Name: Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, sıçan EDL ve soleus kaslarından tek kas liflerinin diseksiyonu ve immünofluoresan boyama ile tüm-mount nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi yöntemini. Bu protokol sinir-kas sinaps yapısını ve patolojik değişiklikleri incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu işe verilen mali destek için CSIC ve PEDECIBA'ya çok teşekkürler; el yazması düzeltmeleri için Natalia Rosano'ya; Marcelo Casacuberta'ya videoyu çekene ve Nicolás Bolatto'ya sesini ödünç verdiği için.

Tüm hayvan prosedürleri, Deneysel Amaçlarla Kullanılan Hayvanların Bakımı için Ulusal N° 18611 Sayılı Yasa'nın yönergelerine göre gerçek gerçekleştirildi. Protokol Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (CEUA IIBCE, Protokol Numarası 004/09/2015).
1. Kas diseksiyonu (Gün 1)
NOT: Başlamadan önce Dulbecco fosfat salininde (DPBS) %0,5 paraformaldehit (PFA), pH 7,4 olmak üzere 40 mL yapın. İsteğe bağlı olarak, %4 PFA'nın 20 mL'sini yapın. 5 mL aliquots hazırlayın ve -20 °C'de dondurun. Diseksiyon gününde% 4 aliquot çözün ve% 0.5 PFA'nın 40 mL'sini elde etmek için 35 mL DPBS ekleyin.
<ol><li>
EDL izolasyonu (hızlı seğirme kası)
	<ol>
<li>Bir sıçanı ötenaziye tabi edin. Hayvanı karın yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ayak uçları arasında arka ekvuca doğru cerrahi bir bıçak kullanarak ilk kesiyi yapın. NOT: Bu durumda, sıçanı ötenazi yapmak için 90:10 mg/Kg ketamin:ksilazine intraperitoneal enjeksiyon yapıldı, ancak diğer anestezi seçeneklerine de izin verilir.</li>
		<li>Sıçan dizi açığa çıkarana kadar yukarı doğru çekerek cildi soyun.</li>
		<li>EDL'yi bulmak için ayak tendonlarını annular ligamente kadar takip edin. Bu bağ iki tendonu çevreler. İki tendon arasındaki bağı uniband makas (veya benzeri) ile kesin. Her ikisini de kaldırarak EDL tendonu tanımlayın ve tokmakların yukarı doğru hareket etmesini sağlayan tendonu seçin.</li>
		<li>Tendonu uniband makasla kesin. Daha sonra, tendonu ince biyolojik cımbızla tutarken, EDL kasını tibialis ön, peroneus brevis ve peroneus longus40'tan yavaşça ayırmaya başlar (bkz. Şekil 1A). NOT: Kasın herhangi bir hasar görmeden ayrıldığından emin olun. Bunu, EDL kasını tutarken ve kaldırırken aralarında bir yol açmak için yanal kasların geri kalanını keserek yapın (EDL yüzeysel bir konuma sahip değildir).</li>
		<li>Kası tamamen izole etmek için, sıçan dizine bağlı tendonu uniband makasla kesin.</li>
		<li>Parçalanmış kası % 0,5 PFA'nın 5 mL'sinde batırın ve 4 °C'de 24 saat bekletin. İsteğe bağlı olarak, kası bir karton parçasına zımbalayın ve kas aşağı bakacak şekilde çevirin. Daha sonra tamamen sabit çözeltinin 8 mL'sinde batırın. Bu adım, fiksasyon işlemi sırasında uzatılan kasın korunmasına yardımcı olur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soleus izolasyonu (yavaş seğirme kası)
	<ol>
<li>Hayvanı çevirin (karın şimdi aşağı bakıyor). Deriden, cerrahi bir bıçak kullanarak kalkal tendonu kesin.</li>
		<li>Biyolojik cımbız ve uniband makas yardımıyla, gastrocnemius kasını kemiklerden ayırarak bir "kas kapağı" oluşturur. Soleus kas kapağının iç tarafında olacaktır. Kırmızı renkli olduğu ve düz bir morfolojiye sahip olduğu için tanımlanabilir.</li>
		<li>Bir çift biyolojik cımbızla, gastrocnemius'un üzerinde yatan soleus tendona ulaşın ve kaldırın (bkz. Şekil 1B).</li>
		<li>Tendonu uniband makasla kesin. Zayıf bağlanma noktalarının bazılarını (yani nörovasküler elemanları) keserken tüm kası kaldırın. Son olarak, soleus kasını tamamen serbest etmek için, kalkaneal tendonu oluşturan soleus fasikülini uniband makasla kesin.</li>
		<li>Parçalanmış soleus kasını düzeltmek için 1.1.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Alaylı lif hazırlığı (Gün 2)
<ol><li>24 saat fiksasyondan sonra, kas liflerini izole etmeden önce kasları her biri 10 dakika boyunca 6 mL DPBS çözeltisi 3x ile durulayın.</li>
	<li>Lifleri izole etmek için mikroskop kaydırasına bir kas koyun. Stereomikroskop kullanarak, tendonlardan birini bir çift biyolojik cımbızla hafifçe tutun. Daha sonra, diğer biyolojik cımbızla, kas liflerini ayırmak için tendonu yavaşça sıkıştırmaya başlar. Bundan sonra yavaşça sıkışan dokuyu yukarı doğru karşı kas tendonuna doğru çekin. Birden fazla küçük, yalıtılmış demet elde edene kadar bu eylemi birkaç kez tekrarlamak gerekecektir.</li>
	<li>Önceden işlenmiş bir slayda (silanized) dikkatlice yerleştirin. Tüm lifleri üst üste binmeyecek şekilde düzenli tutmak gerekir. Bu noktada, lifleri 24 saat boyunca havayla kurulayın.</li>
</ol>3. İmmünoresans
<ol><li>
Primer antikor inkübasyonu (Gün 3) NOT: Aksi belirtilmediyse, tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Lifleri slayttan ayırmadan farklı çözeltileri çıkarmanın en etkili yolu bir insülin şırınnası kullanmaktır.<ol>
<li>İmmün yetme işlemine başlamak için, su geçirmez bir bariyer oluşturmak için kurutulmuş izole kas liflerini bir pap kalemle çevreleyin.</li>
		<li>Kas liflerini nemlendirmek için, 5 dakika boyunca 200 μL damıtılmış su ekleyin ve ardından sonraki 5 dakikalık inkübasyon için suyu 200 μL DPBS'ye değiştirin. Bu noktada immünoresans etiketlemeye başlayın.</li>
		<li>30 dakika boyunca 50 mM glisinin, %1 BSA'nın ve %1 Triton X-100'ün bulunduğu 300 μL blokaj tamponu (BB) ile fiberleri kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>BB'yi üreticiler tarafından önerilen konsantrasyonda birincil antikorla değiştirin. Antikorun seyrelti için BB kullanın. Bu deneyde, NMJ presinyaptik bileşenini tespit etmek için 1/800 seyreltmede fosforilasyonlu olmayan (Nf) veya fosforilasyonlu (Fos-Nf) nörofilament H'yi tanıyan 400 μL SMI 32 veya SMI 31 kullanıldı. NOT: Nörofilament fosforilasyonu değerlendirmek yerine tüm presinaptik elementi tanımaya karar verirken, daha önce başarıyla kullanılan sinapsin, sinaptofiz veya SV2a'ya karşı antikorları seçin.</li>
		<li>Lifleri birincil antikor seyreltmesi ile bir gecede 4 °C'de kuluçkaya bırakın (isteğe bağlı olarak, 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapılabilir). Her iki durumda da, inkübasyonun nemli bir oda kullanarak gerçekleştirilmesi önemli olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İmmünofluoresans: sekonder antikor inkübasyonu (Gün 4)
	<ol>
<li>Birincil antikoru çıkarın ve lifleri 500 μL DPBS ve son kez BB ile 10 dakika boyunca 3x durulayın.</li>
		<li>Bu son yıkamayı çıkarın ve BB'de seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikoru ekleyin. Bu deney için BB'de 1/1000 seyreltmede 500 μL keçi anti-fare Alexa Fluor 488 kullanıldı. NMJ'lerin postsinaptik elemanını görüntülemek için, ikincil antikor seyreltimine 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotin-XX konjugesi eklendi. NOT: Btx-biotin XX'in eklenmesi, sinyali yükselten streptavidin ile algılandıktan sonra daha iyi sinyalden gürültüye görüntüler sağlar. Ek olarak, farklı floroforlara streptavidin konjugasyonu, ortak etiketleme tahlillerinde renk kombinasyonlarını artırdı. Alternatif olarak, floresan etiketli Btx, benzer kalitede görüntüler elde etmeyi sağlar.</li>
		<li>İkincil antikor ve Btx'i oda sıcaklığında 2 saat veya ışıktan korunan 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>İkincil antikoru ve Btx'i çıkarın, her biri 10 dakika boyunca 500 μL DPBS ve bb ile son durulama ile 3x yıkayın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 1 saat bb ile 1/1000 seyreltmede 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 ile kuluçkaya yatırın. Bu noktada, istenirse, 1 μg / mL'lik son konsantrasyonda diaminophenylindole gibi çekirdeklere karşı koymak için bir prob ekleyin.</li>
		<li>Kuluçka çözeltisini çıkarın ve lifleri 500 μL DPBS ile her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın. Ardından, lifleri monte edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaj
	<ol>
<li>Mikroskop kaydırağının üzerine bir karenin köşeleriymiş gibi 4 nokta şeffaf oje yerleştirin. 1-2 dk kurusunlar. Bunlar, kapak örtülerin dinlenecekleri noktalar olacak ve doku ezilmesini önlemeye yardımcı olacaktır.</li>
		<li>Son DPBS yıkamasını çıkarın ve lifleri kapsayacak kadar montaj ortamı (~ 200 μL) ekleyin; kurumaktan kaçının. NOT: Montaj ortamı karışımının 10 mL'lik kısmını hazırlamak için Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: gliserol'ü 4:1 (v:v) olarak kullanın.</li>
		<li>Montaj medyasını liflerin üzerine dikkatlice yaymak için 200 μL pipet ucu kullanın ve hepsinin tamamen daldırılmasını sağlayın. Kapak camını yerleştirmeden önce hava kabarcıklarını çıkarın.</li>
		<li>Kapak kapağını, hava kabarcıklarının üretilmesini önlemeye çalışan numunelerin üzerine yerleştirin. Bu hareket, kümeslerin yardımıyla yapılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mikroskopi ve morfometrik analiz
<ol><li>Lazer konfokal mikroskopi kullanarak alay edilen lif preparatlarını görüntüleyin.</li>
	<li>Tek mikrometre aralığı kullanarak sinapsların tamamında bir dizi optik bölüm (30 μm Z yığını) alın. Yığını ayarlamak için Btx sinyalini kullanın. Görüntü 2048 px x 2048 px çözünürlüğe sahip her kas durumu için en az 15-20 NMJs. Bu yöntem, morfometrik analiz için yeterli optik kalite ve çözünürlüğe sahip görüntüler elde etmek için seçildi.</li>
	<li>Ölçümleri gerçekleştirmek için, herhangi bir analiz yazılımıyla yığınların projeksiyon görüntülerini kullanın. NOT: Açıklanan morfometrik analiz manuel olarak yapılmış olmasına rağmen, pre ve postynaptik NMJ morfolojisinin birçok farklı yönünü incelemek için yakın zamanda geliştirilen iki Image J tabanlı araç vardır33,34.</li>
	<li>Toplam NMJ alan değerlerini elde etmek için Photoshop Manyetik kement aracını kullanarak arka plakanın dış kenarlığını (lekeli alanın dış anahattı, bkz. Şekil 2)seçin ve Histogram penceresinde seçilen piksel sayısını belirleyin. Daha sonra, piksel alanları konfokal yazılım tarafından belirtilen ölçek kullanılarak kare mikrometrelere dönüştürülebilir.</li>
	<li>Aynı kement aracıyla, iç kenarlığı seçin (son plakadaki lekeli alanın anahatları, bkz. Şekil 2)ve yukarıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi tüm yapıdaki (veya boş alandaki) lekesiz alanı belirleyin (adım 4.4.). Postsynaptic Area değerleri, toplam alanı her NMJ'nin boş alanından çıkardıktan sonra elde edilecektir.</li>
	<li>Anti-nörofilament immünofluoresanslı alan olarak tanımlanan Presynaptik Alanı, Total NMJ alanına benzer şekilde elde edin. NOT: Tüm bu parametreler Post-Synaptic Density indeksini (Postynaptik Alan/Toplam Alan) ve NMJ Kapsamını (Presynaptik Alan/Postynaptik Alan) belirlemek için kullanılmıştır. Daha yüksek bir Postynaptik Yoğunluk indeksi daha yoğun veya daha kompakt bir uç plaka anlamına gelirken, daha küçük bir NMJ Kapsamı sinir terminali ve uç plaka (her ikisi de bir denervasyon işlemiyle uyumlu) arasındaki çok daha zayıf bir etkileşimi yansıtır. Burada gösterilen olguda sinir terminali düzeyinde fosforilasyonlu ve fosforilasyonsuz nörofilament formları tespit edildiğinden fosforilasyonlu/fosforilasyonsuz presynaptik sinyal oranı ve fosforillü/fosforilasyonsuz kapsama oranı hesaplanmıştır.</li>
</ol>

<ol><li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+Glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner.</a> Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).</li>
<li>Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+efficacy+and+synaptic+depression+by+glial+cells+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction.</a> Neuron. 21, 847-855 (1998).</li>
<li>Cappello, V., Francolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+Dismantling+in+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).</li>
<li>Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+and+decreased+activity+elicits+specific+morphological+adaptations+of+the+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).</li>
<li>Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitual+exercise+enhances+neuromuscular+transmission+efficacy+of+rat+soleus+muscle+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ.</a> Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).</li>
<li>Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+influences+adaptations+of+the+neuromuscular+junction+to+endurance+training%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training.</a> Neuroscience. 190, 56-66 (2011).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Arnold, A. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+remodeling+of+the+neuromuscular+junction+by+skeletal+muscle+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α.</a> Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).</li>
<li>Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+presynaptic+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+repeatedly+observed+in+living+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice.</a> Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).</li>
<li>Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+early+morphological+changes+at+denervated+and+paralyzed+endplates+in+fast+and+slow+muscles+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse.</a> Brain Research. 248, 382-386 (1982).</li>
<li>Rosenheimer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+stress+and+exercise+on+age+related+changes+in+end-plates+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture.</a> Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+endurance+exercise+on+the+morphology+of+mouse+neuromuscular+junctions+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing.</a> Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).</li>
<li>Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+nerve+terminal+morphologic+plasticity+induced+by+small+changes+in+the+locomotor+activity+of+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat.</a> Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).</li>
<li>Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exercise+training+of+different+intensities+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology.</a> Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).</li>
<li>Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+exercise+in+maintaining+the+integrity+of+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).</li>
<li>Andonian, M. H., Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+alters+the+morphology+of+fast-+and+slow-twitch+rat+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction.</a> International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).</li>
<li>Fahim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+exercise+modulates+neuromuscular+junction+of+C57BL%5C6N+in+ageing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice.</a> Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).</li>
<li>Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+effects+of+physical+training+on+morphology+of+motor+nerve+terminals+in+rat+extensor+digitorum+longus+and+soleus+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles.</a> Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).</li>
<li>Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endurance+training+increases+acetylcholine+receptor+quantity+at+neuromuscular+junctions+of+adult+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle.</a> Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).</li>
<li>Deschenes, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+resistance+training+on+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology.</a> Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).</li>
<li>Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+Junction+as+an+Entity+of+Nerve-Muscle+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication.</a> Cells. 8 (8), 906-921 (2019).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis-A+model+of+corticofugal+axonal+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread.</a> Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).</li>
<li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy%3A+Evidence+in+mice+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man.</a> Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).</li>
<li>Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fiber+type+classifications%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fiber type classifications.</a> Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review.</a> Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li>
<li>Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+variability+is+greater+at+developing+than+mature+mouse+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions.</a> Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), 160240(2016).</li>
<li>Waerhaug, O., Lømo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+causing+different+properties+at+neuromuscular+junctions+in+fast+and+slow+rat+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles.</a> Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).</li>
<li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+postsynaptic+folds+to+the+safety+factor+for+neuromuscular+transmission+in+rat+fast-+and+slow-twitch+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles.</a> Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).</li>
<li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-Analyser%3A+high-throughput+morphological+screening+of+neuromuscular+junctions+identifies+subtle+changes+in+mouse+neuromuscular+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levator+auris+longus+preparation+for+examination+of+mammalian+neuromuscular+transmission+under+voltage+clamp+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57482(2018).</li>
<li>Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+adult+mouse+muscle-nerve+preparation+for+studying+the+firing+properties+of+muscle+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51948(2014).</li>
<li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), e4460(2013).</li>
<li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e51162(2014).</li>
<li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+are+rich+in+non-phosphorylated+neurofilaments%3A+cross-species+comparison+and+alterations+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+and+development+of+compartmentalized+innervation+in+rat+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle.</a> Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).</li>
<li>Cipriani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+a+mouse+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+4C%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072(2018).</li>
<li>Boido, M., Vercelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junctions+as+key+contributors+and+therapeutic+targets+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).</li>
<li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu yazıda, NMJ değişikliklerinin yanı sıra montaj/sökme süreçlerini nicel olarak değerlendirmek için iki sıçan iskelet kasının (biri yavaş seğirme ve diğeri hızlı seğirme), fiber kas izolasyonu ve pre ve postynaptik belirteçlerin immünofluoresans tespiti için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu tür bir protokol kemirgen modellerinde yararlı olabilir41,42 fizyolojik veya patolojik süreçler sırasında NMJ'yi değerlendirmek için als hSOD1G93A sıçanlarında bulunan gi...

Memeli nöromüsküler kavşak (NMJ), motor nöron sinir uçlarından, iskelet kas lifi üzerindeki postsinaptik zardan ve terminal Schwann hücrelerinden oluşan büyük bir kolinerjik üçlüsinapstır. Bu sinaps, NMJ'lerin dinamik yapısal değişikliklere uğrayabildiği yetişkinlik döneminde bile yüksek morfolojik ve fonksiyonel plastisite4,5,6,7,8sergiler. Örneğin, bazı araştırmacılar motor sinir uçlarının mikrometre ölçeğinde şekillerini sürekli olarak değiştirdiğini göstermiştir9. Ayrıca, NMJ'nin morfolojisinin fonksiyonel gereksinimlere, değiştirilmiş kullanıma, yaşlanmaya, egzersize veya lokomotor aktivite4, 10 , 11,12,13,14,15varyasyonlarına yanıt verdiği bildirilmiştir. Bu nedenle, eğitim ve kullanım eksikliği, NMJ'nin boyutu, uzunluğu, sinaptik veziküllerin ve reseptörlerin dağılımı ve ayrıca sinir terminalidallanma 14 , 16 , 17 ,18,19,20gibi bazı özelliklerini değiştirmek için gerekli uyaranı temsil eder.
Ayrıca, bu hayati bağlantının herhangi bir yapısal değişiminin veya dejenerasyonun motor nöron hücre ölümü ve kas atrofisi21ile sonuçlanabileceği gösterilmiştir. Ayrıca, sinirler ve kaslar arasındaki değişen iletişimin fizyolojik yaşa bağlı NMJ değişikliklerinden ve muhtemelen patolojik durumlardaki yıkımından sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Nöromüsküler kavşak sökümü, bozulmuş kas-sinir etkileşiminin en iyi örneklerinden birini oluşturan nörodejeneratif bir hastalık olan Amyotrofik Lateral Sklerozun (ALS) başlangıcında çok önemli bir rol oynar3. Motor nöron disfonksiyonu üzerinde yapılan çok sayıda çalışmaya rağmen, ALS'de gözlenen bozulmanın motor nörona doğrudan zarar ve daha sonra kortiko-spinal projeksiyonlara kadar uzanıp uzanmadığı hala tartışılır22; veya sinir uçlarında dejenerasyonun başladığı ve motor nöron somas23,24'edoğru ilerlediği distal bir aksonopati olarak düşünülmelidir. ALS patolojisinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bağımsız süreçlerin bir karışımının meydana geldiğini düşünmek mantıklıdır. NMJ, kas ve sinir arasındaki fizyopatolojik etkileşimin merkezi oyuncusu olduğundan, istikrarsızlaşması, hastalığın kökeninde analiz edilmesi gereken önemli bir noktayı temsil eder.
Memeli nöromüsküler sistemi, işlevsel olarak bir motor nörondan ve sinir terminali tarafından özel olarak içselleştirilen kas liflerinden oluşan ayrı motor birimler halinde düzenlenir. Her motor ünitesi benzer veya özdeş yapısal ve fonksiyonel özelliklere sahip liflere sahiptir25. Motor nöron seçici işe alım fonksiyonel taleplere kas yanıtını optimize etmeyi sağlar. Şimdi memeli iskelet kaslarının dört farklı lif türünden oluştuğu açıktır. Bazı kaslar en bol lif tiplerinin özelliklerine göre adlandırılır. Örneğin, soleus (vücut duruşunun korunmasında rol oynayan arka uzvun arka kası) yavaş seğirme birimlerinin (tip 1) çoğunluğunu taşır ve yavaş bir kas olarak kabul edilir. Bunun yerine, ekstansör digitorum longus (EDL) esasen benzer hızlı seğirme özelliklerine (tip 2 lifler) sahip ünitelerden oluşur ve hareketlilik için gerekli olan fazik hareketler için uzmanlaşmış hızlı bir kas olarak bilinir. Başka bir deyişle, yetişkin kasları hormonal ve sinirsel etkiler nedeniyle doğada plastik olmasına rağmen, lif bileşimi, sürekli düşük yoğunluklu aktivite ve daha hızlı bir tek seğirme sergileyen EDL yaşayan soleusta görüldüğü gibi farklı aktiviteler gerçekleştirme kapasitesini belirler. Farklı kas lifleri arasında değişken olan diğer özellikler yapıları (mitokondriyal içerik, sarkoplazmik retikülün uzantısı, Z hattının kalınlığı), miyozin ATPase içeriği ve miyozin ağır zincir bileşimi26 , 27,28,29ileilgilidir.
Kemirgen NMJ'leri için, kaslar arasında önemli farklılıklar vardır28,29. Sıçanlardan soleus ve EDL'de yapılan morfometrik analizler, sinaptik alan ile lif çapı arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koydu (yani, soleus yavaş liflerdeki sinaptik alan EDL hızlı liflerden daha büyüktür) ancak NMJ alanı ile lif büyüklüğü arasındaki oran her iki kasta da benzerdir30,31. Ayrıca, sinir terminalleri ile ilgili olarak, tip 1 liflerdeki uç mutlak alanlar tip 2 liflere göre daha düşükken, lif çapı ile normalleşme, tip 1 liflerdeki sinir terminallerinin alanlarını en büyük32yaptı.
Bununla birlikte, çok az çalışma, bazı NMJ bileşenlerindeki değişikliklerin kanıtlarını göstermek için morfometrik analize odaklanmaktadır33,34. Bu nedenle, morfolojisi ve fizyolojisi çeşitli patolojilerde değişen organizmanın işlevinde NMJ'nin ilgisi nedeniyle, farklı kas türlerinin diseksiyon protokollerini tüm NMJ yapısının görselleştirilmesine izin sağlayacak kalitede optimize etmek önemlidir. Yaşlanma veya egzersiz 35 , 36,37,38gibi farklı deneysel durumlarda veya koşullarda pre veya postynaptik değişikliklerin oluşumunu değerlendirmek de gereklidir. Ek olarak, ALS39'dabildirildiği gibi terminal sinir uçlarında değiştirilmiş nörofilament fosforilasyon gibi NMJ bileşenlerinde daha ince değişikliklere kanıt sağlamak yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Soğuk ışık aydınlatmalı stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10A</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camları (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Premium (Plus) mikroskop slaytları</td><td>PORLAB</td><td>PC-201-16</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td>F.S.T</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Uniband LA-4C Makas 125mm</td><td>E.M.S</td><td>77910-26</td><td></td></tr><tr><td>Sorumlu cerrahi bıçaklar #10</td><td>Sakira Medical</td><td>1567</td><td></td></tr><tr><td>Sorumlu steril şırınga (1 ml)</td><td>Sakira Medical</td><td>1569</td><td></td></tr><tr><td>Süper PAP kalemi</td><td>E.M.S</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; l veya 200 &mu; l pipet</td><td>Finnpipette</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800 - AiryScan</td><td></td></tr><tr><td>NTac: SD-TgN (SOD1G93A) L26H sıçanlar</td><td>Taconic</td><td>2148-M</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td> <td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Amresco</td><td>167</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Biyo Temel A.Ş.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-Nörofilament H (NF-H), Fosforile</td><td>Antikor BioLegend</td><td>801601</td><td>Daha önce Covance # SMI 31P</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-Nörofilament H (NF-H), Fosforile Edilmemiş Antikor</td><td>BioLegend</td><td>801701</td><td>Önceden Covance # SMI-32P</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-Fare IgG (H + L)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr> <tr><td>ve alfa; -Bungarotoksin, biotin-XX konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>B1196</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 555 konjuge</td><td>Invitrogen</td><td>S32355</td><td></td></tr><tr><td>Diaminofenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma</td><td>D8417</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm mount nöromüsküler kavşakların İmmünofluoresan ve morfometrik analizleri için tek İskelet kas liflerinin diseksiyonu

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Nöromüsküler kavşak (NMJ), motor sinir ve iskelet kası arasında özel bir temas noktasıdır. Bu periferik sinaps yüksek morfolojik ve fonksiyonel plastisite sergiler. Çok sayıda sinir sistemi bozukluğunda, NMJ nörotransmisyon yetmezliği, halsizlik, atrofi ve hatta kas lifi ölümü ile sonuçlanan erken patolojik bir hedeftir. İlgisi nedeniyle, NMJ bileşenleri arasındaki ilişkinin belirli yönlerini nicel olarak değerlendirme imkanı, montajı/sökülmesi ile ilişkili süreçlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Kaslarla çalışırken ilk engel, liflerine zarar vermeden hızlı bir şekilde tanımlamak ve parçalamak için teknik uzmanlık kazanmaktır. İkinci zorluk, nicel analiz yapmak için kullanılabilecek NMJ görüntülerini elde etmek için yüksek kaliteli algılama yöntemlerini kullanmaktır. Bu makalede, sıçanlardan ekstansor digitorum longus ve soleus kaslarının diseksiyonu için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, immünofluoresansın tüm montajlı NMJ'lerin pre ve postsinaptik unsurlarını görselleştirmek için kullanımını açıklar. Elde edilen sonuçlar, bu tekniğin sinapsın mikroskobik anatomisini oluşturmak ve fizyolojik veya patolojik koşullar altında bazı bileşenlerinin durumundaki ince değişiklikleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu protokol, kas liflerini iki farklı kas türünden izole etmek ve immünostain etmek için basit bir yöntem sunar (hızlı ve yavaş seğiren kaslar, bkz. Şekil 1). Doğru belirteçler ve / veya problar kullanılarak, NMJ bileşenleri, hastalığın ilerlemesi veya belirli bir ilaç tedavisinin sonucu olarak ortaya çıkabilecek bazı morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için nicel bir bakış açısıyla tespit edilebilir ve değerlendirilebilir. Bu çalışmada, NMJ'nin presinyaptik ve postsinaptik bileşenleri ...

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Tüm monte nöromüsküler kavşakların immünoflüoresan ve morfometrik analizleri için tek iskelet kas liflerinin diseksiyonu. Bu video, EDL ve soleus kaslarını tekrarlanabilir bir yaklaşımla etkili ve güvenli bir şekilde parçalamak için bir protokol gösterecektir. Bu video ayrıca, doğru bir morfometrik analize izin vermek için sinaptik bileşenleri 3D bütünlükle tanımak amacıyla tam monte nöromüsküler kavşakların nasıl elde edeceğini öğretecektir.Kasları parçalamak için bu cerrahi aletlere ihtiyaç vardır. İşlemi başlatmak için, hayvanı karın yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Ayak uçları arasında arka uzuvlara doğru cerrahi bir bıçak kullanarak ilk kesiyi yapın.Sağ diz açığa olana kadar yukarı doğru çekerek cildi soyun. EDL'yi bulmak için ayak tendonlarını annular ligamente kadar takip edin. Bu bağ iki tendonu çevreler.İki tendon arasındaki Uniband makası ile bağı kesin. Her ikisini de kaldırarak ve hangisinin tosların yukarı doğru hareket ettiğini görerek EDL tendonu tanımlayın. Tendonu makasla kesin.Tendonu biyolojik cımbızla tutarken, EDL kasını diğer arka uzuv kaslarından yavaşça ayırmaya başlayın. Kasın hasara yol açmadan ayrılması, EDL tendonunun bölünen bölümünden kası tutup kaldırırken, aralarında bir yol açmak için yanal kasların geri kalanında çeşitli kesikler yapılarak yapılabilir. Kası tamamen izole etmek için, Uniband makası kullanarak sıçan dizine takılan tendonu kesin.Parçalanmış kası fiksatif çözeltiye daldırın ve dört santigrat derecede 24 saat bekletin. Genel olarak, uzun bir kas olması yararlıdır. Bunu yapmak için, sabitleme için kası takmak için karton ve zımba kullanın.Soleus kasını izole etmek için hayvanı çevirin. Deriden, cerrahi bir bıçak kullanarak kalkal tendonu kesin. Biyolojik cımbız ve Uniband makas yardımıyla gastrocnemius kasını kemiklerden ayırarak kas kapağı oluşturur.Soleus kas kapağının iç tarafında olacaktır. Kırmızı ve düz olduğu için tanımlanabilir. Bir çift biyolojik cımbızla, yukarıdaki gastrocnemius'un üzerinde bulunan soleus tendona ulaşın ve kaldırın.Uniband makasıyla tendonu kesin. Zayıf bağlanma noktalarının bir kısmını keserken tüm kası kaldırın. Son olarak, soleus kasını tamamen serbest etmek için, kalkaneal tendonu oluşturan soleus vesicle'ı kesin.EDL kası ile yapılan sabitleme adımını tekrarlayın. Bu yöntemi kullanmak için, zımbaları kaslara değil tendonlara sabitlemek önemlidir. 24 saatlik fiksasyon süresi geçtikten sonra, kas liflerini izole etmeye başlamadan önce kasları DPBS çözeltisinde durulayın.Lifleri izole etmek için, tendonlardan birini bir çift biyolojik cımbızla hafifçe tutun. Daha sonra diğer biyolojik cımbız çifti ile, kas liflerini ayırmak için tendonu yavaşça sıkıştırmaya başlar. Lifleri izole etmek için yavaşça karşı kas tendonuna doğru yukarı doğru çekin.Birden fazla, küçük, yalıtılmış demet elde edene kadar bu eylemi birkaç kez tekrarlamak gerekecektir. Küçük izole demetler halinde ayrıldıktan sonra, önceden işlenmiş silanize bir kaydıraktan dikkatlice yerleştirin. Tüm lifleri üst üste binmeyecek şekilde düzenli tutmak gerekir.Bu noktada lifler 24 saat boyunca hava kurutulur. 24 saat sonra, immünostainasyona başlayın. Su geçirmez bir bariyer oluşturmak için, önceden tedavi edilmiş slayttaki izole kas liflerini çevrelemek için bir PAP kalemi kullanın.Bu, burada açıklanan protokolün ardından elde edilebilen yüksek çözünürlüklü bir konfokal görüntü örneğidir. Sol üstte, post-sinaptik öğe gösterilir ve sağ üstte, sinaptik öncesi öğe gösterilirken, alt görüntüler morfometrik analiz için kullanılacak parametreleri göstermek için şematize edilmiş sinaptik bileşenleri gösterir. İkinci slayt, sinaptik öncesi ve sonrası sinyallerin API'nin çekirdek lekesiyle birleştirilmesini gösterir.Transgenik hayvanların ve transgenik olmayan hayvanların nöromüsküler kavşakları arasındaki farklılıklar açıkça görülebilir. Nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi, transgenik hayvanlarda sinaptik sonrası sinyalin kanıtlarını gösterir ve esas olarak nöromüsküler kavşak toplam alanının azalması nedeniyle daha kompakt görünmektedir. Burada gösterildiği gibi, transgenik hayvanın nöromüsküler kavşak pre-sinaptik alanı azalır.Tespit edilen en küçük, örneğin B görüntüsünde gösterildiği gibi fosforilasyon önleyici nörofilament sinyali ile bulunandı. Son görüntü, tam monte nöromüsküler kavşakların durumuyla ilgili sonuçları göstermektedir. Kapsama indeksi kullanılarak transgenik nöromüsküler kavşakların kısmen denervatlı olduğu tespit edilmiştir.Ayrıca, fosforilasyonlu nörofilamentin kapsamının ve nexus'unun fosforilasyonlu olmayan bir nörofilament tespit edildiğinde elde edilenden daha düşük olduğunu belirleyebilir. Önerilen protokol, yavaş ve hızlı kas liflerinden yüksek kaliteli nöromüsküler kavşak preparatları elde etmeyi sağlar. Sinaptik öncesi ve sonrası nöromüsküler kavşak bileşenleri belirli problar veya antikorlar tarafından tanımlandı ve daha sonra konfokal veya süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenerek mikrometrik ölçekte morfometrik analize olanak sağladı.

dissection-single-skeletal-muscle-fibers-for-immunofluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Gibi nöromüsküler kavşaklar (NMJs) terminal Schwann hücreleri (SC'ler) gibi sık donatılı dokularda, tek tek hücrelerin Görselleştirme zordur. "Ardışık fotoğraf beyazlatma" bleaching sıralı time-lapse görüntüleme ile kombine edilebilir triangularis sternumun kas eksplant, elverişli bir sinir-kas preparatı,, örneğin tek bir terminal SC'ler, tasvir verir...

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Kaynak: Marinello, M., et al. Kombine konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile farelerde nöromüsküler kavşakların karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, presinaptik ve postsinaptik yapıları görselleştirmek ve analiz etmek için konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak sıçan kas dokusundaki nöromüsküler kavşakların hazırlanmasını, immüno-boyanmasını ve görüntülenmesini göstermektedir.

Kombine Konfokal ve Süper Çözünürlüklü Mikroskopi ile Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Karakterizasyonu

Bu videoda, farenin enine abdominis kasının diseksiyonu için bir protokol gösteriyoruz ve nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için immünofluoresans ve mikroskopi kullanıyoruz.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Nöromüsküler kavşak (NMJ), bazen sinaptik yetmezlikle sonuçlanabilen çeşitli durumlarda değişir. Bu rapor, bu tür yapısal değişiklikleri ölçmek için floresan mikroskobu tabanlı yöntemleri açıklamaktadır.

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

Bu protokol, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS'nin fare modellerindeki patolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan kombine konfokal ve STED mikroskopisi ile nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.

Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi

Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Mitokondriyal boya terminali olan Schwann hücre mitokondrilerinin in vivo konfokal mikroskopi için yerel enjeksiyonları. Bu yöntem, sağlıklı veya hasta kaslı farelerin iskelet kas dokularında gösterilen kavram kanıtını kullanarak yüksek çözünürlüklü mitokondriyal görselleştirme sağlar.

Farelerin Kas ve Terminal Schwann Hücrelerinde Mitokondriyal Morfolojinin Yerinde Niceletilmesi Yöntemleri

Öğrenin, sıçan EDL ve soleus kaslarından tek kas liflerinin diseksiyonu ve immünofluoresan boyama ile tüm-mount nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi yöntemini. Bu protokol sinir-kas sinaps yapısını ve patolojik değişiklikleri incelemeyi sağlar.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Daha fazla video keşfet