Braf/Pten Genetiği Mühendisliğiyle Tasarlanmış Melanom Fare Modelinde Ultra Yüksek Frekanslı Ultrason Görüntüleme ile Lenf Düğümü Hacminin Analizi

Yöntemimiz, inguinal lenf nodlarının metastatik tutulumundaki artışın, hacimlerindeki artışı ölçerek izlenmesini sağlar. Bu invaziv olmayan yöntem çok iyi tolere edilir, bu nedenle iki hafta boyunca aynı deney hayvanında birden fazla görüntüleme seansı planlanabilir. Bu yöntem, farmakolojik tedavinin metastatik hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için idealdir.

Bu yöntemi Braf/Pten melanom modeline uyguladık, ancak prensip olarak, metastatik kanserin çeşitli klinik öncesi fare modellerinde çeşitli ilaçların etkinliğini değerlendirmek için uyarlanabilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası bir araştırmacı olan Dr. Marianna Vitiello ve IFC-CNR'de araştırmacı olan Dr. Claudia Kusmic olacak. Melanom indüksiyonu için, üst sırtın yaklaşık bir santimetrekarelik traşlanmış cildine üst üste üç gün boyunca üç mikrolitre beş milimolar 4-hidroksitamoksifen uygulayın.

Cilt boyamasından altı hafta sonra, primer tümörün hacmini ve nihayetinde deri altı metastazlarını ölçmek için kumpaslar kullanın. Daha sonra, inguinal lenf düğümlerinin hacmini ölçmek için ultrason görüntüleme kullanın. Primer tümör ve lenf düğümlerini görsel muayene ile analiz ettikten sonra, histolojik çalışmalar için bunları tüketin.

Anesteziyi onayladıktan sonra, hayvanı ultra yüksek frekanslı ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış bir tahtasına aktarın ve hayvanı sırtüstü pozisyonda tutun. Farenin vücut sıcaklığını fizyolojik aralıkta tutmak için petrol jölesi ile yağlanmış bir rektal prob kullanarak kart sıcaklığını ayarlayın. Ön ve arka pençeleri iletken macunla kaplayın ve tahtaya gömülü EKG plakası elektrotlarına bantlayın.

Fizyolojik parametrelerin doğru şekilde alındığını ve görüntülendiğini kontrol edin. Bir tüy dökücü ajan uygulayarak her iki kasık bölgesinden saçları çıkarın ve akustik bir bağlantı ortamı ile kaplayın. Ardından, ultra yüksek frekanslı ultrason lineer probunu görüntüleme istasyonuna gömülü özel bir 3D motora sıkıştırarak probun otomatik ve kademeli olarak hareket etmesini sağlar.

Kasık lenf nodunun kısa erişimli görüntülerini elde etmek için ultrason probunun konumunu uygun şekilde yönlendirin ve ayarlayın ve ilgi alanını odak bölgesine yerleştirin. Tarama Mesafesi'ni iki ila beş milimetre arasında, Adım Boyutu'nu lenf nodu dilimi başına 46 ila 114 tarama adımı ve hayvan başına bir ila üç dakikalık bir edinme süresiyle 44 mikrometreye ayarlayın. Kasık lenf nodunun tüm hacmini 2D B modu görüntülerin bir dizisi olarak tarayın, solunum ve kardiyak kapılı sinüs döngüleri açısından 3D veriler üretmek için dönüştürücünün mikrometre ölçeğinde adım boyutlarıyla doğrusal hareketi ile birden fazla seviyede görüntüler elde edin.

Görüntülemeden sonra, daha fazla çevrimdışı analiz için elde edilen görüntüleri ham formatta dijital olarak saklayın. Ultrason görüntülerinin son işlenmesi için, 3D inguinal lenf nodu görüntülerinin veri kümesini açın, çok dilimli yöntemi seçin ve 3D alma sırasında yakalanan her görüntüye karşılık gelen tüm karelerin hem geçerli karelerini hem de küçük resimlerini görselleştirmek için Başlat düğmesine basın. Kontur görünümüne yüklemek için lenf nodunun belirgin olduğu ilk karenin küçük resmini seçin.

Konturlama görünümünde, lenf nodu sınırı boyunca noktalar bırakmak için fareye sol tıklayın. İstenilen nokta sayısı ayarlandıktan sonra, konturu tamamlamak için sağ yalayın. İlk kontur tamamlandıktan sonra, kontur için bir sonraki görüntüyü seçmek üzere küçük resim görünümünü kullanın.

Gerekirse, her 3B birim için gereken manuel izleme sayısını azaltmak için konturlar arasındaki birkaç görüntüyü atlayın. Tüm birim ana hatlarıyla belirtilene kadar bu işlemi tekrarlayın, ardından Son'a tıklayın. 3B mod pencere çalışma alanındayken, lenf nodu hacminin sayısal değerini görselleştirmek için görüntü görüntüleme alanının altındaki hacim ölçümü simgesine tıklayın ve lenf nodu hacminin 3B oluşturulmasıyla yüzey görünümünü etkinleştirin.

Farelerin 4-hidroksitamoksifen ile muamele edilmesi, CreER enzim aktivitesini indükleyerek genomik düzeyde vahşi tip Braf'tan mutasyona uğramış Braf V600E'ye geçişe neden olurken, Pten kaybolur. 4-hidroksitamoksifen tedavisinden dört hafta sonra, primer tümörler 50 ila 100 kübik milimetrelik bir hacme ulaşır ve büyümeleri iki hafta daha kaliperler tarafından ölçülebilir, böylece kasık lenf düğümlerinde gözlenen pigmentasyonda kademeli bir artış gösterir. Melanin birikintileri her zaman, melanom antijeni MelanA ve Braf V600E'nin immünohistokimyasal boyanmasıyla doğrulandığı gibi, metastaz yapmış melanom hücrelerinin varlığından kaynaklanmaktadır.

Segmentasyon fazının sonunda, tüm bölümler lenf nodunun dış konturunun bindirmesini gösterdi. 4-HT tedavisinden dört, beş ve altı hafta sonra analiz edilen sağ inguinal lenf nodunun 3D görüntüleri burada gösterilmiştir. Aynı hayvanın sol ve sağ inguinal lenf nodlarının zaman içindeki hacmindeki artış da ölçülmüştür.

Ultrason görüntülemenin uygun immünohistokimyasal boyama ile birleştirilmesi önerilir, böylece kanser hücrelerinin varlığı moleküler düzeyde doğrulanır. Lenf nodlarının yanı sıra, subkutan metastaz hacmi de ultrason görüntüleme kullanılarak zaman içinde izlenebilir. İki haftalık zaman dilimi, incelenen ilacın etkilerini takdir etmek için çok kısaysa, daha periferik bir indüksiyon bölgesi veya daha az tümöre eğilimli bir genotip seçin.