Name: Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Keşfedin meme kanseri beyin metastazlarını incelemek için ekz vivo beyin dilimi modelini. Bu yöntem, ilaç ve radyasyon yanıtlarını fizyolojik olarak uygun bir ortamda hızlıca test etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardımları için Julia Farnan, Kayla Green ve Tiziana DeAngelis'e teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma kısmen Pennsylvania Commonwealth Evrensel Araştırma Geliştirme Hibe Programı (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) ve W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol, Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve hayvan bakım kılavuzlarına uygundur. Bu çalışmada Nu/Nu atimik dişi fareler (6-8 haftalık) kullanılmıştır.
1. Tümör hücrelerinin intrakraniyal enjeksiyonu
<ol><li>Tüm ekipmanı (cımbız, makas, dikiş makası, el matkabı) bir otoklav kuru döngüsü altında, sterilizasyon göstergesi de dahil olmak üzere sterilizasyon torbalarında 45 dakikaya kadar sterilize edin. Birden fazla hayvan üzerinde ameliyat yapıyorsanız, ısıtılmış bir boncuk sterilizatörü (3x'e kadar) kullanarak hayvanlar arasındaki aletleri sterilize edin.</li>
	<li>Fareleri kullanıcıların hayvan bakım protokolüne göre anestezi altına alın (örneğin, izofluran (indüksiyon için% 4,% 1-2 bakım) ve ameliyata başlamadan önce analjezi (deri altı, 0.1mg / kg buprenorfin SR-LAB'nin 0.1mL'si) uygulayın. Bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın.</li>
	<li>Fareleri stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve standart kulak çubuklarını kullanarak kafayı hareketsiz hale getirin (Şekil 1A). Gözlere oftalmik merhem uygulayın.</li>
	<li>Kesiden önce tekrarlanan, alternatif iyot çubukları ve %70 etanol uygulaması (3x) ile başın yüzeyini sterilize edin.</li>
	<li>Kafatasını ortaya çıkarmak için farelerin beynini iki simetrik yarıya bölen hayali çizgiye hafif çapraz bir açıyla deriden 1 cm'lik bir orta hat kesisi yapmak için cerrahi bir neşter kullanın. Herhangi bir kanı pamuklu çubukla silin.</li>
	<li>Enjeksiyon bölgesini açığa çıkarmak için cildi yanal olarak saptırın: sağda 2 mm, bregmaya göre 1 mm öne (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/kaudal (+1RC).</li>
	<li>Kafatasına +2ML, +1RC'yi bregmaya nüfuz ettirmek için bir bur ucu (0.73 mm) kullanın ve hafif basınç ve büküm hareketi kullanarak bir delik açın.</li>
	<li>Başlangıçta şırıngayı beyne 3,5 mm derinlikte yerleştirerek steril 1x PBS'de 100.000 MDA-MB-231BR (GFP-Luciferaz'ı istikrarlı bir şekilde ifade eden) hücrelerini / μL çözeltisini 5 μL enjekte etmek için bir beyin enjeksiyon şırıngası kullanın.</li>
	<li>Şırınganın 2 dakika yerleşmesine izin verin. Yaklaşık 1 mm yukarı çekin ve 2 dakika sonra, hacmin ilk yarısını yavaşça enjekte edin.</li>
	<li>Geri kalanını enjekte etmeden önce 2 dakika daha bekleyin ve ardından son enjeksiyondan 3 dakika sonra şırıngayı yavaşça çekin. NOT: Yavaş enjeksiyon, hacmin beyin dokusu tarafından iyi emilmesine ve şırıngayı çektikten sonra sızıntı yaratmamasına izin vermede ampiriktir, bu da amaçlanan bölgenin dışında büyüyen kanser hücrelerine yol açabilir.</li>
	<li>Kafatasındaki enjeksiyon bölgesine kemik balmumu uygulayın ve ardından dokuyu dikmek için polipropilen dikişler kullanın. Fareler anestezinin çıkarılmasından sonra 5 dakika içinde iyileşir.</li>
	<li>Hızlı iyileşmeye yardımcı olmak için tuzlu su enjeksiyonu, yumuşak yiyecekler vb. dahil olmak üzere özel tedaviye ihtiyaç duyulup duyulmadığını belirlemek için ameliyattan hemen sonra yaklaşık 10 dakika, 3 saat sonra ve ertesi gün davranışlarını izleyin.</li>
	<li>Görüntüleme sisteminde biyolüminesans görüntüleme ile tümör büyümesini izleyin.<ol>
<li>Bunun için önce görüntüleme sistemindeki oksijen ve izofluranı açın. Her ikisinin de görüntüleme kutusunun dışındaki ayrı odaya dağıtılmasına izin verin.</li>
		<li>Ardından, yazılımı açın, cihazı başlatın ve tüm fare gövdesini görselleştirmek ve yakalamak için uygun seçeneği belirleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Fareleri izofluran ile ayrı odaya yerleştirin ve bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın. Farelere intraperitoneal olarak 200 μL 30 mg / mL lusiferin enjekte edin.</li>
	<li>Farelerin midesini, görüntüleme odasının oksijen ve izofluran ile beslenen burun deliğine aktarın. Odayı kilitleyin ve görüntülemeye başlamak için 2 dakikalık süre pozlamayı seçin.</li>
	<li>Tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için yazılımın ROI (ilgi bölgesi) aracını kullanın.</li>
	<li>Tümör boyutunu analiz etmek için, daire şekli aracını seçin, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin. Yatırım getirisini ölçün ve toplam okumaları raporlayın.</li>
	<li>Beyin dilimleri oluşturmadan önce 12-14 gün boyunca (veya lusiferaz yaklaşık 7.0 x 106 üniteye ulaşana kadar) katı tümör büyümesine izin verin (Şekil 1B). NOT: Enjekte edilecek hücre sayısının arttırılması daha hızlı tümör büyümesine yol açacaktır; bu nedenle, beyin dilimlerinin oluşumu 12 günden daha erken gerçekleşebilir. Öte yandan, daha büyük bir tümör, 14 gün boyunca büyümesine izin verilirse daha fazla GFP + dilimine yol açacaktır. 14 gün sonra, farelerin sağlığı hızla bozulmaya başlar; Bu nedenle hayvan sağlığı izleme, 10 günlük zaman noktasından sonra günde bir kez arttırılmalı ve dilimleri oluşturmak için ağrı ve / veya rahatsızlık belirtileri gösteren fareler kullanılmalıdır.</li>
</ol>2. Beyin dilimleri oluşturun
NOT: Steril laminer akış başlığında beyin izolasyonundan sonraki adımları uygulayın. MDA-MB-231BR hücreleri ile enjekte edilen bir fareden tümör hücreleri (lusiferaz sinyali) içeren 35-40 ayrı dilim üretmek tipik olarak mümkündür (Şekil 1C).
<ol><li>Tüm cerrahi aletleri bir otoklavda sterilize edin. Doku dilimleyiciyi steril laminer akış başlığına yerleştirin ve tüm alet ve aletleri %70 etanol ile temizleyin.</li>
	<li>İntrakraniyal MDA-MB-231BR hücre enjeksiyonundan 12-14 gün sonra, fareleri 1.2'de açıklandığı gibi kullanıcıların hayvan bakım protokolüne göre anestezi yapın. Bir ayak parmağı sıkışması ile optimum anestezi derinliği sağlayın.</li>
	<li>Beyinlerini hızla (45 saniye içinde) buz gibi soğuk (4 °C) sakaroz-ACSF'ye çıkarın ve aşağıdakilerden oluşur: 280 mM sakaroz, 5 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2,20 mM glikoz, 10 mM HEPES, 5 mM Na+-askorbat, 3 mM tiourea,2 mM Na+, 29 mM piruvat; pH=7,3.</li>
	<li>Keskin, steril bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, beynin alt kısmı da dahil olmak üzere her taraftan herhangi bir tümör içermeyen beynin fazla kısımlarını kesin.</li>
	<li>Dilimlemeyi kolaylaştırmak için 60 mm'lik bir çanak kapağı üzerindeki ACSF ıslak filtre kağıdının üzerine düz oturmak için beynin şeklini mükemmel olmayan bir küpe getirin. NOT: Tümörün büyümesinin muhtemel olmadığı beynin ekstra dokusu, çoğunlukla GFP + dilimlerinin üretilmesine izin vermek ve aletin yüzeyinde stabil olan ve dilimlemenin neden olduğu titreşimlerden rahatsız olmayacak bir beyin şekli oluşturmak için dilimlemeden önce çıkarılır.</li>
	<li>Kesme platformuna birkaç yaprak önceden ıslanmış (ACSF ile) filtre kağıdı çemberi yerleştirin ve tıkalı mendili bunun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Dokuyu 200-250 μm kesitlere bölmek için cihaz üzerindeki kesim boyutunu sağlanan cetvel üzerinde 2 veya 2,5 birime ayarlayın. NOT: 350 μm'ye kadar veya 100 μm'ye kadar ince dilimler uygulanabilir. <200 μm dilimler için bir vibratom veya komprestom kullanın.</li>
	<li>Beyin dilimlerini sakkaroz ACSF içeren bir kaba aktarmak için bir boya fırçası (samur) kullanın ve dilimleri 27 G iğneleri kullanarak hafif bir mikroskop altında ayırın.</li>
	<li>Floresan mikroskop altında GFP pozitif dilimleri tanımlayın ve steril 1 mL kırık pipet (geniş açıklık) kullanarak 2-3 mL yetişkin dilim ortamı (Nörobazal ortam A,% 2 B12 takviyesi,% 1 N2 takviyesi,% 1 glutamin,% 0.5 glikoz, 10 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) içeren yeni bir 60 mm kaba aktarın. NOT: Beyin yüzeyinde büyüyen tümör hücrelerini içeren beyin dilimleri (belki enjeksiyon hücresi sızıntısı vb. nedeniyle) hariç tutulmuştur.</li>
	<li>Her 30 mm, 0,4 μm gözenek boyutunda doku kültürü ekine, 6 delikli plakalar halinde birbirine büyümeye izin vermeyecek bir mesafede 3-5 dilim aktarın.</li>
	<li>P1000 pipet kullanarak fazla ortamı kesici ucun yüzeyinden çıkarın, her bir kesici ucun altına 1 mL yetişkin fare dilimi ortamı ekleyin ve dilimlemeden önce inkübatördeki ortamı dengeleyin.</li>
	<li>Görüntülemeden önce dokuları 37 °C, %5 CO2 ve %95 nemde 24 saat boyunca inkübe edin.</li>
</ol>3. Dilimlerin IVIS görüntülemesi
NOT: Steril laminer akış başlığında lusiferaz ve inhibitör ekleme adımları uygulayın.
<ol><li>Pipet, 5 μL'lik 30 mg/mL lusiferin çözeltisini kesici uçlarla kaldırıp kuyucuktaki ortama lusiferin ilavesinden sonra tekrar kuyuya yerleştirerek kesici uçların altındaki ortama döker.</li>
	<li>6 delikli plakayı, kapağı cihazın görüntüleme odasının içine yerleştirerek sabit kameranın altına yerleştirin ve hazne kapağını kilitleyin.</li>
	<li>Yazılımı açın ve cihazı başlatın.</li>
	<li>Görüntü başına yalnızca bir kuyunun görselleştirilmesine ve yakalanmasına izin veren kamera ayarlarını seçin. Sahneyi yukarı doğru hareket ettirin (5 cm'lik FOV) ve görüntülenmesi gereken kuyuyu doğrudan kameranın altına yerleştirin.</li>
	<li>Tümörün yayacağı lusiferazın yoğunluğuna bağlı olarak görüntüleme süresini en uygun şekilde ayarlayın, bu da 10 s ila 5 dakika arasında değişebilir. 10 sn'ye ayarlayarak başlayın ve sinyal düşükse artırın, ancak deneyin sonuna kadar tüm zaman noktaları ve koşullar için tutarlı tutun (Şekil 1D).</li>
	<li>ROI aracını (daire şekli aracı) kullanın, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin, ROI'yi ölçün ve dilimdeki her tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için toplam okumaları raporlayın.</li>
	<li>Plakayı steril laminer akış başlığına geri getirin, kesici ucu kuyudan hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.</li>
	<li>Ortamı aspire edin, 1 mL taze ortamla değiştirin ve kesici ucu tekrar kuyucuğa yerleştirin.</li>
	<li>Dilimlerin inhibitörler, metabolitler vb. gibi çeşitli bileşiklerle muamele edildiği deneyler için, reaktifin uygun konsantrasyonunu 1.5 mL'lik bir tüp içinde 1.2 mL'lik beyin dilimi ortamında hazırlayın ve ardından 1 mL'yi dilimi içeren kuyuya aktarın.</li>
	<li>Bu işlemi çalışma süresince her 48 saatte bir tekrarlayın.</li>
</ol>4. ex vivo beyin dilimlerinde tümör büyümesinin canlı görüntülenmesi
NOT: Canlı görüntüleme sırasında ek ortam eklemek mümkün olmadığından, deneyin uzunluğuna dayanacak kadar ortama (1,5 mL) sahip kesici uçlar sağlayın.
<ol><li>6 delikli plakayı inkübatörün içindeki otomatik mikroskop plakası tutucusuna yerleştirin (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem).</li>
	<li>Yazılımı açın, dilimleri görüntülemek için gereken pozlamayı ayarlamak için ilk kadranda parlak alanı açın. Dilimin konumunu ("xy" koordinatları) bulmak için, mikroskopun "xyz" koordinatlarını kontrol etmek için ikinci kadranda "xy" ile gezinin.</li>
	<li>Bu deney için kullanılan laboratuvar yazılımı olarak 6 kuyulu plakayı seçin. YG harita düzenleyicisini seçin ve yeni bir YG seçerek bu konumu kaydedin, bu YG'yi ekleyin ve kaydedin.</li>
	<li>Diğer kuyulardaki diğer tüm ilgi alanları için aynı adımları tekrarlayın. Tüm YG'leri ekledikten sonra, tüm YG'leri kaydedin.</li>
	<li>Protokol altında, Varolanı Temizle'yi seçin ve Edinme altında Zaman Aşımı'nı seçin, ardından ilgilenilen kanalları (bu durumda GFP) seçin.</li>
	<li>Netleme Ayarları'nda Otomatik Netleme'yi kapatın ve tüm dilimler için uygun odağa manuel olarak ayarlayın. Son olarak, Parlak Alan Yoğunluğu ve Floresan Kanal Uyarma ve Pozlama Süresi'ni uygun seviyeye ayarlayın.</li>
	<li>Protokolü 48 saat boyunca her 15 dakikada bir görüntü alacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Protokolü kaydedin ve çalıştırın. Denemenin sonunda, kaydedilen dosya her yatırım getirisi için yakalanan hem parlak alan hem de GFP görüntülerini içerecektir.</li>
	<li>Bir videodaki görüntüleri birleştirmek için, ilgilenilen tüm görüntüleri aynı adla yeniden adlandırın ve ardından yakalandıkları sırayla düzenlemek için ikili bir sayı ekleyin (örneğin, ROI1 (1), RO1 (2) ...)</li>
	<li>ImageJ'yi açın ve Dosya > Görüntü Dizisini İçe Aktar>a tıklayarak görüntüleri içe aktarın. Listede görünen dosya adlarını seçin ve video için seçilen dosyaları tanımlamak üzere görüntülenecek Dosya Adı İçeriği kutusuna dosyaların adının içeriğini yazın.</li>
	<li>Birleştirilen görüntüleri Dosya > Farklı Kaydet > AVI altında kaydedin.</li>
</ol>5. ex vivo beyin dokusunun MTS testi ve immünohistokimyası
<ol><li>MTS TAHLILİ<ol>
<li>Dokunun kenarları boyunca her dilimin altındaki doku kültürü zarını keserek dilimleri eksize edin ve hala zara bağlı olan dokuyu 96 delikli bir plakaya aktarın.</li>
		<li>MTS reaktifini, çözeltinin dokuya nüfuz etmesine izin vermek için, kültür ortamı ve% 0.01 triton (1x) ile 1: 5 oranında karıştırılmış olarak, her bir kuyucukta toplam 120 μL hacimde ekleyin.</li>
		<li>Beyin dilimlerini uygulanabilir hale getirmek için bir ajan olarak% 4 Paraformaldehit (PFA) kullanın ve böylece bu deney için olumlu bir kontrol sağlayın. MTS testine devam etmeden önce RT'de (oda sıcaklığında) 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de ilgilendiğiniz beyin dilimini% 4 PFA'ya batırın.</li>
		<li>MTS reaktifinin dilimler üzerinde 4 saat boyunca reaksiyona girmesine izin verin, dilimleri kuyucuklardan çıkarın ve referans olarak dilim içermeyen boş bir kuyu da dahil olmak üzere tüm koşullar için 490 nm'de emiciliği ölçün.</li>
		<li>Okumaları, dijital bir kumpas cetveli ile ölçülen doku dilimi alanının bir fonksiyonu olarak raporlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İmmünohistokimya preparatı<ol>
<li>Membran kesici uç yüzeyine tutturulmuş beyin dilimlerini 4 °C'de gece boyunca% 10 formalin içine daldırın.</li>
		<li>Gömme, işleme, bloke etme işlemlerini gerçekleştirin ve dokunun lekesiz slaytlarını oluşturun. H&E, Ki-67, gama-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI için boyama yapmak için standart immünohistokimya boyama protokolünü kullanın</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Tümörün ex vivo beyin dilimlerinde ışınlanması
<ol><li>Tümörü 6 Gy (310 kVp röntgen) ile ışınlayın. NOT: Toplam 6 Gy dozunu almak için girilen birimler, R birimleri (Victoreen elektrometresi kullanılarak ölçülür) ve dahaönce tarif edildiği gibi zımba, hava yoğunluğu ve cGy / R için düzeltmeler dikkate alındıktan sonra 3522 birimdir. Pozlama süresi 130.9 sn'dir.</li>
	<li>0,25 mm Cu +1 mm Al ilave filtrasyon, 50 cm SSD, dakikada 125 cGy kullanın.</li>
	<li>Dozimetriyi, birincil standarda göre kalibre edilmiş bir ışın içi iyonizasyon odası ile gerçekleştirin.</li>
	<li>Nem, sıcaklık ve barometrik basınç için günlük düzeltmeler yapın.</li>
</ol>

<ol><li>Watase, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+brain+metastasis-overview+of+disease+state%2C+treatment+options+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives.</a> Cancers. 13 (5), Basel. (2021).</li>
<li>Niikura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+outcomes+and+prognostic+factors+for+patients+with+brain+metastases+from+breast+cancer+of+each+subtype%3A+a+multicenter+retrospective+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).</li>
<li>Fong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li>
<li>Parker, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+glioblastoma+organotypic+slice+culture+model+for+study+of+tumor+cell+migration+and+patient-specific+effects+of+anti-invasive+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557(2017).</li>
<li>Chuang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+system+with+an+organotypic+brain+slice+and+3D+spheroid+of+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881(2013).</li>
<li>Hohensee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+mediates+the+cross+talk+between+breast+and+glial+cells+in+brain+metastases+leading+to+rapid+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression.</a> Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).</li>
<li>van de Merbel, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+Tissue+culture+model+for+the+assessment+of+individualized+drug+responses+in+prostate+and+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer.</a> Frontiers in Oncology. 8, 400(2018).</li>
<li>Martin, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tissue+slice+culture+system+to+measure+drug-response+rates+of+hepatic+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1030(2019).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li>
<li>Lim, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+preserve+the+tumor+microenvironment+and+provide+a+platform+for+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response.</a> Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Koerfer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures+of+human+gastric+and+esophagogastric+junction+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer.</a> Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).</li>
<li>Palmieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2+overexpression+increases+the+metastatic+outgrowth+of+breast+cancer+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain.</a> Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).</li>
<li>Kyeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtypes+of+breast+cancer+show+different+spatial+distributions+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases.</a> PLoS One. 12 (11), 0188542(2017).</li>
<li>Hengel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attributes+of+brain+metastases+from+breast+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Attributes of brain metastases from breast and lung cancer.</a> International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).</li>
<li>Jackson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).</li>
<li>Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+mitochondrial+dynamics+and+trafficking+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94(2020).</li>
<li>Simone, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+oxidative+stress+alters+miRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression.</a> PLoS One. 4 (7), 6377(2009).</li>
<li>Couturier, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+that+glioblastoma+recapitulates+a+normal+neurodevelopmental+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy.</a> Nature Communications. 11 (1), 3406(2020).</li>
<li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+glia+are+recruited+by+highly+proliferative+brain+metastases+of+breast+cancer+and+promote+tumor+cell+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).</li>
<li>Kondru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ex+Vivo+Brain+Slice+Culture+Model+of+Chronic+Wasting+Disease%3A+Implications+for+Disease+Pathogenesis+and+Therapeutic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development.</a> Scientific Reports. 10 (1), (2020).</li>
<li>Abu Samaan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel%27s+mechanistic+and+clinical+effects+on+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer.</a> Biomolecules. 9 (12), (2019).</li>
<li>Mewes, A., Franke, H., Singer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+of+adult+transgenic+P301S+mice--a+model+for+tauopathy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies.</a> PLoS One. 7 (9), 45017(2012).</li>
<li>Valiente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+metastasis+cell+lines+panel%3A+A+public+resource+of+organotropic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines.</a> Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek finansal çatışmaları yoktur.

Bu çalışma, ekşik ksenogreft beyin tümörleri için yeni bir ex vivo beyin kültürü yöntemi ortaya koymaktadır. Farelerin beynine intrakraniyal olarak enjekte edilen BCBM hücreleri MDA-MB-231BR hücrelerinin ex vivo beyin dilimlerinde hayatta kalabileceğini ve büyüyebileceğini gösteriyoruz. Çalışma ayrıca intrakraniyal olarak enjekte edilen U87MG glioblastoma (GBM) hücrelerini test etti ve ayrıca bu kanser hücrelerinin beyin dilimlerinde hayatta kaldığını ve büyüdüğünü buldu (veriler gösterilmedi). Bu model...

Meme kanseri beyin metastazları (BCBM), hücreler birincil meme tümöründen beyne yayıldığında gelişir. Meme kanseri, akciğer kanserinden sonra beyin metastazının ikinci en sık nedenidir ve metastazlar hastaların %10-16'sında görülür1. Ne yazık ki, beyin metastazları, hastaların %>80'i beyin metastazı tanısından sonraki bir yıl içinde öldüğü ve nörolojik işlev bozuklukları nedeniyle yaşam kalitelerinin bozulduğu için tedavi edilemez olmaya devam etmektedir2. Daha etkili tedavi seçeneklerinin belirlenmesi için acil bir ihtiyaç vardır. Tek katmanlı iki boyutlu veya üç boyutlu kültür modelleri, terapötik ajanların laboratuvarda test edilmesinde en sık kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, tümör fenotipinin ve büyümesinin önemli bir itici gücü olan karmaşık BCBM mikro ortamını taklit etmezler. Bu modeller yararlı olmasına rağmen, karmaşık tümör-stromal etkileşimleri, benzersiz metabolik gereksinimleri ve tümörlerin heterojenliğini yakalamaz3. Tümör-stromal etkileşimleri ve mikroçevre heterojenliğini daha sadık bir şekilde özetlemek için, grubumuz ve diğerleri, hasta kaynaklı tümör hücreleri (birincil veya metastatik) veya kanser hücresi hatları 4,5,6 ile organotipik beyin metastazı "dilim" kültürleri üretmeye başlamıştır. Klasik in vitro sistemlerle karşılaştırıldığında, bu kısa süreli ex vivo model, büyük hayvan kohortlarında klinik öncesi değerlendirmeden önce yeni terapötiklerin taranması için daha uygun koşullar sağlayabilir.
Ex vivo modelleri, öncelikle çeşitli kanserlerin başarılı tedavilerinin tanımlanması için inşa edilmiş ve başarıyla kullanılmıştır. Birkaç günlük değerlendirme gerektirirler ve ayrıca hastaya özgü ilaç taramasına uyarlanabilirler. Örneğin, insan mesane ve prostat kanseri ex vivo dokuları, dosetaksel ve gemsitabin7'nin doza bağımlı bir anti-tümör yanıtı göstermiştir. Kemoterapötik ilaçlar Oxaliplatin, Cetuximab ve Pembrolizumab8'i taramak için benzer kolorektal karsinom ex vivo dokular geliştirilmiştir. Bu uygulama pankreas kanserinde, pankreatik duktal adenokarsinomun stromal ortamı ile genotipik ve fenotipik özellikleri arasındaki temel etkileşim göz önüne alındığında yaygın olarak kullanılmaktadır 9,10. Ayrıca, baş, boyun, gastrik ve meme tümörlerinde benzer taramalar için bu tür organotipik modeller geliştirilmiştir11,12.
Burada, mikro-ortamlarındaki ksenograflanmış meme kanseri beyin metastatik tümör hücrelerinin ex vivo beyin dilim modeli üretilmektedir. Farelere, TNBC metastazı 14,15'in ortak bir bölgesi olan serebral korteks parietal lobunda meme kanseri beyin metastatik beyin trofik MDA-MB-231BR hücreleri 13 ile intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümörlerin gelişmesine izin verildi. Beyin dilimleri bu ksenograflanmış hayvanlardan üretildi ve 16,17'de tanımlandığı gibi organotipik kültürler olarak ex vivo tutuldu. Bu yeni ex vivo model, BCBM hücresinin beyin parankimi içindeki büyümesinin analizine izin verir ve beyin mikro ortamındaki tümör hücreleri üzerindeki terapötik ajanları ve radyasyon etkilerini test etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1 mL şırınga, kayma ucu</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 İğneler</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik mikroskop ve LUMAVIEW yazılımı</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>Beher 50 mL</td><td>Fisher</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>Künt samur boya fırçası, Boyut # 5/0</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>Kemik Balmumu</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>Beyin enjeksiyon Şırıngası</td><td>Hamilton Şirketi</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2 </td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>Bölünmüş kaspaz 3 Antikor</td><td>Hücre Sinyali</td><td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin Potasyum Tuzu</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>Çift kenarlı tıraş bıçağı</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Kağıdı (# 1), kantitatif daireler, 4,25 cm</td><td>Fisher</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>İnce samur boya fırçası #2/0</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gama-H2AX antikoru</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antikoru</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin (200 mM)</td> <td>Corning cellgrow</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>H & E ve KI-67</td><td>Jefferson Çekirdek Tesisi Patoloji boyama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>El Matkap Seti, Mikro Mini Bükümlü Matkap Uçları</td><td>Amazon</td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, serbest asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>Sadece fareler için Stereotaksik Çerçeve</td><td>Harvard Aparatı (Holliston, MA, ABD).</td><td>72-6049, 72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Büyük cerrahi makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231BR hücreleri</td><td>Nazikçe Dr. Patricia Steeg tarafından sağlanmıştır</td><td>Ref 14</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2&middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Fare görüntüleme cihazı</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS 200 sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Fare görüntüleme yazılımı</td><td>Kaliper Yaşam Bilimleri (Waltham, MA, ABD).</td><td>Living Image Yazılımı</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Tecan Spark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Montaj çözümü</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS reaktifi</td><td>Promega CellTiter 96 Sulu Bir Çözelti</td> <td>(Cat: G3582)</td><td></td></tr> <tr><td>N2 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nu / Nu atletik fareler</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, ABD)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Paraformaldehit</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Kalem / Strep</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Sütür</td><td>Medex kaynağı</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>Povidone İyot Swab çubukları</td><td>DME Kaynağı ABD</td><td>Kedi: 689286X</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçağı #11 (pk of 100)</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Neşter sapı #3</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Spatula / prob</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10090-13</td><td></td></tr><tr><td>SS Çift kenarlı kaplamasız tıraş bıçağı (Amerikan güvenlik tıraş bıçağı co (95-0043))</td><td>VWR</td><td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Amresco</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Neşter</td><td>Exelint International</td><td>D29702</td><td></td></tr><tr><td>Doku Doğrayıcı</td><td>Brinkman</td> <td>(McIlwain tipi)</td><td></td></tr> <tr><td>Doku kültürü ekleri</td><td>Millipore PICMORG50</td><td>veya PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>X-ray cihazı</td><td>Hassas 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

meme kanseri beyin metastatik tümör büyümesini İncelemek ve hedeflemek için ex vivo beyin dilimi modeli

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

Beyin metastazı, kadınlar için meme kanserinin ciddi bir sonucudur, çünkü bu tümörlerin tedavisi zordur ve kötü klinik sonuçlarla ilişkilidir. Meme kanseri beyin metastatik (BCBM) büyümesinin klinik öncesi fare modelleri yararlıdır, ancak pahalıdır ve beyin parankimi içindeki canlı hücreleri ve tümör hücresi invazyonunu izlemek zordur. Burada, intrakraniyal olarak enjekte edilen meme kanseri beyin arayan klonal alt hatları içeren ksenograflanmış farelerden ex vivo beyin dilimi kültürleri için bir protokol sunulmaktadır. MDA-MB-231BR lusiferaz etiketli hücreler, Nu/Nu dişi farelerin beyinlerine intrakraniyal olarak enjekte edildi ve tümör oluşumunu takiben, beyinler izole edildi, dilimlendi ve ex vivo kültüre alındı. Tümör dilimleri, lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerini tanımlamak ve beyin parankimindeki proliferasyonlarını ve istilalarını 10 güne kadar izlemek için görüntülendi. Ayrıca, protokol, iyonlaştırıcı radyasyon veya kemoterapi ile tedaviyi takiben tümör hücrelerinin büyümesini ve invaziv davranışını görüntülemek için hızlandırılmış mikroskopinin kullanımını açıklar. Tümör hücrelerinin tedavilere yanıtı, canlı görüntüleme mikroskopisi, biyolüminesans yoğunluğunun ölçülmesi ve BCBM hücrelerini içeren beyin dilimi üzerinde histoloji yapılması ile görselleştirilebilir. Bu nedenle, bu ex vivo dilim modeli, bireysel bir hastanın meme kanseri beyin metastatik büyümesini beyin mikro ortamında hedeflemek üzere kişiselleştirilmiş ilaçları tanımlamak için tek başına veya radyasyonla kombinasyon halinde yeni terapötik ajanların hızlı bir şekilde test edilmesi için yararlı bir platform olabilir.

MDA-MB-231BR-GFP-Luciferaz hücreleri, yukarıda açıklandığı gibi 4-6 haftalık Nu/Nu farelerin sağ yarımküresine intrakraniyal olarak enjekte edildi (Şekil 1A) ve 12-14 gün boyunca büyümesine izin verildi, bu süre zarfında tümör büyümesi biyolüminesans görüntüleme ile izlendi (Şekil 1B). Diğer grup19 tarafından bildirildiği gibi kafa içi 100.000 kanser hücresi enjekte ettik, ancak 20.000 hücre20 kadar düşük enjekte e...

Meme kanseri beyin metastatik hücrelerinin gerçek zamanlı ilaç ve radyasyon yanıtını ölçmek için organotipik bir beyin dilimi modelinde bir protokol sunuyoruz. Yöntemler, çeşitli tedavilerin meme kanserinden beyin metastazları üzerindeki terapötik etkilerini, beyin mikroçevre arayüzü içinde ex vivo bir şekilde araştırmak için nicel bir test sağlar.

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

Bu protokol, beyin metastatik tümör hücrelerinin oluşumuna ve önceden oluşturulmuş bir tümör üzerinde ilaç etkinliğinin ve radyasyonun hızlı bir şekilde test edilmesini sağlayan ex vivo beyin dilimlerinin üretilmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, beyin-tümör-konakçı etkileşimlerini koruyan fizyolojik olarak ilgili bir ortamda birden fazla ilacı veya tedaviyi hızlı bir şekilde test etme yeteneğidir. Bu yöntem, beyin metastatik hücrelerinin beyin parankiminin nasıl büyüdüğünü, hayatta kaldığını ve istila ettiğini anlamaya yardımcı olabilir ve beyin tümörü mikroçevresinin kanser büyümesi ve yayılmasındaki rolünü anlamaya yardımcı olabilir.Prosedürü gösterenler, her ikisi de laboratuvarımdan doktora adayı olan Lorela Ciraku ve Emily Esquea olacak. Başlamak için, anestezi uygulanan fareleri stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve standart kulak çubuklarını kullanarak kafayı hareketsiz hale getirin. Kesiden önce iyot çubuklarının ve% 70 etanolün tekrarlanan alternatif uygulaması ile başın yüzeyini üç kez sterilize edin.Cerrahi bir neşter kullanarak, kafatasını ortaya çıkarmak için farelerin beynini iki simetrik yarıya bölen hayali eksene çapraz açıyla bir santimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Herhangi bir kanı pamuklu çubukla sildikten sonra, enjeksiyon bölgesini açığa çıkarmak için cildi yanal olarak saptırın. Kafatasına nüfuz etmek için 0,73 milimetrelik bir çapak ucu kullanın ve hafif basınç ve büküm hareketi kullanarak bir delik açın.GFP lusiferazı sabit bir şekilde eksprese eden beş mikrolitre hücreyi enjekte etmek için, beyne 3,5 milimetre derinliğe kadar yüksek hassasiyetli bir şırınga yerleştirin. İki dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve ardından şırıngayı yaklaşık bir milimetre yukarı çekin. İki dakika sonra, ilk yarım hacmi yavaşça enjekte edin ve hacmin geri kalanını enjekte etmeden önce iki dakika daha bekleyin.Üç dakika sonra, şırıngayı yavaşça çekin. Kafatasındaki enjeksiyon bölgesine kemik balmumu uygulayın ve dokuyu polipropilen dikişlerle dikin. Hızlı iyileşmeye yardımcı olmak için tuzlu su enjeksiyonu ve yumuşak yiyecekler de dahil olmak üzere özel tedavinin gerekli olup olmadığını belirlemek için ameliyattan hemen sonra farenin davranışını periyodik olarak izleyin.Biyolüminesans görüntüleme yoluyla tümör büyümesini izlemek için, önce görüntüleme sistemindeki oksijen ve izofluranı açın ve her ikisinin de görüntüleme kutusunun dışındaki ayrı odaya dağıtılmasına izin verin. Ardından, yazılımı açtıktan ve cihazı başlattıktan sonra, tüm fare gövdesini görselleştirmek ve yakalamak için uygun seçeneği belirleyin. Daha sonra, fareleri oksijen ve izofluran ile beslenen görüntüleme kutusunun dışındaki odaya aktarın.Fareler anestezik etki altına girdikten sonra, farelere intraperitoneal olarak mililitre lusiferin başına 200 mikrolitre 30 miligram enjekte edin. Fareleri, midesi görüntüleme odacıklarının burun dudağına bakacak şekilde görüntüleme odasına yerleştirin. Odayı kilitleyin, görüntülemeye başlamak için iki dakika süre pozlamayı seçin ve ardından görüntülemeyi tamamlayın.Doku dilimleyiciyi steril bir laminer akış başlığına yerleştirdikten sonra, tüm aletleri ve aletleri% 70 etanol ile temizleyin. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, beyni hızla buz gibi soğuk sakaroz-ACSF çözeltisine çıkarın ve yerleştirin. Bir spatula kullanarak, beyni 60 milimetrelik bir çanak kapağı üzerinde ACSF ile ıslatılmış bir filtre kağıdına aktarın.Keskin, steril bir tıraş bıçağı kullanarak, beynin şeklini mükemmel olmayan bir küpe getirmek için beynin alt kısmı da dahil olmak üzere herhangi bir tümör içermeyen fazla kısımlarını kesin. ACSF ile ıslatılmış birkaç filtre kağıdını kesme platformuna yerleştirdikten sonra, tıkanmış dokuyu filtre kağıdının üzerine yerleştirin. Dokuyu 200 ila 250 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırmak için, kesme boyutunu sağlayıcı cetvel üzerinde 2 veya 2,5 birime ayarlayın ve kesmeye başlayın.Beyin dilimlerini sakaroz-ACSF içeren bir kaba aktarmak için bir boya fırçası kullanın ve dilimleri 27 gauge iğneler kullanarak hafif bir mikroskop altında ayırın. GFP-pozitif dilimleri floresan mikroskop altında tanımlayın. Daha sonra, geniş bir açıklığa sahip steril bir mililitrelik kırık pipet kullanarak, tanımlanmış dilimleri iki ila üç mililitre yetişkin dilim ortamı içeren yeni bir 60 milimetrelik kaba aktarın.Ardından, altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğundaki her doku kültürü ekine güvenli bir mesafede üç ila beş dilim aktarın. Fazla ortamı kesici ucun yüzeyinden çıkardıktan sonra, her kesici ucun altına bir mililitre dengeli yetişkin fare dilimi ortamı ekleyin. Görüntülemeden önce dokuları 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte ve% 95 nemde inkübe edin.Pipet, mililitre başına beş mikrolitre 30 miligram lusiferin çözeltisini steril bir başlık içindeki eklerin altındaki ortama yerleştirin. Altı delikli plakayı, kapağı cihazın görüntüleme odasının içine yerleştirerek sabit kameranın altına yerleştirin ve hazne kapağını kilitleyin. Yazılımı açın ve cihazı başlatın.Görselleştirmeye ve görüntü başına yalnızca bir kuyucuğun yakalanmasına izin veren kamera ayarlarını seçtikten sonra, görüntülenecek kuyuyu doğrudan kameranın altına yerleştirin. ROI aracını kullanın, tümör şeklinin ve boyutunun etrafına yerleştirin, ROI'yi ölçün ve dilimdeki her tümörün biyolüminesan sinyalini ölçmek için toplam okumaları raporlayın. Plakayı steril laminer akış başlığına geri getirdikten sonra, kesici ucu kuyudan hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.Ortamı aspire ettikten sonra, ortamı bir mililitre taze ortamla değiştirin ve girişi tekrar kuyuya yerleştirin. Dilimlerin inhibitörler ve metabolitler gibi çeşitli bileşiklerle muamele edildiği deneyler için, 1.5 mililitrelik bir tüp içinde 1.2 mililitre beyin dilimi ortamında uygun reaktif konsantrasyonunu hazırlayın ve ardından bir mililitre reaktifi dilimi içeren kuyuya aktarın. MDA-MB-231 BR-GFP lusiferaz hücreleri çıplak farelere enjekte edildi, tümörlerin büyümesine izin verildi, tümörlü beyinler diseke edildi, dilimlendi, ex vivo büyütüldü ve tümör büyümesi biyolüminesans görüntüleme ile izlendi.H & E boyama ve GFP-pozitif floresan, beyin diliminde bir tümörün varlığını doğruladı. Artmış Ki-67 boyaması, yüksek proliferatif kanser hücrelerinin varlığını doğruladı. Işınlamaya maruz kalmayan beyin dilimlerindeki tümörler ex vivo büyümeye devam ederken, ışınlamaya maruz kalan tümörler durmuş bir büyüme gösterdi.Tümör içeren beyin dilimleri, ışınlama tedavisini takiben tümör büyümesini görselleştirmek için canlı görüntüleme yoluyla da izlendi. Biyolüminesan görüntüleme ile tutarlı olarak, GFP yoğunluğu arttıkça ve hücreler beyin parankimini istila etmeye başladıkça kontrol kanseri hücreleri hızla büyüdü. Buna karşılık, ışınlama ile tedavi edilen beyin dilimlerindeki kanser hücreleri sitostatikti ve GFP yoğunluğu korundu.Büyük çok çekirdekli kanser hücreleri ve IR ile tedavi edilen kanser hücrelerinde DNA hasar belirtecinin boyanmasında bir artış tespit edildi. Ayrıca, reaktif astrositlerde bir artış tespit edildi. IR tedavisine bağlı apoptoz, tümörsüz fare beyin dilimlerinde tespit edilmedi.Tümörleri içeren beyin dilimleri, kemoterapötik bir ilaç olan farklı konsantrasyonlarda paklitaksel ile tedavi edildi. Tedavi, tedavinin 10. gününden sonra tümörün boyutunu önemli ölçüde azalttı. Paklitaksel ile tedavi edilen tümör hücrelerinde apoptozda artış saptandı.İnhibitör tedavisi beyin dokusunun canlılığını değiştirmedi. Paklitaksel ile tedavi edilen tümörsüz fare beyin diliminde parçalanmış kaspaz-3 boyaması ile apoptozda artış ölçülmedi. İlgilenilen ilaçlarla tedavi sona erdiğinde, dilimler immünositokimya, omik çalışmalar yoluyla protein ekspresyonu için analiz edilebilir veya akış sitometrisi için uygun tek hücreli süspansiyon elde edilebilir.

an-ex-vivo-brain-slice-model-to-study-target-breast-cancer-brain

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kaynak: Ciraku, L., et. al. Meme kanseri beyin metastatik tümör büyümesini incelemek ve hedeflemek için bir ex vivo beyin dilimi modeli. J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, organotipik bir fare beyin diliminde lusiferaz eksprese eden tümör hücrelerinin görüntülenmesini göstermektedir. Luciferin ortama eklenir ve plaka, in vivo görüntüleme sisteminin haznesinin içine yerleştirilir. Görüntü yakalama parametreleri ayarlanır ve tümörün şekli ve boyutu tanımlanır. Tümör hücreleri tarafından yayılan...

Organotipik Bir Fare Beyin Diliminde Tümör Büyümesini Değerlendirmek için Biyolüminesans Görüntüleme

Bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli MDA-MB231/Br-GFP hücreleri ultrason görüntüleme kılavuzluğunda intrakardiyak enjeksiyonu ile kurulmuştur. Multifokal intrakranial metastaz gelişimi, yüksek çözünürlüklü 9.4 T MR kullanılarak uzunlamasına izlenir olmuştur.

Boyuna MRG Ardından Meme Kanseri Beyin Metastaz bir Fare Modeli geliştirmek için ultrason görüntüleme eşliğinde intrakardiyak enjeksiyon

İnsan beyni tümörlerinin birçok türü, beynin belirli bölgelerine lokalizedir ve kültürde büyümesi zordur. Bu protokol, tümör mikroçevresinin rolünü ele alır ve organotipik bir fare beyin diliminde büyüyen floresan primer beyin tümörü hücrelerini analiz ederek yeni ilaç tedavilerini araştırır.

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

tedavi seçenekleri palyatif kalmıştır ise görülme sıklığı artmıştır olarak beyin metastazı acil karşılanmamış tıbbi ihtiyaç haline gelmiştir. Kanser hücrelerinin intracarotid arteriyel enjeksiyon yoluyla beyin metastazı deneysel hayvan modelleri oluşturma yeni müdahale rejimlerinin hastalığın biyolojisi ve değerlendirilmesi mekanik çalışmaları kolaylaştırır.

Intracarotid Kanser Hücre Enjeksiyon Beyin metastaz Fare modelleri üretmek için

İntrakraniyal beyin metastazı modellemesi, tümör boyutunun izlenememe ve tedaviye tam ve zamanında yanıt verilememesi ile karmaşıktır. Sunulan metodoloji çiftler manyetik rezonans görüntüleme analizi ile intrakranial tümör enjeksiyonu, kombine edildiğinde, hassas ve tutarlı enjeksiyonlar, gelişmiş hayvan izleme ve doğru tümör hacmi ölçümleri yetiştirir.

İntrakraniyal Enjeksiyon ve Manyetik Rezonans Görüntüleme Ile Beyin Metastazlarının Modellenmesi

Burada, bir kan beyin bariyeri metastatik tümör mikro-ortamının hazırlanması ve kültürlenmesi ve konfokal görüntüleme ve yapay zeka (makine öğrenimi) kullanılarak durumunun ölçülmesi için bir protokol saklıyız.

Organ-On-A Chip 3D Modeli, Makine Öğrenimi ve Konfokal Tomografi Kullanarak Beyin Metastatik Tümör Mikro-Ortamının Ölçülmesi

Endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş inflamatuar meme kanseri hücre hattının kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla üretilen meme kanseri beyin metastazının bir ksenogreft fare modelini tanımladık.

İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Beyin metastazı kanser hastalarında ciddi morbidite ve mortalite nedenidir. Çoğu beyin metastazı fare modeli, mortalite ve terapötik müdahale sonuçlarının kafa karıştırıcı analizini karıştıran sistemik metastazlar ile karmaşıktır. Burada, minimal sistemik tümörlerle tutarlı intrakraniyal tümörler üreten kanser hücrelerinin internal karotis enjeksiyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Kanser Hücrelerinin İç Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Civciv embriyoları, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerini ovo ve in vivo beyin dilimi ko-kültürlerinde incelemek için kullanılır. GBM hücre davranışı, ex vivo ko-kültürlerde hızlandırılmış mikroskopi ile kaydedilebilir ve her iki preparat da deneysel son noktada ayrıntılı 3D konfokal analiz ile analiz edilebilir.

Civciv Embriyo Beynini, İnsan Glioblastoma Hücre Davranışının In Vivo ve Ex Vivo Analizleri için Bir Model Olarak Kullanma

Stereotaktik intrakranial enjeksiyon tekniği, tümör hücrelerinin fare korteksine hassas ve lokal bir şekilde yerleştirilmesini sağlar ve böylece beynin metastatik kolonizasyonunu incelemek için güçlü bir model olur.

Beyin Metastazının Modellenmesi: Metastatik Kolonizasyon ve Histolojik Büyüme Kalıplarının Stereotaktik İntrakortikal Enjeksiyonla Standartlaştırılmış Analizi

Keşfedin meme kanseri beyin metastazlarını incelemek için ekz vivo beyin dilimi modelini. Bu yöntem, ilaç ve radyasyon yanıtlarını fizyolojik olarak uygun bir ortamda hızlıca test etmenizi sağlar.

Meme Kanseri Beyin Metastatik Tümör Büyümesini İncelemek ve Hedeflemek için Ex Vivo Beyin Dilimi Modeli

Daha fazla video keşfet