Name: Hücre Olgunlaşmasını Geliştirmek ve Sertlik ve Hapsetmenin Etkisini İncelemek için 3D Metilselüloz Bazlı Hidrojelde Megakaryosit Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, fare megakaryositlerinin 3D metilselüloz hidrojelde farklılaşmasını ve olgunlaşmasını incelemek için mekanik sertlik ve hapsedilmenin etkisini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem kemik iliği ortamını taklit eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, laboratuvarda bu tekniği geliştiren Fabien Pertuy ve Alicia Aguilar'ın yanı sıra metilselüloz hidrojelinin viskoelastik özelliklerini karakterize eden Dominique Collin'e (Institut Charles Sadron - Strazburg) teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ve bir ARN hibesi (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics) tarafından desteklendi. Julie Boscher, Fondation pour la Recherche Médicale'den (FRM hibe numarası FDT2020120104222) bir alıcıdır.

<ol><li>Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+of+Mechanical+Confinement+by+Mesenchymal-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells.</a> Frontiers in Physiology. 11, (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Stiffness+Modulates+Patient-Derived+Glioblastoma+Cell+Fates+in+Three-Dimensional+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2020).</li>
<li>Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+via+cell-matrix+adhesions+in+3D+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Choi, J. S., Harley, B. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+influence+of+substrate+elasticity+and+ligand+density+on+the+viability+and+biophysical+properties+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).</li>
<li>Shin, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+forces+sustain+and+polarize+hematopoiesis+from+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells.</a> Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).</li>
<li>Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+platelet+formation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Blood platelet formation at a glance.</a> Journal of cell science. 133 (20), (2020).</li>
<li>Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+in+a+methylcellulose-based+hydrogel+to+study+the+impact+of+stiffness+on+megakaryocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).</li>
<li>Aguilar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+environmental+stiffness+for+megakaryocyte+differentiation+and+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation.</a> Blood. 128, 2022-2032 (2016).</li>
<li>Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin+from+beginning+to+end%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin from beginning to end.</a> British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).</li>
<li>Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+stiffness+in+megakaryocyte+and+platelet+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function.</a> American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).</li>
<li>Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+intact+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanics of intact bone marrow.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+megakaryocyte+morphology+and+proplatelet+formation+in+mice+with+megakaryocyte-restricted+MYH9+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation.</a> Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).</li>
<li>Eckly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proplatelet+formation+deficit+and+megakaryocyte+death+contribute+to+thrombocytopenia+in+Myh9+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Önceki on yılda, mekanobiyoloji biyolojinin birçok alanına giderek daha fazla ilgi uyandırmıştır. Hücreleri çevreleyen mekanik ortamın davranışlarında rol oynadığı yaygın olarak kabul edilir ve megakaryositlerin hücre dışı mekanik ipuçlarını nasıl algıladığını ve yanıt verdiğini incelemenin önemini vurgular. Kemik iliği dokusunun sertliğini doğru bir şekilde ölçmek zordur in situ11, özellikle hematopoetik kırmızı iliği büyük memelilerde trabeküler kemiklerin içinde yer aldığı için düşünür...

Vücuttaki hücreler karmaşık bir 3D mikroçevrimi yaşarlar ve komşu hücreler ve çevresindeki matris 1,2,3nedeniyle dokudan sertlik ve hapsetme de dahil olmak üzere kimyasal ve mekanofizik ipuçları arasındaki etkileşime tabi tutulurlar. Sertlik ve hapsetmenin hücre davranışı için önemi sadece son yıllarda kabul edilmiştir. 2006 yılında, Engler ve ark. 4'ün ufuk açıcı çalışması, mekanik ortamın hücre farklılaşması için önemini vurgulamıştır. Yazarlar, hücre substrat sertliğindeki varyasyonun kök hücrelerin çeşitli farklılaşma soylarına doğru yönlendirilmesinde neden olduğunu göstermiştir. O zamandan beri, mekanik ipuçlarının hücre kaderi ve davranışı üzerindeki etkisi giderek daha fazla tanındı ve incelendi. Organizmanın en yumuşak dokularından biri olmasına rağmen, kemik iliği kemiğin içinde sınırlı olan 3D yapısal bir organizasyona sahiptir. İlik sertliği, teknik olarak tam olarak ölçülmek zor olsa da, 15 ila 300 Pa 5,6arasında olduğu tahmin edilmektedir. Stroma içinde, hücreler birbirine sıkıca hapsedilir. Ek olarak, çoğu kan dolaşımına girmek için sinüzoid damarlara doğru göç ediyor. Bu koşullar, bu kuvvetlere uyum sağlamak zorunda olan bitişik hücreler üzerinde ek mekanik kısıtlamalar oluşturur. Mekanik ipuçları, megakaryosit farklılaşması ve proplatlet oluşumu üzerindeki sonuçları yeni araştırılmış önemli bir parametreyi temsil eder. Megakaryositler geleneksel sıvı kültüründe in vitroyu ayırt edebilse de, kısmen3D ortamdan mekanik ipuçlarının olmaması nedeniyle vivo olarak gözlenen olgunlaşma derecesine ulaşmazlar 7. Hidrojel gömülü büyüyen progenitors sıvı milieu eksik 3D mekanik ipuçları getiriyor.
Hidrojeller, hematolojik alanda birkaç on yıldır yaygın olarak kullanılmaktadır, özellikle hematolojik progenitörleri ölçmek için kolonide test oluşturan hücreleri yetiştirmek için. Bununla birlikte, bu tür hidrojeller, 3D mekanik ortamın hematopoetik hücrelerin olgunlaşması ve farklılaşması üzerindeki biyolojik etkisini araştırmak için nadiren kullanılmıştır. Son birkaç yıldır laboratuvarımız metilselüloz bazlı bir hidrojel kullanarak bir 3D kültür modeli geliştirmiştir 8. Bu tepkisel olmayan fiziksel jel, yerel megakaryosit ortamının fiziksel kısıtlamalarını taklit etmek için yararlı bir araçtır. Selülozdan hidroksil kalıntılarının (-OH) metoksit grupları (-OCH3)ile değiştirilmesi ile elde edilir. Hem metil ikame derecesi hem de metilselüloz konsantrasyonu, jöle olduktan sonra hidrojel sertliğini belirler. Bu tekniğin gelişim aşamasında, 30 ila 60 Pa aralığındaki bir Young modülünün megakaryosit büyümesi için en uygun jel sertliği olduğu gösterilmiştir 9.
Aşağıdaki protokol, 3D metilselüloz hidrojelde fare megakaryositik atalarını yetiştirme yöntemini açıklar. Standart sıvı kültürü ile karşılaştırıldığında, bu hidrojel kültürün megakaryosit poliploidizasyon derecesini artırdığı, olgunlaşmayı ve hücre içi organizasyonu iyileştirdiği ve sıvı bir ortamda yeniden yaşamdan geçirildikten sonra yayılımları uzatmak için megakaryositlerin kapasitesini artırdığı gösterilmiştir 9. Bu makale, fare kemik iliği Lin− hücrelerinin izolasyonu ve 3D kültür için metilselüloz hidrojel içine gömülmesi protokolünü ve ayrıca proplatlet üretme kapasitelerinin nicelleştirilmesini ve daha fazla analiz için hücrelerin geri kazanımını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

<table><tbody><tr><td>18 gauge iğneler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001735825</td><td></td></tr><tr><td>21 gauge iğneler</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>23 gauge iğneler</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge neeldes</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>4 oyuklu kültür kapları</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS + 05S1</td><td></td></tr><tr><td>Sitoklipsler</td><td>Microm Microtech</td><td>F / CLIPSH</td><td></td></tr><tr><td>Filtre kartlarıyla donatılmış Cytofunnels</td><td>Microm Microtech</td><td>F / JC304</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin santrifüj</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Cytospin 4</td></tr><tr><td>Dakopen</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojileri</td><td>41 966-029</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-094</td><td>Steril Dulbecco' s fosfat tamponlu salin</td></tr><tr><td>EasySep mıknatıslar</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Fare Hematopoietik Progenitör Hücre izolasyon Kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>19856A</td><td>biyotinile antikorlar (CD5, CD11b, CD19, CD45R / B220, Ly6G / C (Gr-1), TER119,7 ve ndash; 4) ve streptavidin kaplı manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Luer kilit 1 mL şırıngalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>veya BD MEDİKAL'den 309628 şırıngalar</td></tr><tr><td>Luer kilit şırınga konektörleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891120</td><td></td></tr><tr><td>MC% 3</td> <td>R & Amp; D sistemleri</td><td>HSC001</td><td></td></tr><tr><td>Polilizin kaplı slaytlar</td><td>Thermo Scientific</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PSG 100x</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>1037-016</td><td>10.000 birim / mL penisilin, 10.000 & mu; g/mL streptomisin ve 29.2 mg/mL glutamin</td></tr><tr><td>Sıçan serumu</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>13551</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant hirudin</td><td>Transg&egrave; ne</td><td>rHV2-Lys47</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan trombopoietin (rhTPO)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>2822</td><td>10.000 birim / mL</td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı 10 mL plastik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı 5 mL polistiren tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hücre olgunlaşmasını geliştirmek ve sertlik ve hapsetmenin etkisini İncelemek için 3d metilselüloz bazlı hidrojelde megakaryosit kültürü

Megakaryocyte Culture in 3D Methylcellulose-Based Hydrogel to Improve Cell Maturation and Study the Impact of Stiffness and Confinement

Hem hapsetmeye hem de mekanik kısıtlamalara yol açan 3D ortam, hücre davranışının önemli bir belirleyicisi olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. 3D kültürü böylece in vivo durumuna daha iyi yaklaşmak için geliştirilmiştir. Megakaryositler kemik iliğindeki (BM) hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) farklılık sağlar. BM, kemiğin içinde kapalı olarak vücudun en yumuşak dokularından biridir. Kemik hücre ölçeğinde zayıf genişletilebilir, megakaryositler birlikte zayıf bir sertliğe ve yüksek hapsetmeye maruz kalır. Bu protokol, fare soyu negatif (Lin-) HSPC'lerin immün manyetik sıralama ile kurtarılması ve metilselülozdan oluşan bir 3D ortamda olgun megakaryositlere farklılaşması için bir yöntem sunar. Metilselüloz megakaryositlere karşı reaktif değildir ve sertliği normal kemik iliğine ayarlanabilir veya patolojik fibrotik iliği taklit etmek için arttırılabilir. Daha fazla hücre analizi için megakaryositleri kurtarma işlemi de protokolde ayrıntılı olarak yer uzamaktadır. Proplatelet uzantısı 3D milieu içinde önlenmiş olsa da, megakaryositlerin sıvı ortamda nasıl yeniden sulandırılacağı ve proplateletleri uzatma kapasitelerinin nasıl ölçülmesi aşağıda açıklanmıştır. 3D hidrojelde yetişen megakaryositler, sıvı bir milieu'da yetişenlere kıyasla proplatlet oluşturma kapasitesi daha yüksektir. Bu 3B kültür, i) ataları daha yüksek olgunlaşma durumuna ulaşan megakaryositlere doğru ayırt etmeye, ii) in vivo olarak gözlemlenebilen ancak klasik sıvı kültürlerinde fark edilmeyen fenotipleri yeniden toplamaya ve iii) 3D bir ortamın sağladığı mekanik ipuçlarının neden olduğu transdüksiyon yollarını incelemeye izin verir.

Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler ilk olarak 2016 yılındaBlood'da yayınlanmıştır 9.
Protokole göre, hücreler sıvı veya metilselüloz hidrojel ortamda tohumlandı. Sıvı ortamdaki hücrelerin tümü kuyunun dibinde, sert plastik yüzeyle temas halinde ve bazen diğer hücrelerle çökeltilmiştir. Buna karşılık, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler jelde homojen bir şekilde dağıtılır ve komşu hücrelerden izole edilir (Şekil 3A). Son ko...

Hücrelerin üç boyutlu ortamının davranışlarında, olgunlaşmalarında ve/veya farklılaşmalarında önemli bir rol oynayabileceği artık kabul ediliyor. Bu protokol, fiziksel çevreleme ve mekanik kısıtlamaların megakaryositler üzerindeki etkisini incelemek için tasarlanmış üç boyutlu bir hücre kültürü modelini açıklar.

Hücre Olgunlaşmasını Geliştirmek ve Sertlik ve Hapsetmenin Etkisini İncelemek için 3D Metilselüloz Bazlı Hidrojelde Megakaryosit Kültürü

The 3D environment leading to both confinement and mechanical constraints is increasingly recognized as an important determinant of cell behavior. 3D ...

Bu protokol, yerli megakaryositlerin kemik iliğinde maruz kaldıkları hapsetme ve orta sertliğin davranışları ve olgunlaşmaları üzerindeki etkisinin in vitro olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, hücre-hücre ve hücre matrisi etkileşimlerini ortadan kaldıran ve mekanik yönlere odaklanan basitleştirilmiş bir modeldir. İyi laboratuvar uygulamalarına ve steril çalışma koşullarına kesinlikle uyulmalıdır.Aslında, hidrojel'in hafif bir kirlenmesi bile megakaryosit farklılaşması üzerinde dramatik bir etkiye sahip olabilir. Tek bir hidrojel hücre kültürü kuyusu elde etmek için, oda sıcaklığında% 3 metilselülozun iki mililitrelik aliquots'unu çözerek başlayın, ardından önce bir mililitre çizerek ve sonra hepsini dışarı atarak bir mililitre Luer kilit şırındını metilselülozla kaplayın. Daha sonra, aynı şırınga ve iğneyi kullanarak, taze bir aliquot'tan 333 mikrolitre metilselüloz çizin.İğneyi dikkatlice çıkardıktan sonra, bir Luer kilit konektörünü şırınganın ucuna vidalamak için sterilize edilmiş önlük kullanın, ardından konektöre ikinci bir kaplamasız bir mililitre Luer kilit şırıngası takın. Metilselülozu iki şırınna eşit olarak dağıtın ve bir kenara koyun. Daha sonra, konsantre kültür ortamında daha önce izole edilmiş fare soyu negatif hematopoetik kök ve progenitör hücreleri 167 mikrolitre başına altı hücreye bir kez 10 yoğunlukta yeniden kullanın.Şırıngalardan birini konektörden çıkarın ve hücre süspansiyonunun 167 mikrolitresini doğrudan konektöre takın ve aynı anda şırınga pistonu yavaşça çekerek hücre süspansiyonuna yer açın. Tüm hücre süspansiyonu konektöre ekledikten sonra, süspansiyonu konektörden çekmek için pistonu daha fazla çekin ve vida ipliğinde herhangi bir süspansiyon kaybetmemeye dikkat ederek ikinci şırınna dikkatlice yeniden bağlayın. Metilselüloz ortamını hücre süspansiyonu ile homojen hale getirmek için pistonları iki şırınna arasında 10 kez yavaşça ileri geri hareket ettirin, ardından toplam hacmi bir şırınna çekin ve iki şırınnayı çıkarın, konektörü boş olanda bırakın.Şırınnanın içeriğini dört kuyulu bir plakanın bir kuyusuna boşaltın ve plakayı% 5 karbondioksitin altında 37 derecede kuluçkaya yatırın. Proplateletleri analiz etmek için, kültürün üçüncü gününde, tüm hücreleri bir kuyudan% 1 PSG ile 10 mililitre DMEM içeren 15 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarın. Metilselülozu tamamen seyreltmek için hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden depolayın, ardından oda sıcaklığında 300 kat G'de tüpü beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre tam kültür ortamında yeniden depolayın ve hücreleri dört kuyulu bir plakanın kuyusu başına 500 mikrolitrede yeniden tohumlayın. Plakayı %5 karbondioksitin altında 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Ertesi gün, 20X hedefi olan bir Brightfield mikroskobu kullanarak, görüş alanında çok fazla hücre olmadığından emin olarak ve alan başına en az beş megakaryosit yakalayarak, kuyu başına rastgele 10 görüntü elde edin.ImageJ kullanarak, proplatletleri genişleten megakaryositlerin oranını hesaplamak için her görüntüdeki toplam megakaryosit sayısını ve proplateletleri genişletenleri sayın. Hücreleri gelecekteki analizler için sabitlemek için, jeli bozmadan metilselülozun üzerine fiksatif çözeltiyi ekleyin. Kullanılan fiksatife bağlı olarak uygun bir süre bekledikten sonra, metilselüloz homojen bir şekilde seyreltilene kadar fiksatif ve jel boruyu hafifçe pipetlemek için bir P1000 pipet kullanın.Ve aynı pipet ucunu kullanarak, kuyunun tüm içeriğini 10 mililitre DPBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve karıştırarak homojenize edin. Karışımı santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve megakaryosit peletini istenen analize uygun bir ortamda yeniden atın.Kültürün üçüncü gününe kadar, sıvı ortamdaki megakaryositler kuyunun dibinde tortulaşmıştır ve sert plastik yüzeyin yanı sıra diğer hücrelerle de temas halindedir. Buna karşılık, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler homojen bir şekilde dağıtılır ve komşu hücrelerden izole edilir. Farklı kültür koşullarında megakaryositlerin ortalama çapının analizi, %2 metilselülozun sıvı kültürüne göre ortalama megakaryosit çapını biraz artırdığını göstermektedir.Bununla birlikte, metilselüloz konsantrasyonunun% 0,5 oranında artırılması, daha küçük bir ortalama çapla belirtildiği gibi megakaryosit farklılaşmasına zarar verir. Temsili iletim elektron mikroskopi görüntülerinde, kemik iliği içinde in vivo olarak farklılaşmış megakaryositlerdeki intrasitoplazmik membranlar, tanımlı sitoplazmik bölgelerle yakından karşıt görünmektedir. Sıvı kültüründe, zarlar çoğunlukla sitoplazmik bölgelerin sınırlandırılmamış küçük yuvarlak oval görünümüne veya uzun veziküllerine sahiptir.Buna karşılık, %2 metilselüloz kültürü, yerinde yapıya benzeyen sitoplazmik bölgeleri sınırlayan membranlara yakından karşı çıkmıştır. Kültürün dördüncü gününe gelindiğinde, daha önce hidrojelde kültürlenen megakaryositler, sıvı ortamda kültürlenenlere kıyasla proplatlet oluşumunun arttığını göstermektedir. Megakaryosit uzatma proplateletlerinin ortalama oranı genellikle sıvı bir ön kültür ile% 15 ila 20 civarındadır, metilselüloz hidrojel pre-kültürü ile% 35 ila 40'a kıyasla.Bu prosedürü denerken, son metilselüloz konsantrasyonundaki küçük bir değişiklik ortam sertliğini önemli ölçüde değiştirebileceği için uygun hacimleri çok hassas bir şekilde pipetlemek önemlidir. Hidrojeldeki hücre olgunlaşmasını takiben, megakaryositler akış sitometrisi ile ploidy ve hücre belirteci analizi için geri kazanılabilir veya elektron mikroskopisi veya ilgi çekici proteinin immünostainasyonu için sabitlenebilir.

megakaryocyte-culture-3d-methylcellulose-based-hydrogel-to-improve

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

Bu akciğer hücre dışı matristen 3 boyutlu hücre kültürü iskele oluşturmak için bir yöntemdir. Bozulmamış akciğer üç boyutlu hücrelerin büyümesini destekleyen hidrojeller olarak işlenir.

3D Hücre Kültürü için Pulmoner Ekstrasellüler Matrix Ayarlanabilir Hidrojellerinin

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

Burada, biz fare 3D kültür için bir protokol beyin kaynaklı glia hücreleri, astrocytes, microglia ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere mevcut. Biz birincil hücre kültürü, methacrylated hyaluronik asit (HAMA) hidrojel sentezi, HAMAphoto polimerizasyon ve hücre saklamasını ve confocal ve tarama elektron mikroskobik görüntüleme için işleme örnek göstermektedir.

Geliştirilmiş 3D hidrojel Neuroinflammation Vitro modelleme için birincil gliyal hücreler kültürleri

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Bir protokol olan ve olmayan oligopeptides, biyomalzemeler farklılaşması üzerine sertliği etkisini ve yayılması araştırmak için aşılı değişen sertlik ile polivinil alkol-co-İtakonik asit hydrogels hazırlamak için sunulan kök hücreler. Hydrogels sertliği crosslinking zaman tarafından kontrol ediliyordu.

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Bu yazıda, yeni tasarlanmış bir 3D baskılı ek, bir ko-kültür modeli olarak sunulmuş ve endotel hücreleri ile keratinositler arasındaki parakrin hücreler arası iletişimin incelenmesiyle doğrulanmıştır.

Basit 2D ve 3D hücre kültürlerini mümkün kılmak için tasarlanmış yenilikçi bir 3D baskılı ek parça

Kemik iliği vasküler nişinin in vitro bir modeli, mezenkimal ve endotel hücrelerinin önceden dökülmüş 3D PEG hidrojelleri üzerine tohumlanmasıyla oluşturulur. Nişlerin endotel ağları, ECM bileşenleri ve ALP aktivitesi kullanılan büyüme faktörüne bağlı olarak değişir. Platform, gelişmiş kanser modelleri için kullanılabilir.

Bir görüntüleme mikroplakasında önceden dökülmüş poli (etilen glikol) (PEG) hidrojeller kullanılarak vaskülarize osteojenik kemik iliği nişinin basit bir şekilde kurulması

Bu protokol, metakrilatlenmiş jelatin (GelMA) hidrojellerine gömülü insan osteositleri kullanılarak 3D kemik yapılarının üretilmesini ve decellularize ekstrasellüler matriks ile desteklenmesini açıklar. Yöntem düşük maliyetli, ölçeklenebilir ve temel laboratuvar ekipmanlarıyla uyumludur; bu da kas-iskelet hastalıkları süreçlerini incelemek için translasyonel bir platform sağlar.

Kas-iskelet hastalıklarının modellenmesi için insan osteositleri ve hücresizleştirilmiş ekstrasellüler matriks kullanan 3D kemik kültürü platformu

Öğrenin, fare megakaryositlerinin 3D metilselüloz hidrojelde farklılaşmasını ve olgunlaşmasını incelemek için mekanik sertlik ve hapsedilmenin etkisini nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem kemik iliği ortamını taklit eder.

Hücre Olgunlaşmasını Geliştirmek ve Sertlik ve Hapsetmenin Etkisini İncelemek için 3D Metilselüloz Bazlı Hidrojelde Megakaryosit Kültürü (Video) | JoVE Journal

Hücre Olgunlaşmasını Geliştirmek ve Sertlik ve Hapsetmenin Etkisini İncelemek için 3D Metilselüloz Bazlı Hidrojelde Megakaryosit Kültürü

Daha fazla video keşfet