Name: Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Öğrenin, Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeksiyon yaparak genetik mühendisliği ve vektör kontrolü için transgenik sivrisinekler oluşturmayı. Bu güvenilir yöntem, sıtma eliminasyon stratejilerinde yeni uygulamalar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sivrisinek hayvancılığı için Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell ve Madeline Nottoli'ye minnettarız. Fon, Kaliforniya Üniversitesi, Irvine Sıtma Girişimi tarafından sağlandı. AAJ, Irvine Kaliforniya Üniversitesi'nde Donald Bren Profesörüdür.

1. Sivrisineklerin mikroenjeksiyona hazırlanması
<ol><li>~100 erkek ve200-300dişi 1-2 günlük yetişkin eklosion sonrası sivrisinekler ile 13 (~5000 cm 3) bir kafes tohumlayın ve 2 gün çiftleşmelerine izin verin.</li>
	<li>Çiftleşme döneminden sonra, sivrisineklere yapay bir besleme cihazı ile 2 mL kan kullanarak bir kan unu sağlayın veya böcek uygulamalarına bağlı olarak uyuşturuldu hayvanlaryaşayın 14. Ertesi gün, tüm çiftleşmiş dişilerin beslenme fırsatına sahip olmasını ve kısmen beslenen sivrisineklerin tamamen kuşatılmış olmasını sağlamak için sivrisineklere ikinci bir kan unu sağlayın.</li>
	<li>İkinci kan yemeğinden 2-4 gün sonra embriyo koleksiyonları için sivrisinekleri kullanın. NOT: Larva beslenmesi yetişkin sağlamlığı ve üreme zindeliği için önemlidir. Sağlıklı böceklerin nasıl yetiştirilmeleri hakkında bilgi için Benedict ve ark. (2020)14. Sivrisinekler yapay bir besleyiciyle beslendiğinde veya uyuşturulmuş hayvanlar yaşadığında yumurtlamada önemli bir fark gözlenmemiştir. Böcekçide Anopheles gambiae için rutin olarak hangi yöntem kullanılıyorsa onu kullanın.</li>
</ol>2. Embriyo hazırlığı
<ol><li>Her iki ucunda açık olacak şekilde kesilmiş (bant testeresi ile) şeffaf 50 mL konik tüpe 20-30 dişi yerleştirmek için bir aspiratör kullanın ve bir ucunda lateks diş filmi, diğer ucunda naylon ağ ve filtre kağıdı ile kaplanmıştır (Şekil 1). NOT: Sivrisinekler yumurtalarını filtre kağıdına yatıracak ve naylon ağ filtre kağıdını güvenli bir şekilde yerinde tutacaktır. Sivrisinek yumurtaları silindirik şekilli, ~500 μm uzunluğunda, en geniş noktasında ~200 μm çapında ve ön ve arka uçlarda sivriltmedir (Şekil 2).</li>
	<li>Sivrisinek dolu tüpü çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurulmuş küçük (60 mm x 15 mm) bir Petri kabına yerleştirin. Tüpü ve tabağı 45 dakika boyunca 28 °C'de bir inkübatöreyerleştirin (Şekil 3).</li>
	<li>Tüpü inkübatörden çıkarın ve tüpü boş bir kafese yerleştirin. Sivrisineklerin uçmasına izin vermek için tüpe hafifçe dokunun ve tüm sivrisinekler uçtuktan sonra tüpü kafesten çıkarın.</li>
	<li>Tüp sivrisineklerden arındırıldığında, alt halkayı sökün, naylonu çıkarın ve filtre kağıdını yumurtalarla birlikte tüpten dikkatlice çıkarmak için tokmaklar kullanın. Filtre kağıdını, ddH2O ile nemlendirilmiş bir filtre kağıdı tabakası içeren plastik bir Petri kabına (100 mm x 15 mm) yerleştirin.</li>
	<li>Yumurtalara dikkat edin. Açık gri renkte oldukları noktaya kadar yaşlanan yumurtalar (Şekil 4) hizalamaya hazırdır.<ol>
<li>Yumurtalar hala beyazsa, inkübatöre geri verin ve her 5 dakikada bir rengi kontrol edin. Beyaz yumurtalar kırılgandır, kolayca yırtılır ve enjeksiyon işleminden sonra düşük kuluçka ile sonuçlanan iyi hayatta kalamaz.</li>
		<li>Koyu gri veya siyah olan yumurtalar çok fazla yaşlandı. Onları kullanma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Embriyo hizalaması
<ol><li>Bir parça naylon lekeli membran (2 cm x 1 cm) jiletle kesin, kenarın düzgün bir şekilde kesildiğinden emin olun. NOT: Kenar düz değilse, enjeksiyon işlemi sırasında yumurtalar zara düzgün bir şekilde yapıştırılmış olarak kalmaz.</li>
	<li>Cam bir kaydırağın üzerine bir membran koyun ve membranı bir filtre kağıdı parçasıyla (2 cm x 2 cm) örtün ve membran filtresinin ~1 mm'si açık bırakarak (Şekil 5). NOT: Mikroskop slaytlarının kullanmadan önce temiz olduğundan emin olun ve membran filtresini işlemek için temiz tokmaklar kullanın.</li>
	<li>Filtre kağıdını deiyonize H2O ile ıslatın, çünkü uzun süre kurursa yumurtalar ölür. NOT: Enjeksiyon işlemi sırasında embriyolar hareket edeceğinden kağıda çok fazla su koymayın, ancak embriyonun kurumasını önlemek için yeterli olduğundan emin olun (Şekil 6A, B). Fazla su bir parça filtre kağıdı ile emilerekçıkarılabilir.
</li>
	<li>30-50 embriyoyu bir boya fırçası ile zarın kenarına hafifçe aktarın (boyut #0). Yumurtaları, ventral tarafın (dışbükey) yukarı bakacak şekilde kaydırağın üzerine hafifçe yuvarlayarak zar boyunca dikey olarak hizalamak için fırçayı kullanın.</li>
	<li>Tüm yumurtaları aynı yöne yönlendirin, böylece yumurtalar mikroenjeksiyon mikroskobu altında gözlendiğinde, arka uç (daha sivri, Şekil 6A, B)aşağı konumdadır ve iğne ile ~15 ° 'lik bir açı oluşturur (Şekil 6C). Zarın tüm kenarını yumurtalarla hizala (30-50) ve slaytı enjeksiyon için mikroskobun altına yerleştirin. NOT: Yumurtaları dikkatlice seçin. Beyaz (çok genç veya gelişmemiş) veya koyu gri (çok yaşlı ve iğneyi kıracak) ve anormal olanları atın (Şekil 7). Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından eminolun.
</li>
</ol>4. DNA hazırlığı
<ol><li>Enjeksiyon için plazmid DNA'ları, üreticinin protokollerini takip eden endotoksin içermeyen bir DNA plazmid maxiprep kiti ile en azından saflaştırın.</li>
	<li>DNA'yı PCR sınıfı su ve santrifüjde 17.100 x g'da, 4 °C'de 30 dakika boyunca soğutmalı bir santrifüjde yeniden kullanın. Ardından, süpernatant yeni, temiz 1,5 mL konik bir tüpe aktarın. istenmeyen partikül maddelerin sütundan aktarılmasını önlemek için dikkatlice mikro pipet.</li>
	<li>3M sodyum asetatın onda biri ve iki kat %100 etanol hacmi kullanarak ikinci bir DNA çökeltme gerçekleştirin.</li>
	<li>DNA'yı 1000 ng/μL'lik son plazmid konsantrasyonu için 300-500 μL PCR sınıfı suda yeniden kullanın. NOT: DNA -20 °C'de saklanabilir DNA mikroenjeksiyon aliquotları -20 °C'de veya RNA bileşenleri kullanılarak -80 °C'de saklanabilir. Enjeksiyon karışımında 800 ng/μL DNA'yı aşmayın, çünkü viskozite iğnelerin tıkanmasına neden olur.</li>
</ol>5. İğne hazırlama
<ol><li>Programlanabilir bir mikropipette çekme kullanarak 10 cm kuvars kılcal damarları çekerek iğneleri yapın.</li>
	<li>Ucun iyi oluştuğundan emin olmak için iğneyi mikroskop altında inceleyin. Programlanabilir çekmedeki iğne ayarının terminal ucundan ~0,5 mm sivrilmeye başlayan ve ince bir noktada biten bir uç verdiğinden emin olun (bkz. Şekil 6). Kolayca kopan iğneler genellikle çok uzun bir konik vardır. NOT: Koşullar iğne çekeceğine bağlı olarak farklılık gösterebilir (Yazarlar, kullandıkları programlanabilir çektirme ayarlarını istek üzerine kullanıma sunacaktır. Dergi kısıtlamaları belirli bir markayı alıntılamamızı engeller). İğneler elle çekilebilir, ancak bu çoğu laboratuvarda bulunmayan bir beceri seti gerektirir.</li>
</ol>6. Embriyo mikroenjeksiyon
<ol><li>İğneleri 2 μL DNA karışımı ile doldurmak için bir mikro yükleyici ucu kullanın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve otomatik basınç pompası borularını bağlayın (Şekil 8).</li>
	<li>Önemli: İğneyi slayt düzlemi ile 15° açı olacak şekilde hizalayın (Şekil 8).</li>
	<li>İlk yumurtaya dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın ve iğnenin ucunu arka direğe 10 μm ≤ sokarak enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmın küçük bir hareketine yol açacaktır.</li>
	<li>Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel sahne kontrollerini kullanın.<ol>
<li>İğne ucunun açık kalmasını ve tıkanmamasını sağlamak için, başka bir embriyoya girmeden önce Enjekte et düğmesine basın ve iğnenin açılışında küçük damlacığı görselleştirin.</li>
		<li>İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek ve damlacık görselleştirme testini tekrarlamak için Temizle düğmesine basın. Damlacığın boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz daha büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın.</li>
		<li>Bir iğne ile ~40-50 yumurta enjekte edin. NOT: Filtre kağıdının her zaman nemli kaldığından emin olun. Temiz tutmak için iğneye yeterli sırt basıncını koruyun. Tıkanamayan bir iğne yeni bir iğne ile değiştirilmelidir. Aşamanın yatay hareketi için koaksiyel kontrolleri olan mikroskoplar ile embriyo yerleştirilmesi, iğne yerleştirilmesi ve enjeksiyonu kolaylaşır (Şekil 9).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mL deiyonize H2O (Şekil 10)ile doldurulmuş bir cam kaba durulayın. NOT: Embriyolar enjeksiyondan 2 gün sonra yumurtadan çıkmaya başlar ve 3-5 gün kadar sürebilir. Yumurtadan çıkan ilk başlangıç larvaları derhal su ve yiyecek içeren temiz bir kaba hemen (günde 2 kez kontrol edin) aktarılmalıdır.</li>
</ol>

<ol><li>Feramisco, J., Perona, R., Lacal, J. C. Needle Microinjection: A Brief History. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFeramisco%2C+J+%22Microinjection.+Methods+and+Tools+in+Biosciences+and+Medicine%22">Microinjection. Methods and Tools in Biosciences and Medicine</a>. Lacal, J. C., Feramisco, J., Perona, R. , Birkhauser. Basel. (1999).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Meredith, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integration+and+expression+of+an+anti-malarial+gene+in+transgenic+Anopheles+gambiae+significantly+reduces+Plasmodium+infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Site-specific integration and expression of an anti-malarial gene in transgenic Anopheles gambiae significantly reduces Plasmodium infections.</a> PLoS One. 6 (1), 14587(2011).</li>
<li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Carballar-Lejarazu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (37), 22805-22814 (2020).</li>
<li>Simões, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Anopheles+FBN9+immune+factor+mediates+Plasmodium+species-specific+defense+through+transgenic+fat+body+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Develomental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Anopheles FBN9 immune factor mediates Plasmodium species-specific defense through transgenic fat body expression.</a> Develomental & Comparative Immunology. 67, 257-265 (2017).</li>
<li>Arik, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Akt+signaling+in+the+mosquito+fat+body+increases+adult+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Increased Akt signaling in the mosquito fat body increases adult survivorship.</a> FASEB Journal. 4, 1404-1413 (2015).</li>
<li>Riabinina, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+olfactory+centres+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Organization of olfactory centres in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Nature Communications. 7, 13010(2016).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Dong, Y., Simões, M. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+transgenic+multistage+effector-gene+combinations+for+Plasmodium+falciparum+suppression+in+Anopheles%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Versatile transgenic multistage effector-gene combinations for Plasmodium falciparum suppression in Anopheles.</a> Science Advances. 6 (20), (2020).</li>
<li>Grossman, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+malaria+vector%2C+Anopheles+gambiae%2C+with+the+piggyBac+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element.</a> Insect Molecular Biology. 6, 597-604 (2001).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Anopheles+research.+Chapter+3%3A+Specific+Anopheles+techniques.+3.1+Embryonic+Techniques.+3.1.1+Microinjection+methods+for+Anopheles+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BEI+resources%22%5BJournal%5D)">Methods in Anopheles research. Chapter 3: Specific Anopheles techniques. 3.1 Embryonic Techniques. 3.1.1 Microinjection methods for Anopheles Embryos.</a> BEI resources. , Manassas, Virginia. (2015).</li>
<li>Pham, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito%2C+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles stephensi.</a> PLoS Genetics. 15 (12), 1008440(2019).</li>
<li>Benedict, M. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pragmatic+selection+of+larval+mosquito+diets+for+insectary+rearing+of+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pragmatic selection of larval mosquito diets for insectary rearing of Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> PLoS One. 15 (3), 0221838(2020).</li>
<li>Carballar-Lejarazú, R., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+modification+of+Anopheline+species+to+control+malaria+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Population modification of Anopheline species to control malaria transmission.</a> Pathogens and Global Health. 111 (8), 424-435 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

CRISPR/Cas9 gibi hassas ve esnek genetik mühendislik teknolojilerinin kullanılabilirliğinin artmasıyla transgenik organizmalar daha önce mümkün olandan daha basit ve istikrarlı bir şekilde geliştirilebilir. Bu araçlar, araştırmacıların patojenlere (popülasyon modifikasyonu) veya kalıtsal steriliteye (popülasyon bastırma) refrakterliğin istenen özelliklerini elde etmeye çok yakın olan sivrisinek vektörlerinin transgenik suşlarını oluşturmalarına izin verdi. Bununla birlikte, mümkün olan en güvenli ve istikrarlı genetiği d...

Mikroenjeksiyon teknikleri 1900'lerin başından beri organizmaları deneysel olarak manipüle etmek için kullanılmaktadır1. Mikroenjeksiyon, hem temel biyolojik fonksiyonları incelemek hem de istenen bir organizmanın biyolojisinde önemli değişiklikler sağlamak için kullanılmıştır. Mikroenjeksiyon tekniği vektör biyologlarının özellikle ilgisini çekmiştir ve vektör genomlarını manipüle etmek için yaygın olarak kullanılmıştır2-11. Eklembacaklı vektörlerdeki transgenez deneyleri genellikle vektörün kondisyonını azaltan veya ilettikleri patojenlere refrakterliği artıran değişiklikleri yürürlüğe koyarak vektörleri patojenlerin iletiminde daha az verimli hale getirmeyi amaçlamaktadır. Sivrisinekler çeşitli insan patojenlerini iletir ve dünya çapında morbidite ve mortalite üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Sivrisineklerin Anopheles cinsi, insan sıtma parazit patojenleri plasmodium spp'yi iletir. Anopheles ile yapılan genetik mühendislik deneyleri, yeni sıtma eliminasyon stratejileri geliştirme çabalarında biyolojiyi daha iyi anlamayı ve bu sivrisineklerin vektörel kapasitesini azaltmayı amaçladılar.
Dünya çapında en fazla sıtma enfeksiyonuna katkıda bulunan sivrisinek vektörleri Anopheles gambiae türleri kompleksindedir. Bununla birlikte, başarılı transgenez deneylerinin çoğu Hint alt kıtasının sıtma vektörü anopheles stephensiüzerinde gerçeklenmiştir. Laboratuvara uyarlanmış birçok Anopheles gambiae suşu mevcut olsa da, literatürde bildirilen transgenik Anopheles gambiae spp. çizgilerinin sayısı Anopheles stephensiile karşılaştırılamaz. Anopheles gambiae embriyosuna enjekte etmenin ve başarılı transgenez elde etmenin Anopheles stephensi'den daha zor olduğu düşünülmektedir Bu farklılıkların nedenleri bilinmemekle birlikte. Bu protokol, Mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles gambiae embriyolarının transgenezini elde etmede sürekli olarak başarılı olduğu kanıtlanmış bir yöntemi açıklar. Protokol, daha önce Hervé Bossin ve Mark Benedict12 tarafından geliştirilen ve transgenezin verimliliğini artırdığı tespit edilen bazı ek ayrıntılar ve değişikliklerle birlikte geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>10x Mikroenjeksiyon Tamponu</td> <td>-</td><td></td> <td>1 mM NaHPO< alt > 4 < / alt> tampon, pH 6.8, 50 mM KCl</td></tr><tr><td>Lekeleme membranı (Zeta-Probe GT Genomik Test Edilmiş Lekeleme Membranı)</td> <td>Bio-Rad</td><td></td><td>Düzgün ve düz bir şekilde 2x1 cm'lik parçalar halinde kesilmiş</td></tr><tr><td>Konik tüpler 50 ml (tek kullanımlık santrifüj tüpü, polipropilen)</td><td>Fisher Marka</td><td></td><td>Uçlar kesim</td></tr><tr><td>Deiyonize veya çift damıtılmış su (ddH20)&nbsp;</td><td>Mili-Q</td><td></td><td>Yıkama şişesinde&nbsp;</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Leica MZ12</td><td>Embriyo hizalama</td></tr><tr><td>forseps&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 numara beden&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam kap&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>No. 3140</td><td>125 x 65</td></tr><tr><td>Cam kaydırak&nbsp;</td><td>Fisher Marka</td><td>No. 12-549-3</td><td>75x26 mm</td></tr><tr><td>Kuluçka Makinesi</td><td>Barnsted Lab-line</td><td>Model No. 150</td><td>28 & C</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>50 mM</td></tr><tr><td>Lateks diş filmi&nbsp;</td><td>Crosstex International</td><td>No. 19302</td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjektör</td><td>Sutter Aleti</td><td></td><td>XenoWorks Dijital Mikroenjektör</td></tr><tr><td>Mikro Yükleyici Pipet uçları&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>20 ve mikro; L mikro yükleyici epT.I.P.S.</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Sutter Aleti</td><td></td><td>XenoWorks Mikromanipülatör</td></tr><tr><td>Mikropipet&nbsp;</td><td>Yağmur&nbsp;</td><td></td><td>20 ve mikro; L</td></tr><tr><td>Mikropipet çektirmesi&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>Sutter P-2000 mikropipet çektirme</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu&nbsp;</td><td>Mikroenjeksiyon için</td> <td>Leica</td><td>DM 1000 LED veya M165 FC</td></tr><tr><td>Minimum fiber filtre kağıdı&nbsp;</td><td>Fisher Marka</td><td>No. 05-714-4</td><td>Kromatografi Kağıdı, Kalın&nbsp;</td></tr><tr><td>Sivrisinekler&nbsp;</td><td>MR4, BEI Kaynakları</td><td></td><td>Anopheles gambiae, çiftleşmiş yetişkin dişiler, eklosiyondan 4-5 gün sonra kanla beslenen</td></tr><tr><td>NaHPO4 tampon&nbsp;</td><td></td><td></td><td>1 mM, ph 6.8</td></tr><tr><td>Naylon örgü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boya fırçası</td><td>Blick</td><td>No. 05831-7040</td><td>İnce, boyut 4/0</td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td></td><td></td><td>Plastik, (60x15 mm, 90x15 mm)</td></tr> <tr><td>Sodyum asetat</td><td></td><td></td> <td>ve nbsp; 3M</td></tr><tr><td>Kuvars cam kılcal damarlar&nbsp;</td><td>Sutter Enstrüman</td><td>No. QF100-70-10</td><td>Filamentli, 1 mm OD,&nbsp; ID 0.7 10 cm uzunluk</td></tr><tr><td>Su PCR sınıfı&nbsp;</td><td>Roche</td><td>No. 03315843001</td><td></td></tr></tbody></table>

anopheles gambiae embriyoları için mikroenjeksiyon yöntemi

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embriyo mikroenjeksiyon teknikleri böcek türlerinin birçok moleküler ve genetik çalışması için gereklidir. İlgi genlerini kodlayan eksojen DNA parçalarının yanı sıra böcek germline olumlu özellikleri istikrarlı ve kalıtsal bir şekilde tanıtmak için bir araç sağlarlar. Ortaya çıkan transgenik suşlar, temel soruları yanıtlamak için entegre DNA'nın ifadesinden kaynaklanan veya pratik uygulamalarda kullanılan fenotipik değişiklikler için incelenebilir. Teknoloji basit olmasına rağmen, verimliliği en üst düzeye çıkaran bir beceri seviyesine ulaşmak için araştırmacı sabrı ve uygulaması gerekir. Burada gösterilen Afrika sıtma sivrisinek embriyolarının mikroenjeksiyonu için bir yöntemdir, Anopheles gambiae. Amaç, gelişmekte olan mikromline (kutup) hücrelerinde alınabilmesi için embriyoya mikroenjeksiyon eksojen DNA ile teslim etmektir. Transposazların, integrazların, rekombinazların veya diğer nükleazların enjekte edilen DNA'sından (örneğin CRISPR ilişkili proteinler, Cas) gelen ifade, kromozomlara kovalent yerleştirilmesine yol açan olayları tetikleyebilir. Bu teknolojilerden üretilen Transgenik An. gambiae, bağışıklık sistemi bileşenlerinin, kan beslemede rol oynayan genlerin ve koku sisteminin elemanlarının temel çalışmaları için kullanılmıştır. Ek olarak, bu teknikler sıtma parazitlerinin bulaşmasını kontrol etmeye yardımcı olabilecek özelliklere sahip An. gambiae suşları üretmek için kullanılmıştır.

Açıklanan mikroenjeksiyon protokolünün uygulanmasının temsili bir örneği Carballar-Lejarazú ve ark5 .'debulunabilir. Buradaki amaç, An. gambiae'ninG3 laboratuvar suşunun mikrop hattına otonom bir gen tahrik sistemi yerleştirmekti. Sistem, ommochrome biyosentezinin son adımı olan 3 hidroksikynureninin ksanthommatin'e dönüşümünü katalizleyen bir heme peroksidaz kodlayan bu türdeki üçüncü kromozom üzerindeki kardinal ortolog lokusu(Agcd)hedeflemek için tasarlanmıştır (<stro...

Mikroenjeksiyon teknikleri, sivrisineklerin genomlarına eksojen genleri sokmak için gereklidir. Bu protokol, James laboratuvarı tarafından DNA yapılarını dönüştürülmüş sivrisinekler üretmek için Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeze etmek için kullanılan bir yöntemi açıklar.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Bu protokol önemlidir, çünkü yaygın genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak tarihsel olarak dönüştürülmesi zor olan anopheles gambiae için belirli bir mikroenjeksiyon yöntemi sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, transgenik Anopheles gambiae'yi güvenilir bir şekilde oluşturmasıdır. Bu tekniğin uygulamaları, popülasyon bastırmaya veya vahşi tip Anopheles gambiae popülasyonlarının değiştirilmesine uygun sivrisineklerin oluşturulmasını kolaylaştırarak sıtma eliminasyonu için yeni stratejilere doğru uzanmaktadır.Bu metodoloji farklı sivrisinek türlerine kolayca uyarlanabilir. Mikroenjeksiyon teknolojimiz sabır ve pratik gerektirir. Bir öğrenme eğrisi var.Başlamak için, şeffaf 50 mililitrelik konik bir tüpe 20 ila 30 dişi yerleştirmek için bir aspiratör kullanın. Tüpün her iki ucundan da kesildiğinden ve bir ucunda lateks diş filmi, diğer ucunda ise sivrisineklerin yumurtalarını bırakacakları naylon ağ ve filtre kağıdı ile kaplı olduğundan emin olun. Sivrisinek dolu tüpü çift damıtılmış suyla dolu küçük bir Petri kabına yerleştirin, ardından tüpü ve kabı 45 dakika boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.Tüpü inkübatörden çıkarın ve tüpü boş bir kafese yerleştirin. Sivrisineklerin uçmasına izin vermek için tüpe hafifçe dokunun. Tüm sivrisinekler uçtuktan sonra tüpü kafesten çıkarın.Tüp sivrisineklerden arındırıldığında, alt halkayı sökün, naylonu çıkarın ve filtre kağıdını yumurtalarla birlikte tüpten dikkatlice çıkarmak için tokmaklar kullanın. Yumurta yüklü filtre kağıdını suyla nemlendirilmiş bir filtre kağıdı tabakası içeren plastik bir Petri kabına yerleştirin. Temiz bir cam kaydırağa bir zar koyun ve membranı bir filtre kağıdı parçasıyla örtmek için temiz önps kullanın ve membran filtresinin yaklaşık bir milimetresini açık bırakın.Filtre kağıdını deiyonize suyla ıslatın, ardından fırçayı kullanarak 30 ila 50 embriyoyu zarın kenarına hafifçe aktarın ve yumurtaları zar boyunca dikey olarak hizalayın. Yumurtaları aynı yöne yönlendirin, böylece yumurtalar mikroenjeksiyon mikroskobu altında gözlendiğinde, arka uç aşağı konumdadır ve iğne ile 15 derecelik bir açı oluşturur. Zarın tüm kenarını yumurtalarla hizala.İğneleri iki mikrolitre DNA karışımı ile doldurmak için bir mikro doldurucu ucu kullanın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin ve otomatik basınç pompası borularını bağlayın. İğneyi, slaytın düzlemi ile 15 derecelik bir açı olacak şekilde hizalayın.İlk yumurtaya dikkatlice dokunarak iğne ucunu açın, ardından iğnenin ucunu arka direğe yaklaşık 10 mikrometreye yerleştirin. Başarılı bir enjeksiyon, yumurta içindeki sitoplazmın küçük bir hareketine yol açacaktır. Enjeksiyona devam etmek için bir sonraki yumurtaya geçmek için mikroskop koaksiyel sahne kontrollerini kullanın.İğne ucunun açık kalmasını ve tıkanmamasını sağlamak için, başka bir embriyoya girmeden önce Enjekte et düğmesine basın ve iğnenin açılışındaki küçük damlacığı görselleştirin. İğne tıkanırsa, iğneyi temizlemek ve damlacık görselleştirme testini tekrarlamak için Temizle düğmesine basın. Damlacık boyutunun küçük kalmasını sağlamak için iğne ucu açıklığı biraz daha büyürse basıncı gerektiği gibi ayarlayın.Bir iğne ile yaklaşık 40 ila 50 yumurta enjekte edin. Enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, yumurtaları filtre kağıdı ile kaplı ve 50 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş bir cam kaba durulayın. Bu protokol kullanılarak, Anopheles gambiae'nin G3 laboratuvar suşunun mikrop hattına otonom gen tahrikli bir sistem yerleştirildi.Sistem, bu türdeki üçüncü kromozom üzerinde kardinal ortolog veya Agcd'yi hedeflemek için tasarlanmıştır. Plazmid pCO37 gösterilir. Nanos gen ortologunun düzenleyici unsurlarının kontrolü altında Streptococcus pyogenes Cas9 endonuclease içerir.Ek olarak, bir U6 gen promotörü ve siyan floresan proteini ifade eden 3XP3 CFP baskın marker kasetinin kontrolü altında bir rehber RNA'ya sahiptir. Moleküler yaklaşımlar, AgNosCd-1 olarak belirlenen yaklaşık 10 kilo baz DNA çiftinin doğru yerleştirilmesini doğruladı. Kapsamlı takip analizleri, AgNosCd-1'in tahrikte yüksek verimli olduğunu, az sayıda dirençli alel yarattığını ve gen tahrik sisteminin entegrasyonu ve ekspresyoyunu nedeniyle büyük bir genetik yükü olmadığını göstermiştir.Sivrisinek içeren homozigot gen güdüsü, larvalar, pupalar ve yeni ortaya çıkan yetişkinlerin kırmızı göz fenotipine sahip fonksiyon kaybı mutantlarıydı. Bu protokolü denerken, 88'de tutmak, açık gri yumurtalara iyi bir kuluçka için çok önemlidir ve beyaz yumurtalardan kaçının.

microinjection-method-for-anopheles-gambiae-embryos

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Anofel stephensi sivrisinekler, sıtma yaşayan Hindistan ve Asya'da vektörleri. Bu video bu türün sivrisinek sıtma karşı direnç kazandırırlar transgenlerin microinjections gerçekleştirmek için teknik göstermektedir. Bu video gösterdi metodoloji diğer sivrisinek türlerinin mikroenjeksiyon teknikleri uygulanabilir.

Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Bu video, Nijole Jasinskiene Dang humması için vektörler transgenik Aedes aegypti sivrisinek, üretmek için kullanılan yöntem gösteriyor. Doğru, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması embriyolar dessicating ve mikroenjeksiyon teknikleri gösterilmektedir.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

Bu videoda, mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles embriyosunda phiC31 aracılı bölgeye özgü transgen entegrasyonunu gösteriyoruz. Bu yöntem, istenen genlerin araştırma ve endüstriyel uygulamalar için bir konak sisteme sokulmasına yardımcı olur.

phiC31-İntegraz Aracılı Bölgeye Yönelik Transgen Entegrasyonu: Bir Anofel Vektörüne Bölgeye Özgü Transgen Entegrasyonu için Bir Mikroenjeksiyon Tekniği

Bu videoda, embriyo mikroenjeksiyon tekniği ile Anopheles gambiae sivrisineğinin embriyosuna gen sürücü yapısının verilmesini gösteriyoruz. Bu prosedür, homolog rekombinasyon yoluyla iletilen DNA yapısının, dönüştürülmüş sivrisinek popülasyonu oluşturmak için germ hattı hücrelerine entegrasyonuna izin verir.

Sivrisinek Embriyo Mikroenjeksiyonu: Germ Hattı Mutasyonları Oluşturmak için Anopheles Gambiae'nin Embriyo Sarısına Ekzojen DNA Verme Tekniği

Morphant embriyolar üretme yöntemleri gelişim düzenleyici mekanizmalarının ve gen ağları incelemek için gereklidir. Deniz yıldızı Patiria miniata bu çalışmalar için gelişmekte olan bir model sistem. Burada bir embriyo kültürleri, gamet elde üretmek için protokol ve bu türlerden zigot hızlı mikroenjeksiyon sunuyoruz.

Mikroenjeksiyonu Bir Yöntem Patiria Minata Zigotların

Akdeniz meyve sineği (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) dünya çapında bir tarım zararlısıdır. Biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması, medfly popülasyonlarını kontrol etmenin ve böylece ekonomik etkiyi azaltmanın anahtarıdır. Embriyo mikroenjeksiyonu, bu türde hem germ hattı transformasyonuna hem de ters genetik çalışmalara olanak sağlayan temel bir araçtır.

Dünya Tarım Pest Böcek Embriyo Mikroenjeksiyon yoluyla Nükleik Asitler teslim edilmesi,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.

Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Bu makale, Drosophila'daki phiC31 integraz aracılı transgenezi örnek olarak almakta ve transgenik sinekler oluşturmak için çok önemli bir adım olan embriyo mikroenjeksiyonu için optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır.

Drosophila'da Transgenez için Embriyo Mikroenjeksiyonu

Öğrenin, Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeksiyon yaparak genetik mühendisliği ve vektör kontrolü için transgenik sivrisinekler oluşturmayı. Bu güvenilir yöntem, sıtma eliminasyon stratejilerinde yeni uygulamalar sağlar.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Daha fazla video keşfet