Name: In Vivo Fare Kafatası Kemik İliğinde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin, fare kafatası kemik iliğinde megakaryositlerin ve proplateletlerin iki fotonlu mikroskopi ile canlı görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, trombosit üretim mekanizmalarını fizyolojik koşullarda incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, laboratuvarda tekniği kurduğumuz dönemde iki fotonlu mikroskopi deneyleri konusundaki uzman tavsiyeleri için Florian Gaertner'e (Avusturya Bilim ve Teknoloji Enstitüsü), IGBMC /CBI Görüntüleme Merkezi'ndeki (Illkirch, Fransa) Yves Lutz'a ise uzmanlığı ve iki foton mikroskobu konusundaki yardımı için teşekkür ediyor. Ayrıca jean-Yves Rinkel'e teknik yardımı için ve Ines Guinard'a şekil 1'deki şemanın çizimi için teşekkür ederiz. ARMESA'ya (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) iki foton mikroskobun satın alınmasındaki desteği için teşekkür ederiz. AB, Etablissement Français du Sang (APR2016) ve Agence Nationale de la Recherche'den (ANR-18-CE14-0037-01) doktora sonrası burslarla desteklendi.

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Trombosit oluşum mekanizmaları kemik iliği ortamına oldukça bağlıdır. Bu nedenle intravital mikroskopi, süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için sahada önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan megakaryositli fareler, Cre rekombinazını megakaryositlerde ifade eden fareleri koşullu floresan gen ifade kaseti içeren herhangi bir floxed muhabir fare ile geçerek elde edilebilir. Burada, mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10) Pf4-cre fareler<sup c...

Trombositler kemik iliğinde bulunan megakaryositlere özel hücreler tarafından üretilir. Megakaryositlerin dolaşımdaki trombositleri serbest bırakmasının kesin yolu, kemikten gerçek zamanlı olayları gözlemlemedeki teknik zorluk nedeniyle uzun süre belirsiz kalmıştır. İki fotonlu mikroskopi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı oldu ve trombosit oluşum sürecini anlamada büyük ilerlemelere yol açtı. İlk in vivo megakaryosit gözlemleri 2007 yılında von Andrian ve meslektaşları tarafından yapıldı, floresan megakaryositlerin kafatasından görselleştirilmesiile 1. Bu mümkündü, çünkü genç yetişkin farelerin frontoparietal kafatasındaki kemik tabakası birkaç on mikron kalınlığa sahiptir ve alttaki kemik iliğindeki floresan hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için yeterinceşeffaftır 2.
Daha sonra yapılan çalışmalarda proplatelet oluşumunun çeşitli koşullar altında değerlendirilmesi ve alttaki mekanizmaların deşifre edilmesi için 3 ,4,5,6. Bu çalışmalar, megakaryositlerin proplatlet adı verilen çıkıntıları sinüzoid damarların endotel bariyeri yoluyla dinamik olarak genişlettiklerine dair kesin kanıtlar sağlamıştır(Şekil 1). Bu proplateletler daha sonra hacim olarak birkaç yüz trombosit temsil eden uzun parçalar olarak serbest bırakılır. Trombositler, özellikle akciğerlerde olmak üzere aşağı akış organlarının mikrosirkülasyonunda proplateletlerin yeniden şekillendirilmesinden sonra oluşacaktır7. Ancak bugüne kadar kesin süreç ve moleküler mekanizmalar tartışılmaya devam etmektedir. Örneğin, sitoskeletal proteinlerin proplatletlerin uzamasındaki önerilen rolü in vitro ve in vivo koşullar arasında farklılık gösterir3ve proplatlet oluşumundaki farklılıklar enflamatuar koşullar altında gösterilmiştir6. İşleri daha da karmaşık hale getiren, yeni bir çalışma proplatelet güdümlü konsepte itiraz etti ve in vivo, trombositlerin esasen megakaryosit seviyesinde bir membran tomurcuklama mekanizması ile oluştur olduğunu önerdi8.
Bu makale, canlı farelerde kafatası kemiğinden kemik iliğindeki megakaryositlerin ve proplatletlerin minimal invaziv bir prosedür kullanılarak gözlemlenmesi için bir protokol sunun. Benzer yaklaşımlar daha önce hematopoetik kök ve progenitör hücreler başta olmak üzere diğer ilik hücrelerini görselleştirmek içintanımlanmıştır 9. Burada, özellikle proplatlet morfolojileri ve trombosit hızı olmak üzere ölçülebilen bazı parametreleri detaylandırmak için megakaryositlerin ve trombositlerin gözlemlenmesi üzerinde durulmaktadır. Bu protokol, floresan izleyiciler ve ilaçlar enjekte etmek ve kafatası kemiğinden gözlemlemek için şahdamarına bir kateterin nasıl yerleştirılacağını sunar. Kalvarial kemik küçük bir ameliyat kullanılarak maruz kalır, böylece kemiğe bir halka yapıştırılır. Bu halka, başı hareketsiz hale getirmek ve nefes almaya bağlı hareketleri önlemek ve lensin daldırma ortamı olarak tuzlu su dolu bir bardak oluşturmak için hizmet eder. Bu teknik i) sinüsoid geometrisini ve damar duvarı ile etkileşime giren megakaryositleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için çok uygundur; ii) proplatlet oluşumu, uzama ve salınım sürecinde megakaryositleri takip edin; ve iii) karmaşık sinüzoid kan akışını izlemek için trombosit hareketlerini ölçmek. Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler yakın zamanda yayımlanmıştır3.

<table><tbody><tr><td>GNU Oktav yazılımı</td><td>GNU Projesi</td><td></td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; Histoakril 5 x 0, 5 mL</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>enjekte edilebilir cerrahi yapıştırıcı çözeltisi</td></tr><tr><td>HyD hibrit dedektörler Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>GNU projesi</td><td></td><td>Gereken minimum sürüm</td></tr><tr><td>Imalgene/Ketamin 1000 fl/10 mL</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>göz koruması</td></tr><tr><td>25x su objektifi, 0.95 Leica Microsystems sayısal açıklığı ile donatılmış Leica SP8 MP DIVE mikroskobu,</td><td></td><td>AlexaFluor-488 ve Qtracker-655'in aynı anda uyarılması</td>Matlab MathWorks https://www.mathworks.com/ Ocrygel 10 g Laboratoires T.V.M.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>03700454505621</td><td>Silikon diş macunu mavi ve sarı</td></tr><tr><td>Picodent twinsin hızı</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 vasküler etiket</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>enjekte edilebilir çözelti</td></tr><tr><td>Rezonans tarayıcı, 8 veya 12 kHz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine %2 fl/25 mL</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı jel</td><td></td><td></td><td>Yüzüğü kemiğe yapıştırmak için</td></tr><tr><td>Surflo IV kateter - Mavi 22 G</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Saph darbeli lazer (Tutarlı) (femtosaniye)</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo fare kafatası kemik İliği'nde megakaryositlerin ve proplateletlerin İki fotonlu görüntülemesi

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Trombositler, kemik iliğinde bulunan özel hücreler olan megakaryositler tarafından üretilir. Megakaryositleri gerçek zamanlı olarak ve doğal ortamlarında görüntüleme imkanı 10 yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış ve trombosit oluşum sürecine yeni bir ışık tutmaktadır. Megakaryositler, sinüzoid damarların endotel astarı yoluyla proplatlet adı verilen uzun çıkıntıları uzatır. Bu makale, kafatası kemik iliği ve sinüzoid damarlardaki gerçek zamanlı floresan etiketli megakaryositlerde aynı anda görüntü vermek için bir protokol sürmektedir. Bu teknik, enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kafatasını sağlam tutan küçük bir ameliyata dayanır. Fare kafası, hareketlerin nefes almasını önlemek için kafatasına yapıştırılmış bir halka ile hareketsiz hale getirilir.
İki fotonlu mikroskopi kullanılarak, megakaryositler birkaç saate kadar görselleştirilerek sinüzoid damarların içindeki uzama sürecinde hücre çıkıntılarının ve proplatletlerin gözlemlenmesi sağlanabilir. Bu, çıkıntıların morfolojisi (genişlik, uzunluk, daralma alanlarının varlığı) ve uzama davranışları (hız, düzenlilik veya duraklama veya geri çekme aşamalarının varlığı) ile ilgili çeşitli parametrelerin ölçülmesine izin verir. Bu teknik aynı zamanda trombosit hızını ve kan akışı yönünü belirlemek için sinüzoid damarlarda dolaşan trombositlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem özellikle genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak trombosit oluşumunda ilgi çekici genlerin rolünü incelemek için yararlıdır ve farmakolojik testlere de açıktır (mekanizmaları inceleyin, trombosit üretim bozukluklarının tedavisinde ilaçları değerlendirin). In vivo ve in vitro proplatlet oluşumunun farklı mekanizmalara dayandığı bilindiği için özellikle in vitro çalışmaları tamamlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, proplatlet uzaması için in vitro mikrotübüllerin gerekli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, in vivo, esas olarak kan akış kuvvetleri tarafından teşvik edilen bir iskele olarak hizmet ederler.

Bu protokol kullanılarak, floresan izleyici Qtracker-655, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını ve okların tasvir ettiği akış yönünü görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı (Şekil 4A, sol). mTmG fareleri kullanılarak, eGFP floresan trombositler her gemi dalında 20 sn'nin üzerinde kaydedildi ve hızları ImageJ ve GNU Octave yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 4A, sağ). Akış hızı ve yönündeki heterojenliğe dikkat edin. Sinüzoid damarl...

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Bu yöntem, kafatası faresinin kemik iliğinde gerçekleşen megakaryositler gibi, sinüzoid damarların içindeki proplateletleri genişleterek farklı olayların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir. Bu tekniğin ana avantajı, enflamatuar reaksiyonu en aza indirmek için gereken küçük bir ameliyattır ve neredeyse fabrika koşullarında olayların in vivo bir şekilde görselleştirilmesine izin verir. Başlamak için fareyi görüntüleme odasına taşıyın.Mikroskobu ve bilgisayarı aç ve gerekli parametreleri ayarla. Fare tamamen uyuşturulduktan sonra, fareyi aşağıdaki tüm manipülasyonlar için 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış ısıtılmış bir tabağa yerleştirin, farenin başını ve boğazını tıraş edin ve kuruluğu önlemek için jeli gözlere uygulayın. Fareyi sırtına yerleştirin ve boğazı germek için ön bacakları cerrahi bantla sabitleyin.Boğazı dezenfekte ettikten sonra makas kullanarak sağ veya sol şah damarı üzerinde 0,7 ila 1 santimetrelik bir kesi yapın ve göğüs kasının üstündeki dış hokkabaz damarını ortaya çıkarmak için bitişik bağ dokusunu gerin. Kateteri ılık, steril fizyolojik salin ile doldurun. Kateteri pektoral kastan geçirin ve kateteri damara yerleştirin.İğneyi yavaşça çıkarın, şırıngayı floresan izleyicilere bağlayın ve kateterin ölü hacmini enjekte edin. Kateteri stabilize etmek için bir damla cerrahi yapıştırıcı yerleştirin. Fareyi dikkatlice eğilimli bir konuma getirin.Gevşek saçları çıkarırken kafa derisini kağıt havlu ile% 70 etanol ile dezenfekte edin. Calvarium'u ortaya çıkarmak için kafa derisindeki kulakların arasında bir santimetreye kadar orta çizgide T şeklinde bir kesi yapmak için steril ince makas ve cımbız kullanın. Kafatasını cımbızla açığa çıkarın, ardından periosteumu dikkatlice çıkarmak için makas ve cımbız kullanın.Tüm periosteumu ve görüntülemeyi değiştirebilecek herhangi bir döküntüyü veya saçı çıkarmak için steril bir pamuklu çubuk ve fizyolojik salin kullanın. Kan izlerini gidermek için kafatasını salinle durulayın ve kemiği bir pamuklu çubukla hızla kurulayın. Tutkal jelini halkaya uygulayın, halkayı açıkta kalan kemiğe yerleştirin ve halkanın kafatasına sıkıca yapışmasını sağlamak için birkaç saniye saklayın.Kafatasını tuzlu bir pamuklu çubukla hafifçe nemlendirin. Mavi ve sarı bileşenleri bire bir oranında dikkatlice karıştırarak Silikon diş macunu hazırlayın. Görüntüleme sırasında sızıntıyı önlemek için diş macunu uygulayarak halkayı kapatın.Halkaya girmiş olabilecek herhangi bir diş macunu veya yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın. Daha sonra sızıntıyı kontrol etmek için halkayı salinle doldurun. Fareyi desteğin üzerine yerleştirin ve başı kaldırmak ve tutucuya bağlandığında yüzüğün kafatasından kopmasını önlemek için hayvanın başının altına katlanmış bir kompres koyun.Yüzüğü blok tutucusuna vidala. Destek ve fare tertibatını ısıtılmış mikroskop haznesine yerleştirin. Seçilen dört dörtlü için uygun lazer dalga boylarını ayarlayın ve yayılan ışıkların geri kazanılması.Inter hokkabaz kateteri kullanarak, vaskülatörü etiketlemek için floresan izleyicinin 0,2 mikromolar çözeltisinin 50 mikrolitresini enjekte edin. Mikroskop aşamasını destek ve fare ile mikroskop hedefinin altına yerleştirin. Yüzüğün her zaman tuzlu suyla dolduğundan emin olun ve gerekirse yeniden doldurun ve hedefi ve salini daldırin.Kemik iliği damarlarını bulmak ve sinüzoid damarlar boyunca hizalanmış megakaryositleri gözlemlemek için epifluoresans kullanın. Uzun satın almalar için, sekiz kiloluk Hertz rezonans tarayıcısı ve çift yönlü mod kullanarak 384 x 384 piksel görüntü ile 3D uzay-zaman kazanımı ayarlayın. İyi çözünürlükte hat ortalamasını kullanın, ardından optimize edilmiş Z adım boyutunu seçin ve alıma başlamadan önce gereken zaman aralığını ayarlayın.Kısa ve hızlı alımlar için bir alan, zaman alma türü seçin ve görüntü boyutunu en aza indirin. Gerekirse, görüntüleme alanını döndürerek görüntüyü damara ayarlayın. Mevcut en yüksek tarama hızını ve çift yönlü taramayı kullanın.Görüntü tanımı ve alımın hızlılığı arasındaki en uygun uzlaşmayı bulmak için çizgi ortalamasını en aza indirin. Yalnızca bir Z planı alın ve edinme için zaman aralığını en aza indirin. Trombosit hızını ölçmek için 10 ila 20 saniye alım yeterli olmalıdır.Floresan izleyici, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını, okla gösterilen akış yönüyle görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı. Floresan trombosit hızı her gemi dalında kaydedildi ve varyasyon gözlendi. Sinüzoid damarlar, akış yeniden akışı ve hatta durağanlık varlığı ile anastomozlar nedeniyle karmaşık akışlar sunar.Oklar çatallanmada tam tersi akış yönünü gösteriyordu. Trombosit hızı da sol ve sağ damar dalları için ölçüldü hızlanma, durağanlık ve yavaşlama evreleri ile her damar dalında zaman içinde düzensizlik olduğu belirtildi. Düzensiz kenar boşluklu proplateletler, daha sonra uzun süreli proplateletler ve kalın ve kısa proplateletler dahil olmak üzere farklı proplatelet morfolojileri gözlendi.Megakaryositler karmaşık akış alanlarındaki proplateletleri genişlettiğinde, proplateletler akış yönüne göre bir damar dalından diğerine atılmıştır. Kan akışını durdurduktan sonra, proplateletler gevşedi ve fare beklenmedik bir şekilde kalp krizi geçirdi, proplatelet uzamasında hidrodinamik kuvvetlerin önemini gösterdi. Proplatletlerin genişliği ve uzunluğu da ortalama 5,2 mikrometre genişlik ölçtü ve ortalama maksimal uzunluk yaklaşık 185 mikrometre gözlendi.Proplatlet uzunluğunu zamanın bir işlevi olarak çizmek, uzama, durağanlık ve hatta geri çekme aşamalarında proplateletlerin davranışının görselleştirilmesine izin verir. Dakikada yaklaşık 10 mikrometre ortalama uzama hızı gözlendi. Kateterin montajı, ilaçların enjeksiyonunun proplatlet oluşumu veya diğer ilgi çekici olaylar üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak incelemesine izin verildi.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, açıkta kalan kafatası kemiğine bir kraniyal halka düzeneği yerleştirmek ve uzun süre yüksek çözünürlüklü beyin görüntüleme için farenin kafasını daha fazla hareketsiz hale getirmek için cerrahi bir prosedürü açıklıyoruz.

Fare Modelinde Kraniyal Halka Düzeneği Kurulumu: Yüksek Çözünürlüklü Kafatası Kemik İliği Görüntüleme için Murin Kafatasına Görselleştirme Penceresi Düzeneğini İmplante Etmek İçin Cerrahi Bir Prosedür

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Burada, iletim elektron mikroskopisi (TEM) kullanılarak megakaryositlerin yerinde ultrayapısını analiz etmek için bir protokol sunuyoruz. Murine kemik ilikleri toplanır, sabitlenir, epoksi reçineye gömülür ve ultra ince bölümlerde kesilir. Kontrast boyamadan sonra kemik iliği 120 kV'da TEM mikroskobu altında gözlenir.

In Situ İletim Elektron Mikroskopisi Kullanılarak Murine Megakaryopoez Keşfi

Burada, fizyolojik ortamlarında farklılaşmış megakaryositlerin proplatlet oluşturma yeteneğini değerlendirmek için numune hazırlamadan mikroskobik slayt analizine kadar kemik iliği eksplant yöntemini detaylandırıyoruz.

Fare Taze Kemik İliği Eksplantlarının Proplatelet Formasyon Dinamikleri

İntravital mikroskopi, doku rejenerasyonu ve tümör gelişimi gibi dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Oldukça dinamik bir doku olan kalvarial kemik iliği, hematopoez ve vasküler fonksiyon hakkında bilgi verir. Biyouyumlu bir 3D baskılı kafa sabitleme implantı kullanmak, tekrarlayan uzunlamasına görüntülemeye olanak tanıyarak doku dinamikleri ve tümör mikro çevresi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Öğrenin, fare kafatası kemik iliğinde megakaryositlerin ve proplateletlerin iki fotonlu mikroskopi ile canlı görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, trombosit üretim mekanizmalarını fizyolojik koşullarda incelemeyi sağlar.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet