Vakum Yardımlı Sorbent Ekstraksiyonu ile İnsanla İlişkili Numunelerden Aktif Olarak Üretilen Mikrobiyal Uçucu Organik Bileşiklerin Yakalanması

Bu protokol, biyolojik bir numuneden uçucu organik bileşiklerin vakum destekli sorbent ekstraksiyon yöntemi, Entech Numune Hazırlama Rayı kullanılarak kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ve veri analizi ile ekstraksiyonunu açıklar. Ayrıca biyolojik örneklerin kültürünü ve kararlı izotop sondalamasını da açıklar.

Bu protokol, uçucu metabolitleri ve çeşitli biyolojik örneklerde mikrobiyal organizmalardan aktif olarak üretilen uçucuları kolayca konsantre etmemizi ve tanımlamamızı sağlar. VASE, düşük bolluktaki uçucuları yoğunlaştırmak için daha kullanıcı dostu bir yöntemdir. İhtiyacınız olan tek şey neredeyse vakum altında bir örnek ve gerisini fiziğin yapmasına izin verin.

Klinik örneklerin uçucu analizine erişim, bir dizi farklı hastalık durumunda metabolik biyobelirteç keşfi için önemli etkilere sahiptir. Örneğin, patojen sürüşü ve enfeksiyonu veya antibakteriyel tedavinin başarısı, tükürük, balgam veya nefes örneklerinin uçucu analizi ile tespit edilebilir. Fekal numuneler hazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde ve vorteksinde 100 miligram dışkıya üç dakika boyunca bir mililitre deiyonize su ekleyin.

Numuneleri kullanılmadığında buz üzerinde tutun. 15 mikrolitre dışkı ve su karışımına 20 milimolar 13C glikoz ile 485 mililitre BHI ortamı veya% 30 döteryum ile BHI ekleyin ve numunenin son hacminin 500 mikrolitre olmasını sağlayın. Teknik üçlü olarak numuneler hazırlayın.

Kanalizasyon numuneleri hazırlamak için, toplam bir mililitre hacim için 13C glikoz veya% 30 döteryum ile 500 mikrolitre BHI ortamına 500 mikrolitre kanalizasyon ekleyin. Numuneleri üçlü olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Tükürük örnekleri hazırlamak için, toplam 550 mikrolitre hacim için 13C glikoz veya% 30 döteryum ile 500 mikrolitre BHI ortamına 50 mikrolitre tükürük ekleyin.

Numuneleri üçlü olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun. Balgam örnekleri hazırlamak için, bir şişeye 15 mikrolitre balgam ekleyin. Numuneleri üçlü olarak hazırlayın ve buz üzerinde tutun.

Boş VOA şişelerini soğuk plakaya yerleştirin ve soğuk plakayı biyogüvenlik başlığındaki buzun üzerine yerleştirin. 5600 SPEU'yu açın ve gerekli sıcaklığa ayarlayın. 20 mililitrelik VOA şişelerini numunelere, çoğaltmalara ve HSP ID'lerine göre, buz üzerindeyken şişenin dış kısımlarında yoğuşma oluşması durumunda suya dayanıklı bir işaretleyici kullanarak etiketleyin.

Biyogüvenlik başlığının içinde, şişe üzerindeki beyaz kapağı sökün, pipet numunesini hızlıca şişeye sökün ve kapak astarı, siyah kapak ve HSP'yi monte edin. Numuneyi ve HSP'yi içeren şişeyi tekrar soğuk plakaya yerleştirin. Tüm numuneler cam şişelerde hazırlandıktan sonra, vakum pompasını açın, şişeleri vakum altına yerleştirin ve vakum kaynağını çıkarın.

Basınç göstergesini kullanarak tüm numuneleri vakum altına yerleştirdikten sonra basıncı iki kez kontrol edin. Bir şişe sızıntı yapıyorsa, kapağın sıkıca vidalandığından ve HSP ve kapak gömleklerinin beyaz O-ringlerinin doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Şişeleri, 200 RPM'de ajitasyon ile optimize edilmiş zaman ve sıcaklık için SPEU'ya yerleştirin.

70 santigrat derecede bir saat boyunca kültürleri ayıklayın ve 37 santigrat derecede 18 saat boyunca dışkı, kanalizasyon, tükürük ve balgam örnekleri ile kararlı izotip problama deneylerini çıkarın. Soğuk plakayı, ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra kullanılmak üzere eksi 80 santigrat dereceye yerleştirin. Ekstraksiyon tamamlandığında, HSP ve şişe kafa boşluğundan su buharı çekmek için numuneleri 15 dakika boyunca soğuk plakaya yerleştirin, ardından HSP'leri manşonlarına aktarın.

Entech yazılımında örneklerin sırasını ayarlayın. Programı açın ve Müzik Aleti açılır menüsünün sağındaki seçeneklerden 5800 ve Sırala'yı seçin. Sıra tablosunu kaydedin, sol tarafta Çalıştır'ı seçin, ardından boş HSP desorber değilse Desorber'da Boş ile Başlat'ı seçin.

HSP'lerin dizideki her örnek için SPR tarafından işleneceğini unutmayın. SPR'nin ısınmasına izin verin. SPR'nin tüm örnekleri otomatik olarak çalıştırmasına izin verin.

GC-MS tarafındaki dizi, verileri otomatik olarak ayrı dosyalara kaydeder. Kalibre Et'i ve ardından Dış Standart Bileşik altında Bileşik, Ad ve Ekle Bileşiğini Düzenle'yi seçerek işleme yöntemine bir tepe noktası ekleyin. Bileşiklerin adını, tutma süresini ve miktar sinyali hedef iyonunu ekleyin.

% 75'ten daha büyük bir olasılığa sahip bileşikleri içeren en büyük üç tepe noktasını ekleyin, böylece bileşiğin her bir tanımlayıcı iyonunun hizalanmasının zirvenin merkezinde olmasını sağlayın. Tamam'ı, ardından Yöntem ve Kaydet'i seçerek kaydedin. İşlem yöntemi ayarlandıktan sonra, verileri ölçmek için Quantitate and Calculate, ardından View ve QEDIT Quant Result (Niceliksel Sonucu) bölümüne geçin.

Burada, vakum yardımlı sorbent ekstraksiyonunu, bakteriyel mono-ve ko-kültürlerin uçucu profillerini araştırmak ve insan dışkısı, tükürük, kanalizasyon ve balgam örneklerinden stabil izotop sondalaması ile aktif olarak üretilen uçucuları tanımlamak için bir GC-MS üzerinde termal desorpsiyon izledi. Mono-ve ko-kültürler staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa ve acinetobacter baumannii bakteri türlerinden oluşuyordu. Mono ve ko-kültürlerden 24 ve 48 saatlik zaman noktalarında 43 açıklamalı uçucu molekül tespit edildi.

Döteryuma kıyasla 13C'nin tamamen etiketlenmiş uçucu moleküllere daha fazla dahil edilmesi söz konusuydu. 13C, tüm fekal, kanalizasyon ve tükürük örnekleri için 2-bütanon, 3-hidroksi, 2, 3-bütandion diasetil, asetik asit ve fenol içine dahil edildi. Aseton, bütanoik asit ve propanoik asit, tükürük ve kanalizasyonda etiketlenmiş olarak tespit edildi.

dimetil trisülfit ve disülfit dimetil ise hem fekal hem de tükürük örneklerinde zenginleştirilmiştir. Uçucu 1-propanol, 2-bütanon, benzofenon, etanol ve metiltiol asetat sadece kanalizasyonda ve 2, 3-pentanedion tükürükte zenginleştirildi. Döteryum, tükürük veya kanalizasyon örneklerinden uçucu asetik asit, benzaldehit, 4-metil-dimetil trisülfür ve fenol içine dahil edildi.

Asetik asit, dimetil trisülfit, aseton ve propanol 2-metil, kültürlenmiş balgam örneklerinde kültürlenmemiş balgam örneklerinden daha fazlaydı. Varyantların permute edilmiş çok değişkenli bir analizi, bir PERMANOVA, kistik fibroz balgam örneklerinden uçucu bollukların Bray-Curtis mesafe matrisi üzerinde gerçekleştirildi. Örneği bağışlayan deneğin, 13C etiketli kültürlü balgamdaki varyasyonun% 51'ini ve kültürsüz balgamdaki varyasyonun% 33'ünü açıkladığını bulduk.

Burada, kistik fibrozisli yedi kişiden toplanan kültürlü balgam örneklerinden elde edilen uçucularda 13C glikoz ile stabil izotop etiketlemenin başarısı gösterilmiştir. Numunelerin çoğunluğu için daha yüksek 13C birleşmesine sahip uçucular panel 5A'da, balgam numunelerinin çoğunda daha düşük yüzde 13C dahil olanlara sahip olanlar panel 5B'de ve balgam numunelerinin azınlığında daha düşük yüzde 13C dönüşümüne sahip moleküller panel 5C'de gösterilmiştir. Her zaman yaklaşık bir dakika sonra şişe basınçlarınızı iki kez kontrol edin.

Kırık bir vakum, VASE yönteminin hassasiyetini ve hızını yener. Bu prosedürü takiben, kararlı izotop sondalaması yapılmışsa, uçucu moleküllerin üretimine katkıda bulunmuş olabilecek mikrobiyal organizmaları veya türleri tanımlamak için DNA, kalan materyalden çıkarılabilir. Bu yöntem, izotop probu olmadan herhangi bir numune türünden uçucuların tespit edilmesinde de yararlıdır.

Hassasiyet ve düşük numune hacmi avantajları ile birçok uygulama bu teknikten yararlanabilir.