Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR
28 Haziran 2021
Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.
Bu protokol, gen tarafından düzenlenen sivrisinek popülasyonlarında Indel mutasyonlarının yaygınlığını ve göreceli miktarını belirleyebilen NHEJ analizi için yüksek verim ve güvenilir bir makyaj sağlar. Bir sonraki nesil veya Sanger dizilimi ile karşılaştırıldığında, ddPCR, genetik varyasyonun genetiği değiştirilmiş organizmalar için hızlı ve eksiksiz bir şekilde analiz edilmesine izin veren sonuçlar için daha hızlı geri dönüş süresine sahiptir. Bu yöntem genel olarak tüm deneysel sistemler için geçerli olmalıdır.
Prosedürü gösteren, Yang'ın laboratuvarından bir personel araştırma görevlisi olan Thai Pham olacak. Başlangıç olarak, metinde açıklanan oranlarda ddPCR süper karışım, ileri ve ters astarlar, HEX veya FAM probları, DNA ve su ekleyerek dijital damlacık PCR veya ddPCR örnek karışımının 25 mikrolitresini hazırlayın. Daha sonra girdapla reaksiyonun iyice karıştırılması.
50 mikrolitrelik çok kanallı pipet kullanarak, ddPCR numune karışımının 20 mikrolitresini kartuşun orta sırasına yükleyin. Daha sonra pipetleme boyunca kabarcıklar üretmeden yağın 70 mikrolitresini alt sıraya yüklemek için 200 mikrolitrelik çok kanallı bir pipet kullanın. Contayı sadece kenarlara dokunarak, merkezden, betondan bölgeden kaçınarak yerleştirin ve ardından plakayı damlacık jeneratörüne güvenli bir şekilde yerleştirin ve çalıştırmayı başlatmak için kapağı kapatın.
Daldırma karışımını kartuşun üst sırasından 96 kuyu plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve 30 ila 45 derecelik bir açıyla üç ila beş saniye boyunca 40 mikrolitre sıvı numune bırakın. Daha sonra karışımı 45 derecelik bir açıyla üç saniyeden fazla yavaşça kuyuya atın, yandan aşağı düşmesine izin verin ve ardından sıvıyı tamamen dışarı atmak için pipetin ikinci durağına gidin. Folyo ısı contalarını kullanarak plakaları 180 santigrat derecede beş saniye kapatın.
Mühürlü plakayı termositlere yerleştirin ve ilk denatürasyonu 10 dakika boyunca 95 santigrat dereceye ayarlayarak NHEJ bırakma yönergeleri için PCR koşullarını ayarlayın. Ardından, denatüre etmek için 30 saniye boyunca 94 santigrat derecelik 40 döngü, bir dakikadan tavlaya 55 santigrat derece ve uzatmak için iki dakika boyunca 60 santigrat derece ayarlayın. 40 döngüden sonra, 10 dakika boyunca 98 santigrat derecede tutun ve dört santigrat derecede son tutuş yapın.
Tüm adımlar için saniyede iki santigrat derecelik bir rampa hızı kullanın. Tavlama sıcaklığı, kullanılan problara veya astara göre değişecektir. Plakayı, sol üstte iyi etiketlenmiş A1 ile damlacık okuyucuya güvenli bir şekilde yerleştirin.
Programı açın ve FAM'ı bilinen referans kanalı ve HEX'i her kuyu için bilinmeyen kanal olarak belirleyerek plakayı ayarlayın. Ardından, her örneğin adını değiştirin. Şablonu kaydederken damlacık okuma deneyini doğrudan niceleme olarak çalıştırın.
Yazılım analizi için doğru deneysel parametreleri belirleyin, yani örnek bilgiler, süper karışım, hedef adı, hedef türü, sinyal kanalı bir ve kanal iki. Ardından, güvenilir sonuçlar için damlacık sayısı eşiğini 10.000'in üzerine ayarlayın. Ardından, damlacık sekmesindeki her kuyu için damlacık sayısını kontrol edin ve hepsinin 10.000'in üzerinde olduğundan emin olun.
Son olarak, negatiflerden verimli sinyal ayırma için 1D genliği kontrol edin. Plaka düzenleyicisinde, tüm plakayı vurgulayın ve deneme türünü bırakacak şekilde ayarlayın. WT hedefini referans olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve HEX için kanal 2'yi belirleyin.
NHEJ hedefini bilinmiyor olarak ayarlayın, FAM için kanal 1 ve kanal 2'yi yok olarak belirleyin. 2D genlik sekmesinde, her örnek için grafik araçlarıyla küme eşiklerini ayarlayın. Kuyruk normalde NHEJ tahlilleri için WT kümesi ile ilişkilidir.
Oran sekmesinin altında, grafiğin sağ üst kısmındaki dişli simgesine tıklayın ve NHEJ olaylarının yüzdesine karşılık gelen bir noktayı çizmek için kesirli bolluğu seçin. Her biri çeşitli NHEJ alelleri içeren 10 sivrisinekten oluşan 15 farklı çekilmiş örnek, bırakma tahlilleri kullanılarak analiz edildi ve tespit edildi ve sonuçlar 15 örneğin tamamının% 100 Indel alelleri taşıdığını gösterdi. Başka bir deneyde, farklı NHEJ yüzdelerine sahip 11 çekilmiş yabani tip sivrisinek ve NHEJ sivrisinek örneği bu ddPCR protokolü ile incelendi.
Sonuçlar, tanımlanan yüzdenin amplicon analiz tekniği ile Indel tespitine nispeten yakın olduğunu göstermiştir. Kabarcıkları önlemek için yavaşça pipet ve tüm emülsifiye damlacıkların kuyuların duvarından damlamasına izin verin.
Genel Bakış
Bu protokol, Cas9 kesimi sonrası non-homologous end-joining (NHEJ) olaylarını analiz etmek için dijital damla PCR (ddPCR) adımlarını özetlemektedir. Genetiği değiştirilmiş organizmalarda Indel mutasyonlarını kantitif hale getirmek için güvenilir bir yöntem sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gen Mühendisliği
- Moleküler Biyoloji
- Genomik
Arka Plan
- NHEJ, kritik bir DNA onarım mekanizmasıdır.
- ddPCR, geleneksel sekanslama yöntemlerine göre avantajlar sunar.
- Gen modifikasyonunda alan uygulamaları için hızlı analiz esastır.
- Bu yöntem çeşitli deneysel sistemlerde uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- NHEJ olaylarının ddPCR analizi için detaylı bir protokol sağlamak.
- Modifiye edilmiş organizmalarda genetik varyasyonların kantitif hale getirilmesini kolaylaştırmak.
- Indel mutasyonlarını tanımlamada ddPCR'nin etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Spesifik reaktiflerle ddPCR örnek karışımının hazırlanması.
- Örneklerin damla jeneratöre ve termosikler'e yüklenmesi.
- NHEJ analizi için PCR koşullarının ayarlanması.
- Damla okuma ve veri analizi için yazılımın kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Tüm analiz edilen örnekler %100 Indel allelleri göstermiştir.
- ddPCR sonuçları, amplikon analiz teknikleriyle karşılaştırılabilirdir.
- NHEJ olaylarının güvenilir kantitif hale getirilmesi sağlanmıştır.
- Yöntem, genetik varyasyon analizinde verimliliği göstermiştir.
Sonuçlar
- ddPCR, NHEJ olayı analizi için sağlam bir araçtır.
- Protokol, çeşitli genetik çalışmalar için uyarlanabilir.
- Hızlı geri dönüş süresi, genetikte araştırma yeteneklerini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Digital-droplet PCR (ddPCR) enables rapid, quantitative detection of indel mutations in genetically modified mosquito populations, supporting high-throughput assessment of CRISPR-Cas9 editing fidelity. This method provides a field-deployable alternative to sequencing with faster turnaround, facilitating timely decision-making in gene drive and vector control programs. By delivering population-level mutation frequency data, ddPCR aids in de-risking genetic constructs and evaluating off-target potential during preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies indel mutation prevalence to assess CRISPR-Cas9 editing efficiency and mutagenesis consistency in target genomes.
- Operational Value: Enables rapid screening of edited mosquito pools to confirm on-target activity before advancing to functional assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative NHEJ event data without requiring individual sequence identification, supporting scalable mutation burden assessment.
- Operational Value: Compatible with field-site laboratory implementation, reducing dependency on centralized sequencing infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Measures indel allele frequency across pooled samples to correlate genetic variation with phenotypic outcomes in gene drive systems.
- Operational Value: Delivers results faster than Sanger or next-generation sequencing, accelerating iteration cycles in preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
ddPCR fits into the discovery continuum by enabling quantitative mutation analysis after gene editing and before phenotypic screening, supporting go/no-go decisions based on editing precision.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying NHEJ-derived indels as a proxy for editing efficiency at target loci.
- Screening: Provides standardized, reproducible quantification of mutation frequency across large sample sets for assay readiness.
- Analytics: Outputs fractional abundance of NHEJ events, allowing comparison of editing conditions and guide RNA performance.
- Translational Research: Enables continuity from edited construct validation to population-level genetic stability assessment.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable across insect and other model systems for consistent NHEJ analysis in genetic engineering workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in editing fidelity through quantitative indel detection, reducing mechanistic ambiguity in gene-edited systems.
- Operational Value: High-throughput capability with minimal hands-on time and rapid results, improving lab throughput.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by establishing mutation frequency thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene drive constructs based on validated editing precision.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ddPCR setup, including sample preparation, droplet generation, and PCR optimization.
- Dependent on access to droplet generator, thermocycler, and fluorescence reader with appropriate channel configuration.
- Necessitates standardized primer and probe design for accurate target discrimination in NHEJ assays.
- Must account for variability in annealing temperature based on probe chemistry to ensure signal separation.
- Limited to relative quantification; does not provide allele-specific sequence information without complementary methods.
