Name: Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 13 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde endosit geri dönüşümünü yoğunluk gradyan ultracentrifugasyon ile izole etmeyi. Bu yöntem protein trafik araştırmalarını kolaylaştırır ve hücre biyolojisi çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Araştırma Hibeleri Konseyi Hong Kong, CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Hayır Kurumu'ndan fonlarla desteklendi. Bu çalışmadaki rakamlar, Ekim 2020'de FASEB Dergisi'nde yayınlanan "ARF6-Rac1 sinyal aracılı neurit büyümesi, nöronal adaptör FE65 tarafından ARF6 ve ELMO1'i düzenleyerek güçlenmiştir" adlı önceki yayınımızdan uyarlanmıştır.

1. Memeli hücre kültürü ve transfeksiyon
<ol><li>Plaka 2 x 106 hücre 100 mm kültür çanasında. Her transfection için dört yemek kullanın. NOT: Gerekli hücre sayısı farklı hücre hatları için değişebilir. İzolasyon adımına geçmeden önce optimizasyon gerekebilir.</li>
	<li>Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect.</li>
</ol>2. Hücre hasadı
<ol><li>Kültür ortamını 48 saat post-transfection atın.</li>
	<li>Hücreleri buz gibi PBS (10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür) ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Her yemeğe 1 mL buz gibi PBS+ (0,5x proteaz inhibitörü kokteyli ve 0,5x fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş PBS) ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir hücre kazıyıcı ile toplayın ve hücre süspansiyonu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 400 x g'da bir salıncak kova rotor kullanarak hücreleri santrifüjleme ile pelet.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL homojenizasyon tamponunda (HB; 250 mM sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol, 0.03 mM sikloeximid, 1x proteaz inhibitörü kokteyli ve 1x fosfataz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 1 mM EDTA).</li>
	<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 1.300 x g'da santrifüjleme ile toplayın.</li>
	<li>Hücre peletini 1 mL HB'de yeniden kullanın.</li>
	<li>Hücreleri 15-20 vuruş için bir Dounce homojenizatör ile homojenize edin. NOT: Örneğin, örneği bir şırınnadan geçirmek gibi diğer homojenizasyon yöntemleri kullanılabilir. Homojenizasyon verimliliği, homojenatın faz kontrastlı bir mikroskop altında gözlemlenmesiyle ortaya çıkabilir.</li>
	<li>Homojenatı 2 mL santrifüj tüpüne aktarın. NOT: 50 μL homojenatı 12,5 μL 5x numune tamponu ile hasat edin ve toplam lysate olarak etiketleyin.</li>
	<li>Homojeneye 0,7 mL HB ekleyin.</li>
	<li>Seyreltilmiş homojenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'da döndürün. NOT: Pelet çekirdek ve kırılmamış hücreler içerir.</li>
	<li>Süpernatant 1,5 mL toplayın ve 2,12 adımını bir kez yineleyin.</li>
	<li>Süpernatanttan 1,4 mL toplayın ve nükleer sonrası süpernatant (PNS) olarak etiketleyin.</li>
</ol>3. Yoğunluk gradyan kolon hazırlama
<ol><li>1,2 mL PNS'yi ultracentrifuge tüpüne aktarın.</li>
	<li>Numuneye 1 mL% 62 sakkaroz çözeltisi (2.351 M sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol) ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın. NOT: Eldeki çözüm% 40,6 sakkaroz çözeltisidir.</li>
	<li>Numunenin üzerine dikkatlice %35 sakkaroz çözeltisinin (1.177 M sakkaroz, pH 7.4'te 3 mM imidazol) 3.3 mL'sini ekleyin.</li>
	<li>%35 sakkaroz çözeltisinin üzerine 2,2 mL%25 sakkaroz çözeltisi (0,806 M sakkaroz, pH 7,4'te 3 mM imidazol) dikkatlice ekleyin. NOT: Oda sıcaklığındaki %62, %40,6, %35 ve %25 sakkaroz çözeltilerinin kırılma indisi sırasıyla 1,44, 1,40, 1,39 ve 1,37'dir. Sakkaroz çözeltilerinin kırılma indeksleri, deneyin hassasiyetini ve tutarlılığını sağlamak için bir refraktometre ile kontrol edilebilir.</li>
	<li>Ultracentrifugation tüpünü HB ile doldurun. NOT: Hazırlanan yoğunluk degrade sütununu geçici olarak 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. Geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonun fraksiyonasyonu ve geri kazanımı
<ol><li>Sütunu 4 °C'de 3 saat boyunca 210.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Degradenin üstünden başlayarak 12 kesir (her biri 1 mL) dikkatlice toplayın. NOT: Geri dönüşüm endozomları arayüzde %35 ile %25 sakkaroz çözeltileri arasında bulunmalıdır. Toplanan fraksiyonlar sıvı nitrojen içinde çıtlatılabilir ve -80 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Tüm fraksiyonları 1 mL seyreltme tamponu ile seyreltin (pH 7.4'te 3 mM imidazol, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Seyreltilmiş numuneyi 100.000 x g'da 4 °C'de 1 saat boyunca santrifüj edin.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve fraksiyonları toplamak için 50 μL 1x numune tamponu ekleyin.</li>
	<li>Fraksiyonlardaki protein içeriğini batı şişkinliği ile analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+pathways+and+endosomal+trafficking%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiener+Medizinische+Wochenschrift%22%5BJournal%5D)">Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer.</a> Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).</li>
<li>Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+unplugged%3A+multiple+ways+to+enter+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell.</a> Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).</li>
<li>Naslavsky, N., Caplan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+endosome+-+sorting+the+ins+and+outs+of+endocytic+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The enigmatic endosome - sorting the ins and outs of endocytic trafficking.</a> Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).</li>
<li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).</li>
<li>Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognising+the+signals+for+endosomal+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recognising the signals for endosomal trafficking.</a> Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).</li>
<li>Khan, I., Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis%3A+a+pivotal+pathway+for+regulating+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis.</a> British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).</li>
<li>Grant, B. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+mechanisms+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways and mechanisms of endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).</li>
<li>Maxfield, F. R., McGraw, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic recycling.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).</li>
<li>McDonald, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosion+in+the+complexity+of+membrane+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Explosion in the complexity of membrane protein recycling.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).</li>
<li>O'Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Recycling+pathway-at+the+crossroads+of+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074(2020).</li>
<li>D'Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+ARF6+in+receptor-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis.</a> Science. 267 (5201), New York, N. Y. 1175-1178 (1995).</li>
<li>Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D'Souza-Schorey, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endocytic+recycling+impacts+cell+movement%2C+cell+division+and+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Finicle, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipids+inhibit+endosomal+recycling+of+nutrient+transporters+by+inactivating+ARF6%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6.</a> Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APE1+upregulates+MMP-14+via+redox-sensitive+ARF6-mediated+recycling+to+promote+cell+invasion+of+esophageal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 79 (17), 4426-4438 (2019).</li>
<li>Qi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arf6-driven+endocytic+recycling+of+CD147+determines+HCC+malignant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471(2019).</li>
<li>Crupi, M. J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GGA3-mediated+recycling+of+the+RET+receptor+tyrosine+kinase+contributes+to+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion.</a> Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).</li>
<li>Gamara, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Arf6+deletion+in+PLB-985+differentiated+in+neutrophil-like+cells+and+in+mouse+neutrophils%3A+impact+on+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 2713074(2020).</li>
<li>Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DOCK180%2FElmo+complex+couples+ARNO-mediated+Arf6+activation+to+the+downstream+activation+of+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1.</a> Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).</li>
<li>Wibo, M. Cell fractionation by centrifugation methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWibo%2C+M+%22Eukaryotic+Cell+Function+and+Growth%3A+Regulation+by+Intracellular+Cyclic+Nucleotides%22">Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides</a>. Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. , Springer. Boston, MA. 1-17 (1976).</li>
<li>Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab11+proteins+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Rab11 proteins in health and disease.</a> Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+adaptor+FE65+stimulates+Rac1-mediated+neurite+outgrowth+by+recruiting+and+activating+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).</li>
<li>Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-Rac1+signaling-mediated+neurite+outgrowth+is+potentiated+by+the+neuronal+adaptor+FE65+through+orchestrating+ARF6+and+ELMO1%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).</li>
<li>Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+proteomics%3A+implications+for+subcellular+fractionation+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics.</a> Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).</li>
<li>Fleischer, S., Kervina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+of+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation of rat liver.</a> Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).</li>
<li>Marsh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+and+lysosome+purification+by+free-flow+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis.</a> Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).</li>
<li>Stasyk, T., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zooming+in%3A+fractionation+strategies+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Zooming in: fractionation strategies in proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).</li>
<li>Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+collection+of+nanoscopic+vesicles+from+an+organotypic+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model.</a> RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).</li>
<li>Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+endosome+membrane+dynamics+characterized+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry.</a> Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).</li>
<li>Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+specialized%2C+antigen-loaded+early+endosomal+subpopulation+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).</li>
<li>Thapa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-3-OH+kinase+signaling+is+spatially+organized+at+endosomal+compartments+by+microtubule-associated+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).</li>
<li>Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuimaraes+de+Araujo%2C+ME+%22Endocytic+Organelles%3A+Methods+For+Preparation+And+Analysis.+In+eLS%22">Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2001).</li>
<li>Rickwood, D., Graham, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRickwood%2C+D+%22Centrifugation+Techniques%22">Centrifugation Techniques</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Hoboken, NJ. (2015).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+macrophage+early+and+late+endosomes+by+latex+bead+internalization+and+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).</li>
<li>Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+APPL+endosomes%3A+the+role+of+annexin+A2+in+APPL+membrane+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment.</a> Traffic. 12 (9), Copenhagen, Denmark. 1227-1241 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar bu makalenin içeriği ile herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Yukarıdaki protokol, kültürlü hücrelerden geri dönüşüm endozomlarını ultracentrifugation ile izole etme prosedürlerini özetlemektedir. Bu yöntemin güvenilirliği en son yayınla gösterilmiştir 22 Geri dönüşüm endozomlarının Golgi aparatı ve mitokondri gibi diğer organellerdenbaşarıylaizole edildiğini kanıtlayan22. İyi bir ayrılık sonucu elde etmek için bazı kritik adımlara dikkat edilmesi gerekir. Sakkaroz çözeltileri hazırlanırken, çözeltilerin kırılma indekslerinin bi...

Endosomal kaçakçılık, çeşitli biyolojik olayları bulaştıran temel bir fizyolojik süreçtir1, örneğin, sinyal reseptörlerinin, iyon kanallarının ve yapışma moleküllerinin taşınması. Plazma membranda lokalize proteinler endositoz ile içselleştirilir2. İçselleştirilmiş proteinler daha sonra erken endozom3ile sıralanır. Bazı proteinler bozulma için lizozomlara yöneliktir4. Bununla birlikte, hızlı geri dönüşüm ve yavaş geri dönüşüm işlemleri ile önemli miktarda protein hücre yüzeyine geri dönüştürülmektedir. Hızlı geri dönüşümde proteinler erken endozomları bırakır ve doğrudan plazma zarlarına geri döner. Tersine, yavaş geri dönüşümde proteinler önce endosit geri dönüşüm bölmesine sıralanır ve daha sonra plazma zarı ile geri taşınır. Clathrin, retromer kompleksi, retriever kompleksi ve Wiskott-Aldrich sendromu proteini ve SCAR Homologue (WASH) kompleksi gibi çeşitli kargo proteinleri, bu tür membran geri dönüşümsüreçlerine katılır 4,5,6,7 ,8,9. Endositoz ve geri dönüşüm olayının dengesi hücre sağkalımı için çok önemlidir ve çeşitli hücresel olaylara katkıda bulunur10, örneğin, hücre yapıştırma, hücre göçü, hücre polaritesi ve sinyal transdüksiyon.
Küçük bir GTPase olan ARF6, endosit kaçakçılığı7, 11,12'nin bildirilen bir düzenleyicisi. İlgi çekici olan, çeşitli araştırma grupları ARF6'nın endosit geri dönüşümünde önemini göstermiş13,14,15,16,17. Çalışma, ARF6 aracılı neurit büyümesi ve endosit geri dönüşümü arasındaki ilişkiyi araştırmayı amaçlamaktadır. Önceki rapor, ARF6'nın aktivasyonunun, sitokinoz 1 (DOCK180) kompleksi 18'in ELMO1-ayırıcısına göre hareketederekRac1 etkinliğine kadar olduğunu göstermektedir. Ancak ARF6'nın ELMO1-DOCK180 aracılı Rac1 sinyalini nasıl tetiklediği belirsizliğini koruyor. Arf6 aracılı endosit geri dönüşümün bu süreçteki rolünü araştırmak için yoğunluk gradyan ultracentrifugation kullanıldı. Bunu kullanarak, geri dönüşüm endozom içeren fraksiyon hücre lizatları19elde edildi. Fraksiyon protein içeriği analizi için Batı şişkinliğine maruz kaldı. İmmünoblot sonuçları, beyin bakımından zenginleştirilmiş bir adaptör proteini olan FE65'in varlığı altında, aktif ARF6'nın geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonda ELMO1 seviyesini önemli ölçüde artırdığını ortaya koydu. Aşağıdaki protokol, (1) memeli hücrelerinin transfecting prosedürlerini içerir; (2) örneklerin ve yoğunluk degrade sütunlarının hazırlanması; ve (3) geri dönüşüm endozom içeren fraksiyonu elde etmek.

<table><tbody><tr><td>1 mL, Üstü Açık Kalın Duvar Polipropilen Tüp, 11 x 34 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>347287</td><td></td></tr><tr><td>100 mm doku kültürü kabı</td><td>SPL</td><td>20100</td><td></td></tr><tr><td>13,2 mL, Sertifikalı Ücretsiz Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14277</td><td></td></tr><tr><td>5x Örnek Tamponu</td><td>GenScript</td><td>MB01015</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitör Kokteyli</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>COX IV (3E11) Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>4850S</td><td>COX IV'ü tespit etmek için tavşan monoklonal antikoru.</td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Doku Öğütücü, 7 mL</td><td>DWK Yaşam Bilimleri</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun düşük glikozlu Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) HyClone</td><td></td><td>SH30021.01</td><td></td></tr><tr><td>ELMO1 antikoru (B-7)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-271519</td><td>ELMO1'i tespit etmek için fare monoklonal antikoru.</td></tr><tr><td>EndoFree Plazmid Maxi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>FE65 antikoru (E-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-19751</td><td>FE65'i tespit etmek için keçi poliklonal antikoru.</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Araştırma Sınıfı</td><td>HyClone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Monoklonal Antikor (6C5)</td> <td>Ambion</td><td>AM4300</td><td>GAPDH'yi tespit etmek için fare monoklonal antikoru.</td></tr><tr><td>ImageLab Yazılımı</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Bant yoğunluğunun ölçümü</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-&beta;-COP antikoru</td><td>Sigma</td><td>G6160</td><td>&beta;-COP'u tespit etmek için fare monoklonal antikoru.</td></tr><tr><td>Myc-tag (9B11) fare mAb</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td><td>2276S</td><td>Myc etiketli proteinleri tespit etmek için fare monoklonal antikoru.</td></tr><tr><td>OmniPur EDTA, Disodyum Tuzu, Dihidrat</td><td>Calbiochem</td><td>4010-OP</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985070</td> PBS Tabletleri Gibco 18912014 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4906845001</tr><tr><td>RAB11A-Spesifik Poliklonal antikor</td><td>Proteintech</td><td>20229-1-AP</td><td>Rab11'i tespit etmek için tavşan poliklonal antikoru.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ21931A4</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Sallanan Kovalı Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>TLA-120.2 Sabit Açılı Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>362046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300062</td><td></td></tr></tbody></table>

memeli hücrelerinde endosit geri dönüşümü araştırmak için yoğunluk gradyan ultracentrifugation

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal kaçakçılık, çok çeşitli biyolojik olayları düzenleyen önemli bir hücresel süreçtir. Proteinler plazma zarından içselleştirilir ve daha sonra erken endozomlara taşınır. İçselleştirilmiş proteinler bozulma için lizozomlara iletilebilir veya plazma zarı geri dönüştürülebilir. Membran malzemelerinin endositozdan uzaklaştırılmasını dengelemek için sağlam bir endositotik geri dönüşüm yolu gereklidir. ADP-ribosilasyon faktörü 6 (ARF6) dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin yolu düzenlediği bildirilmektedir. Yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme hücre fraksiyonasyonu için klasik bir yöntemdir. Santrifüjlemeden sonra organeller izopik yüzeylerine çökeltilir. Kesirler toplanır ve diğer aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonunu kullanarak transfected memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozom içeren bir fraksiyon elde etmek için bir protokol açıklanmıştır. İzole fraksiyonlar, protein içeriklerini analiz etmek için standart Batı şişkinliğine maruz kaldı. Bu yöntemi kullanarak, Ras ile ilişkili bir C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1) guanin nükleotid değişim faktörü olan yutkunma ve hücre hareketliliği 1 'in (ELMO1) plazma zarının hedeflenmesinde ARF6 aracılı endosit geri dönüşümünden geçtiğini belirledik.

İletilmemiş HEK293 hücrelerini yoğunluk gradyan ultrasantrifüjasyonu ile kesirlendikten sonra, degradenin üstünden başlayarak 12 fraksiyon toplandı. Hasat edilen fraksiyonlar seyreltme tamponu ile 1:1 oranında seyreltildi ve ikinci bir santrifüjleme turuna tabi tutuldu. Numuneler daha sonra protein içeriklerini analiz etmek için batı şişkinliğine maruz kaldı. Şekil 1'degösterildiği gibi, geri dönüşüm endozom işaretçisi Rab11 kesir 720'detespit edilir. β-COP, COX IV, G...

Bu makale, sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation kullanarak memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanması için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Bu protokol, endosit kaçakçılığı yoluyla protein kaçakçılığının araştırılmasını kolaylaştırmak için transfected memeli hücrelerinden fraksiyon içeren geri dönüşüm endozomlarının izole edilmesine yardımcı olur. Bu tekniğin kullanımı kolaydır ve hem doku hem de hücre örnekleri için geçerlidir. Prosedürü gösteren bayan Zhai Yu Qi, Dr.Lao Laboratuvarı'ndan bir doktora öğrencisi.Başlamak için, 100 milimetrelik bir kültür çanasında 6 hücreye 2 kez 10 plakalayın. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect. Hücreleri hasat etmek için, transfection sonrası 48 saat kültür ortamını atın ve hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.Daha sonra her yemeğe 0,5X fosfataz inhibitörü kokteylinde 0,5X proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi PBS ekleyin. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri toplayın ve hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. sallanan kova rotor kullanarak santrifüjleme ile hücreler.Süpernatantı atın ve hücre peletini beş mililitre homojenizasyon tamponunda hafifçe yeniden diriltin. Hücreleri santrifüjleme ile tekrar toplayın ve hücre peletini bir mililitre homojenizasyon tamponunda yeniden biriktirin. Hücreleri 15 ila 20 vuruş kullanarak bir Dounce Homojenizatör ile homojenize edin.Daha sonra homogonat iki mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Homogonate 700 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra seyreltilmiş homogonat döndürün ve 1,5 mililitre süpernatant toplayın.Toplanan süpernatantı tekrar döndürün, sonra 1,4 mililitre süpernatantı toplayın ve nükleer sonrası süpernatant olarak etiketleyin. Yoğunluk gradyan sütununu hazırlamak için, nükleer sonrası süpernatantın 1,2 mililitresini ultracentrifuge tüpüne aktarın. Daha sonra numuneye bir mililitre% 62 sakkaroz çözeltisi ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın.Daha sonra, numunenin üzerine 3,3 mililitre% 35 sakkaroz çözeltisi ve ardından% 35 sakkaroz çözeltisinin üzerine 2,2 mililitre% 25 sakkaroz çözeltisi ekleyin. Son olarak, ultracentrifuge tüpünü homojenizasyon tamponu ile doldurun. Yoğunluk gradyan sütununu santrifüjlayın ve degradenin üstünden başlayarak her biri 1 mililitrenin 12 kesirini dikkatlice toplayın.Daha sonra, tüm fraksiyonları bir mililitre seyreltme tamponu ile seyreltin ve seyreltilmiş numuneleri santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve fraksiyonları toplamak için 50 mikrolitre 1X numune tamponu ekleyin. Geri dönüşüm endozom işaretleyicisi Rab11, Fraksiyon 7'de tespit edildi.Beta COP, COX IV, GAPDH, AEA1, Rab 7 ve Lamp1 dahil olmak üzere diğer hücre altı belirteçleri de araştırıldı. Kesir 7'de pozitif bir AEA1 sinyali de tespit edildi. GAPDH, Cox IV ve Rab11'in hem Fraksiyon yedi hem de nükleer sonrası üstünlükteki ölçülen bant yoğunlukları burada gösterilmiştir.HEC293 hücrelerini ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L veya ELMO1 ARF6Q67L FE65 ile geçirdikten sonra, ARF6Q67L ve FE65 aşırı ifade ile ELMO1 dağıtımında herhangi bir değişiklik bulunamadı. Fraksiyon yedi'deki ELMO1 seviyesi farklı transfeksiyonlar arasında karşılaştırıldı ve ARF6Q67L'nin kotransfeksiyonu sonrasında yükseldiği tespit edildi. Hem ARF6Q67L hem de FE65 birlikte ifade edildiğinde daha fazla artış gözlendi.Tersine, FE65'i nakavt etmek, Arf6 aracılı Elmo1 zenginleştirmesini Fraksiyon yedi'de azalttı. Elde edilen kesir sonraki analizler için kullanılabilir. Örneğin, fraksiyondaki protein seviyesi değişikliklerini görselleştirmek için batı şişkinliği.

density-gradient-ultracentrifugation-for-investigating-endocytic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Bu videoda, tek çekirdekleri izole etmek için gradyan santrifüjleme kullanan basit ve verimli bir protokolü açıklıyoruz. İzole edildikten sonra, bu çekirdekler dizileme ve genom analizi için kullanılabilir.

Çekirdeklerin Gradyan Santrifüj Tabanlı Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme Kullanılarak Bozulmamış Çekirdeklerin Ultra Saf Fraksiyonunu Elde Etme Tekniği

Bu video, karakterizasyon çalışmaları için uygun hücre dışı veziküllerin alt popülasyonlarını izole etmek için yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme tabanlı saflaştırma yöntemini göstermektedir.

Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarının Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Ultrasantrifüjleme Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarını Saflaştırma Tekniği

Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Kullanılarak İnsan Dışkısından Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Protokol, yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak HSD ile beslenen tuza duyarlı sıçanlardan bağırsak mikrobiyal EV'lerinin izolasyonunu açıklar. EV'ler, boyut, morfoloji, bileşim ve mikrobiyota kökenini analiz etmek için nanopartikül izleme, TEM, LPS/BCA testleri ve 16S rRNA dizilimi ile karakterize edildi.

Yüksek Tuzlu Diyet Koşulları Altında Tuza Duyarlı Sıçanlarda Bağırsak Mikrobiyal Hücre Dışı Veziküllerinin Ayrılması ve Diferansiyel Karakterizasyonu

Bu protokol, yüksek yoğunluklu lipoprotein küçük RNA'ların izolasyonunu ve miktar tayinini açıklar.

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

Öğrenin, memeli hücrelerinde endosit geri dönüşümünü yoğunluk gradyan ultracentrifugasyon ile izole etmeyi. Bu yöntem protein trafik araştırmalarını kolaylaştırır ve hücre biyolojisi çalışmalarına katkı sağlar.

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Daha fazla video keşfet