dinamikleri

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

Megakaryopoezisin son aşaması, proplateletler olarak adlandırılan olgun megakaryositlerden sitoplazmik uzantılara yol açar. In vitro-farklılaştırılmışmegakaryositler kullanılarak proplatlet oluşumu hakkında çok şey öğrenilmiştir; bununla birlikte, geleneksel kültür sistemlerinin kemik iliğinin içinde gerçekleşen farklılaşma/olgunlaşma sürecini sadık bir şekilde geri almadığına dair artan bir kanıt vardır. Bu yazıda, thiéry ve Bessis tarafından 1956 yılında, kendi çevrelerinde olgunlaşmış megakaryositleri görselleştirmek, böylece potansiyel eserleri ve yanlış yorumlamaları atlatmak için açık bir yöntem sunuyoruz. Taze kemik ilikleri, farelerin uyluklarının yıkanmasıyla toplanır, 0,5 mm kesitler halinde dilimlenir ve fizyolojik tampon içeren 37 °C'de bir kuluçka odasına yerleştirilir. Megakaryositler eksiz çevrede yavaş yavaş görünür hale gelir ve bir video kameraya bağlı ters bir mikroskop altında 6 saate kadar gözlenir. Zamanla, megakaryositler şekillerini değiştirir, bazı hücreler küresel bir forma sahip ve diğerleri kalın uzantılar geliştirir veya birçok ince proplatlet geniş dallanma ile genişletir. Hem nitel hem de nicel araştırmalar yapılmaktadır. Bu yöntem, çok sayıda megakaryosit mevcut olduğu için basit, tekrarlanabilir ve hızlı olma avantajına sahiptir ve klasik olarak yarısı, kültürlü fare megakaryositleri için 4 güne kıyasla 6 saatte proplatelet oluşturur. Mutant farelerin çalışmasına ek olarak, bu yöntemin ilginç bir uygulaması, farmakolojik ajanların kültürlerde oluşabilecek farklılaşma sürecine müdahale etmeden proplatelet uzatma işlemi üzerinde basit bir şekilde değerlendirilmesidir.

Nitel sonuçlar. Deneyin başında tüm hücreler kemik iliği bölümünde sıkıştırılıyor. Hücrelerin eksplantların çevresinde net bir şekilde görünür hale gelmesi 30 dakika sürer. Megakaryositler daha sonra büyük boyutlarıyla tanınabilir ve evrimleri zamanla incelenebilir (boyut, şekil, dinamik, proplatlet uzantısı ve trombosit salınımı) (Şekil 2A). Küçük megakaryositlerin çapı 20 ila 30 μm arasındadır ve çekirdekleri polilobulated iken olgun yuvarlak megakaryositler genişlemiş sit...

Burada, fizyolojik ortamlarında farklılaşmış megakaryositlerin proplatlet oluşturma yeteneğini değerlendirmek için numune hazırlamadan mikroskobik slayt analizine kadar kemik iliği eksplant yöntemini detaylandırıyoruz.

Fare Taze Kemik İliği Eksplantlarının Proplatelet Formasyon Dinamikleri

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

Bu prosedürün genel amacı, kendi ortamlarında olgunlaşan fare megakaryositlerinden proplatelet oluşumunu gerçek zamanlı olarak takip etmektir. Bu yöntem basit, tekrarlanabilir ve hızlı olma avantajına sahiptir. Birçok megakaryosit analiz edebilir ve profilaklet oluşumunu sadece altı saat içinde görselleştirebilir, bunun yerine kültürün ilk gününü beklemek yerine fare megakaryositleri in vitro.Bu yöntemin ilginç bir uygulaması, özellikle proplatelet uzantısı adımında farmasötik tedavinin veya genetik mutasyonun etkisini incelemek için bir olasılıktır. Burada in-vitro kültürde olduğu gibi farklılaşma sürecine müdahale yoktur. Bu video, kemik iliğini yıkamanın ve kesmenin bu önemli adımlarını sağlamaya yardımcı olur.Ayrıca, trombofilik hastalıkta kusurların karakterizasyonu için gerçekten yararlı olan morfoloji ve megakaryositlerin nasıl sınıflandırılacağı açıklanmıştır. Başlamak için, Tyrode'un tamponu 37 santigrat derecede ısıtın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye getirmek için mikroskobun ısıtma odasını açın. Zamanlayıcı, kuluçka odaları, beş mililitre 21 kalibre şırıng, forseps, jilet, Pasteur pipetler, cam kaydıraklar ve 15 mililitre santrifüj tüpü gibi gerekli tüm araçları hazırlayın.Diz tarafındaki uyluk kemiğinin açıklığı içine 21 kalibrelik bir iğne sokarak kemik iliğini iki mililitre Tyrode tamponu ile yıkayın ve sağlam bir ilik silindirini almak için pistona yavaşça bastırın. Sağlam kemik iliğini dikkatlice ve nazikçe cam bir kaydırağa aktarmak için üç dakikalık litrelik plastik pipet kullanın. Yıkama anında sıkıştırılmış olabilecek iliğin uçlarını kesin.Daha sonra megakaryositlere zarar vermemek için keskin bir jilet kullanarak 0,5 milimetre kalınlığında ince transversal bölümleri kesin. Plastik bir pipet kullanarak, Tyrode'un tamponu içeren bir mililitrelik bir tüpe 10 bölüm toplayın. Bölümleri dikkatlice 13 milimetre çapında bir kuluçka odasına aktarın.Tamponu epire edin ve hacmi%5 fare serumu ile desteklenmiş 30 mikrolitre Tyrode tamponu olarak ayarlayın. Bölümleri bir mesafede konumlandırın. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için kapak kaymasını eğimli olarak 22 ila 55 milimetrelik bir kapak kayması ile kendinden yapışkanlı odayı kapatın.Odayı ısıtma odasına 37 santigrat derecede yerleştirin. Kronometreyi başlatın ve deneyi 37 santigrat derecede altı saat çalıştırın, Megakaryositlerin dönüşümini kaydetmek için videolar yapın. 30 dakika sonra, ilik hücreleri yavaş yavaş bir mono tabaka oluşturan eksplantın çevresine göç etti.Bir saatlik inkübasyondan sonra, megakaryositler büyük boyutları ve polilobulated çekirdekleri ile tanımlanabilir. Megakaryositlerin sayısı üç saatlik inkübasyondan sonra artar ve bazılarının uzun uzantıları vardır. Kuluçka odasındaki her bölümü yerelleştirmek için bir harita çizin.Bir saat sonra, her bölümün çevresindeki dev polilobulated hücreler olan görünür megakaryositleri tanımlayın ve çizimdeki konumlarını çizin. Üç ve altı saat sonra bu işlemi tekrarlayın. Megakaryositler elle sayılır ve inkübasyon odasının sızdırmazlığından üç ve altı saat sonra morfolojilerine göre sınıflandırılır.Küçük, kalın niyetli büyük ve proplatelet uzatma olarak sınıflandırılırlar. Haritalama yardımıyla, evrimleri zaman içinde takip edilebilir. Sonuçlar, her gözlem zamanında her sınıfın yüzdesi olarak ifade edilir.Klasik olarak, çevrede görülebilen megakaryositlerin yarısı, vahşi tip fare kemik iliği için proplateletleri altı saatte uzatır. Yuvarlak megakaryositlerin kaderi, zaman içinde proplateletleri nasıl oluşturduklarını görmek için sıralı görüntüler yakalayarak takip edildi. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken önemli bir şey, eksplantları deney süresince 37 santigrat derecede tutmaktır.Farklı bir sıcaklık sonuçları değiştirebilir. İlginçtir ki, explant protokolü içe dönük mikroskopi deneylerinden sonra kullanılabilir. Sonunda kemik iliği eksplantlarındaki megakaryositler doğal olarak floresan olacak ve davranışları kolayca araştırılabilir.Bu, aynı hayvanlar üzerinde farklı tedaviyi birleştirmeyi ve böylece fare sayısını azaltmayı mümkün khaline getirir. Sonuç olarak, explant yöntemi hızlı, basittir ve doğal megakaryositlerin dış proplateletlere kapasitesi hakkında birçok bilgi sağlar. Ortaya çıkan nitel ve nicel bulgu trombofilik hastalığı anlamamızın anahtarıdır.fizyolojik veya patolojik bağlamda.

proplatelet-formation-dynamics-of-mouse-fresh-bone-marrow-explants

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, megakaryositlerin farklılaşması ve trombosit oluşumu için bir teknik göstermektedir. İnsan göbek kordonu kanından izole edilen hematopoietik kök progenitör hücreler, trombopoietin varlığında olgun megakaryositlere farklılaşır. Olgun megakaryositler, tek tek trombositlere yol açan proplateletler adı verilen sitoplazmik uzantılar üretir.

Megakaryositlerin Farklılaşması ve Trombosit Oluşumu için İn Vitro Yöntem

Bu videoda, bakteriyel lipopolisakkarit ve intravenöz immünoglobuline yanıt olarak kemik iliği kaynaklı makrofajların aktivasyonunu gösteriyoruz.

Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Megakaryocytes son derece saf bir nüfusa kablosunu elde edilebilir kan kaynaklı CD34+ hücreleri. CD34 için bir yöntem+ hücre izolasyon ve megakaryocyte farklılaşması burada açıklanmıştır.

Kordon kan kaynaklı CD34 megakaryocyte farklılaşma ve trombosit oluşumu insan+ hücreleri

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Bu yöntem, MEP ve MKp'nin fare femurları, kaval kemiği ve pelvik kemiklerden akış sitometrisi ile saflaştırılmasını açıklar.

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Burada, insan kemik iliğinin in vivo yapısının karmaşıklığını yansıtan, çok çeşitli normal ve patolojik olayları ince bir şekilde incelemek için uygun bir model sağlayan, uygulaması kolay, standartlaştırılmış, mikrofizyolojik bir sistemi tanımlıyoruz.

Fizyolojik veya Tümöral Bağlamlarda Yerleşik Hücreler Arasındaki Dinamiği ve Etkileşimleri Araştırmak için Bir İnsan Kemik İliği 3D Modeli

Mevcut protokol, farelerden yüksek oranda homojen kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC'ler) saflaştırmak, genişletmek ve karakterize etmek için uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, yüksek proliferasyon ve farklılaşma potansiyeline sahip büyük miktarlarda BMSC'lerin elde edilmesini kolaylaştırır, fare modellerini destekler ve klinik öncesi araştırmaları ilerletir.

Fare Kaynaklı Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinin Saflaştırılması, Genişletilmesi ve Akış Sitometrisi Tabanlı Fenotiplendirilmesi

Keşfedin fare kemik iliği eksplantlarında proplatelet formasyonunu gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu hızlı ve tekrarlanabilir protokol, megakaryosit davranışlarını ve trombofilik hastalık mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Fare Taze Kemik İliği Eksplantlarının Proplatelet Formasyon Dinamikleri

Daha fazla video keşfet