Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation
30 Haziran 2021
Bu makale, sakkaroz yoğunluğu gradyan ultracentrifugation kullanarak memeli hücrelerinden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanması için bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.
Bu protokol, endosit kaçakçılığı yoluyla protein kaçakçılığının araştırılmasını kolaylaştırmak için transfected memeli hücrelerinden fraksiyon içeren geri dönüşüm endozomlarının izole edilmesine yardımcı olur. Bu tekniğin kullanımı kolaydır ve hem doku hem de hücre örnekleri için geçerlidir. Prosedürü gösteren bayan Zhai Yu Qi, Dr.Lao Laboratuvarı'ndan bir doktora öğrencisi.
Başlamak için, 100 milimetrelik bir kültür çanasında 6 hücreye 2 kez 10 plakalayın. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre hücreleri Lipofectamine ile transfect. Hücreleri hasat etmek için, transfection sonrası 48 saat kültür ortamını atın ve hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.
Daha sonra her yemeğe 0,5X fosfataz inhibitörü kokteylinde 0,5X proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi PBS ekleyin. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak, hücreleri toplayın ve hücre süspansiyonu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. sallanan kova rotor kullanarak santrifüjleme ile hücreler.
Süpernatantı atın ve hücre peletini beş mililitre homojenizasyon tamponunda hafifçe yeniden diriltin. Hücreleri santrifüjleme ile tekrar toplayın ve hücre peletini bir mililitre homojenizasyon tamponunda yeniden biriktirin. Hücreleri 15 ila 20 vuruş kullanarak bir Dounce Homojenizatör ile homojenize edin.
Daha sonra homogonat iki mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Homogonate 700 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin. Daha sonra seyreltilmiş homogonat döndürün ve 1,5 mililitre süpernatant toplayın.
Toplanan süpernatantı tekrar döndürün, sonra 1,4 mililitre süpernatantı toplayın ve nükleer sonrası süpernatant olarak etiketleyin. Yoğunluk gradyan sütununu hazırlamak için, nükleer sonrası süpernatantın 1,2 mililitresini ultracentrifuge tüpüne aktarın. Daha sonra numuneye bir mililitre% 62 sakkaroz çözeltisi ekleyin ve hafif pipetleme ile iyice karıştırın.
Daha sonra, numunenin üzerine 3,3 mililitre% 35 sakkaroz çözeltisi ve ardından% 35 sakkaroz çözeltisinin üzerine 2,2 mililitre% 25 sakkaroz çözeltisi ekleyin. Son olarak, ultracentrifuge tüpünü homojenizasyon tamponu ile doldurun. Yoğunluk gradyan sütununu santrifüjlayın ve degradenin üstünden başlayarak her biri 1 mililitrenin 12 kesirini dikkatlice toplayın.
Daha sonra, tüm fraksiyonları bir mililitre seyreltme tamponu ile seyreltin ve seyreltilmiş numuneleri santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve fraksiyonları toplamak için 50 mikrolitre 1X numune tamponu ekleyin. Geri dönüşüm endozom işaretleyicisi Rab11, Fraksiyon 7'de tespit edildi.
Beta COP, COX IV, GAPDH, AEA1, Rab 7 ve Lamp1 dahil olmak üzere diğer hücre altı belirteçleri de araştırıldı. Kesir 7'de pozitif bir AEA1 sinyali de tespit edildi. GAPDH, Cox IV ve Rab11'in hem Fraksiyon yedi hem de nükleer sonrası üstünlükteki ölçülen bant yoğunlukları burada gösterilmiştir.
HEC293 hücrelerini ELMO1, ELMO1 ARF6Q67L veya ELMO1 ARF6Q67L FE65 ile geçirdikten sonra, ARF6Q67L ve FE65 aşırı ifade ile ELMO1 dağıtımında herhangi bir değişiklik bulunamadı. Fraksiyon yedi'deki ELMO1 seviyesi farklı transfeksiyonlar arasında karşılaştırıldı ve ARF6Q67L'nin kotransfeksiyonu sonrasında yükseldiği tespit edildi. Hem ARF6Q67L hem de FE65 birlikte ifade edildiğinde daha fazla artış gözlendi.
Tersine, FE65'i nakavt etmek, Arf6 aracılı Elmo1 zenginleştirmesini Fraksiyon yedi'de azalttı. Elde edilen kesir sonraki analizler için kullanılabilir. Örneğin, fraksiyondaki protein seviyesi değişikliklerini görselleştirmek için batı şişkinliği.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, sükroz yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjasyon kullanarak memeli hücrelerden geri dönüşüm endozomlarının hazırlanmasına yönelik bir protokol sunmaktadır. Bu teknik, endositik yollar aracılığıyla protein taşınımının incelenmesini kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Endositoz
- Protein Trafiği
Arka Plan
- Geri dönüşüm endozomları, hücresel taşınımda kritik bir rol oynar.
- Protein taşınımını anlamak, çeşitli hücresel süreçlere dair içgörüler elde etmek için gereklidir.
- Ultrasantrifüjasyon, hücresel bileşenlerin izole edilmesi için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.
- Bu protokol hem doku hem de hücre örnekleri için uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Geri dönüşüm endozomlarını izole etmek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Endositik taşıma mekanizmalarının anlaşılmasını geliştirmek.
- Hücre içi protein dinamikleri konusundaki gelecekteki araştırmaları desteklemek.
Kullanılan Yöntemler
- Lipofectamine ile memeli hücrelerin transfeksiyonu.
- Transfeksiyondan 48 saat sonra hücrelerin hasadı.
- Hücrelerin buz gibi soğuk PBS ile yıkanması.
- İzolasyon için sükroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjasyonunun kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Transfekte edilmiş hücrelerden geri dönüşüm endozomlarının başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Protokolün bir doktora öğrencisi tarafından gösterimi.
- Protein taşınımı üzerine yapılacak ileri çalışmaların kolaylaştırılması.
- Yöntemin çeşitli örnek türlerine uygulanabilirliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu protokol, geri dönüşüm endozomlarını izole etmek için basit bir yaklaşım sunmaktadır.
- Protein taşınımının anlaşılmasına yardımcı olması beklenmektedir.
- Bu yöntem, çeşitli biyolojik araştırma bağlamlarında kullanılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Geri dönüşüm endozomlarının izole edilmesi, kantitatif hücre altı fraksiyonlama verileri sağlayarak endositik trafik hedeflerinin mekanistik risk analizinin yapılmasını sağlar. Bu durum, ARF6 efektörleri gibi membran proteini geri dönüşümünü düzenleyen proteinler için hedef doğrulamayı ve analiz geliştirmeyi destekler. Bu yöntem, protein lokalizasyonunu fonksiyonel geri dönüşüm yollarıyla ilişkilendirerek öncü bileşik belirlemede öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: ARF6 ve ELMO1 gibi endositik geri dönüşüm regülatörleri hakkındaki terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Yolaktaki proteine özgü taşınma mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için fraksiyonlama verileri sağlar.
- Bilimsel Değer: Geri dönüşüm endozom fraksiyonlarında hedef etkileşimini doğrulayarak biyolojik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt aşamadaki Western blot analizi için valide edilmiş geri dönüşüm endozomu içeren fraksiyonlar hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kantitatif protein ölçümü için organellerin standardize ve tekrarlanabilir şekilde izole edilmesini sağlar.
- Bilimsel Değer: Endositik geri dönüşümü modüle eden bileşiklerin taranması için assay hazırlığını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Rab11-pozitif fraksiyon izolasyonu aracılığıyla, keşif aşamasındaki taşınım verilerini preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: Subsellüler fraksiyonasyondan, hastalıkla ilgili sistemlerdeki fonksiyonel doğrulamaya kadar olan sürekliliği sağlar.
- Bilimsel Değer: Hedef lokalizasyonun geri dönüşüm yollarında onaylanmasıyla, riski ayarlanmış ilerlemeyi destekler.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulama ve öncü bileşik belirleme kararlarına temel teşkil eden hücre altı fraksiyonları izole ederek erken keşif iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Fraksiyonlama ve belirteç analizi yoluyla endositik geri dönüşüm düzenleyicilerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Protein miktar tayini için Rab11-pozitif fraksiyonların standartlaştırılmış izolasyonu aracılığıyla assay geliştirmeye olanak tanır.
- Analitik: Farklı koşullar arasındaki protein zenginleşmesini karşılaştırmak için fraksiyonlardan kantitatif Western blot çıktıları üretir.
- Translasyonel Araştırma: Geri dönüşüm endozom izolasyonunu doğrulayarak fraksiyonlama verilerini preklinik süreklilikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef doğrulama projesi genelinde hücre altı fraksiyonlama için yeniden kullanılabilir bir platform sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Trafik yollarındaki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tutarlı alt analizler için organel izolasyonunun tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Geri dönüşüm yolu hedefleri için hücresel alt lokalizasyon verileri sağlayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Geri dönüşüm endozom zenginleştirme verilerine dayalı olarak hedeflerin riske göre ayarlanmış önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, transfeksiyon ve ultrasantrifügasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Yoğunluk gradyanı ayırımı için salınımlı kova rotorlarına ve ultrasantrifüjlere erişime bağlıdır.
- Karşılaştırılabilir Rab11 fraksiyon izolasyonu için fraksiyonlama protokollerinin ekipler arasında standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı hücre tipleri veya taşınım yolakları için marker panellerinin (örneğin, Rab11, EEA1) uyarlanmasını gerektirir.
- Alt uygulamalardan önce fraksiyon saflığını doğrulamak için validasyon markerlarına duyulan ihtiyaçla sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Mammalian Cell Culture, Transfection and Cell Harvest
2:07
Density Gradient Column Preparation
2:46
Fractionation and Recovery of Recycling Endosome-Containing Fraction
3:17
Results: Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells
4:47
Conclusion
