Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Gama-Delta T hücreleri akut miyeloid lösemi de dahil olmak üzere birçok kanser türüne karşı güçlü sitotoksik aktiviteye sahiptir. Bununla birlikte, bir kandaki dolaşımdaki Gama-Delta T hücreleri, özellikle maligniteleri olan hastalarda nispeten nadirdir. Donör türevi, X-vivo genişletilmiş Gama-Delta T hücrelerinin infüzyonu, löseminin tekrarlamasını azaltma ve akut miyeloid lösemili hastaların hayatta kalmalarını iyileştirme sözüne sahiptir.

Önerilen yöntem, üç kolay adımda, son derece saf bir Gama-Delta T hücre ürününün terapötik olarak ilgili dozlarına ulaşarak 200.000 kat Gama-Delta T hücre genişlemesinden daha fazlasını elde eder. Yani bir IEL'yi genişlemeye, alfa beta T hücre tükenmesine manyetik sıralama ve AAPC'lerle ödül ikincil genişleme ile bağlama. Önerilen yöntem, gama-delta T hücrelerinin kanser ve otoimmün hastalıklar gibi hastalıklar için faydasını hızla raftan kullanılabilecek çok sayıda hücre oluşturarak genişletir.

Bu işlem, farklı zenginleştirme yöntemleri kullanılarak gama-delta hücrelerini genişletmek ve transdüksiyon gibi ek manipülasyonlar eklemek için uyarlanabilir. Prosedürü göstermek LA'de, bir hücre terapisi teknolojisti, üç tane laboratuvarımdan alınacak. Efervescence ürün örneğinin, karşı akış santrifüjleme cihazında, %1 insan serum albümin ve ikincil salin çözeltisi veya DPBS ortamı ile Hanks dengeli tuz çözeltisinin birincil ortamını kullanarak elütriasyonu ile başlayın.

900 kat G'de elütriasyon santrifüjleme hızı ile akış hızına ve zamana göre kesirleri toplayın. Akış sitometrisi ile sterilite testi, hücre sayısı ve hücre fenotipleme yapmak için örnekleri ikinci fraksiyondan toplayın. İkinci fraksiyondan, kültürdeki hücrelerin saf bir lenfosit fraksiyonunu 10 kez 10'da santimetre kare başına altıncı hücrelere genişletin, bir litre kapalı sistem biyoreaktörde litre zoledronik asit başına beş mikromol ve Interleukin-2 mililitresi başına 300 birim.

Sistemi 37 santigrat derecede yedi gün boyunca kuluçkaya yatırın, %5 karbondioksit ile. Kuluçkadan sonra, bir litre kapalı sistem biyoreaktör şişesinden hücreleri hasat edin. Bunu yapmak için, steril bir litrelik transfer paketini biyoreaktörün kırmızı çizgisine kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için uygun farmasötik pompayı kullanın.

Harcanan orta sterilite, hücre sayısı ve hücre fenotiplemenin akış sitometrisi ile test için örnekleri alın. Kalan örnekten, %0,5 HSA ve biyotinillenmiş T hücre reseptörü, alfa beta spesifik antikor içeren PBS-EDTA tamponunda, hücreleri mililitre başına beş çarpı 10 ila sekizinci hücrede yeniden askıya alın. Ve hücreleri 2 ila 8 santigrat derecede sallanarak kuluçkaya yatır.

15 dakika sonra, sınırsız antikoru çıkarmak için hücreleri 0,5 HSA ve 200 ila 500 kez G'de santrifüj içeren 600 mililitre PBS-EDTA tamponu ile 15 dakika boyunca iki ila sekiz santigrat derecede yıkayın. Daha sonra, %0,5 HSA ve anti-biotin spesifik mikrobead şişesi başına 7,5 mililitre içeren PBS-EDTA tamponunda, hücreleri mililitre başına yaklaşık beş kez 10 ila sekizinci hücrede yeniden askıya alın. Daha önce açıklandığı gibi, sınırsız mikropları çıkarmak için hücre süspansiyonu santrifüjlemeden önce hücreleri sallama ile kuluçkaya yatırın.

PBS-EDTA tamponunda mililitre başına 6 kez 10 ile %0,5 HSA ile yedinci hücreleri yeniden askıya alın. Onları bir transfer paketi çantasına toplayın. Alet tarafından talimat verildiğinde çivile.

Ardından, klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazına bir boru seti takın. Paketleri PBS-EDTA arabelleği ve hücre ürünü içeren transfer paketini cihaza yerleştirin. Etiketli alfa beta T hücrelerinin tükenmesi için yazılımdaki tükenme 1.2 protokolünü seçin.

Ardından, Gama-Delta T hücreleriyle zenginleştirilmiş hedef fraksiyonu toplamak için hücre ürününü santrifüj edin. Toplanan hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş ortamda yeniden askıya alın. Hücre sayısı canlılığı ve akış sitometri fenotipleme sonrası tükenme gerçekleştirin.

Hücreleri mililitre başına altıncı hücrelere yaklaşık bir kez 10 kez son konsantrasyona getirin. X-ışını üreten cihaz üzerinde 100 gride, şişe başına yedinci Yapay Antijen sunan Hücrelere veya AAPC'lere beş kez 10 kez ışınlayın. Işınlanmış AAPC'leri ve Gama-Delta T hücrelerini bir litre kapalı sistem biyoreaktör şişelerinde 10'a bir oranında yerleştirerek bir ortak kültür hazırlayın.

% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş bir litre kültür ortamı ile 10 şişeye kadar tohum. Kültürü 37 santigrat derecede ve 10 gün boyunca% 5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın, şeritler, glikoz ve laktat ölçer kullanarak her üç ila dört günde bir glikoz ve laktat seviyelerinin taranmasını sağlar. Glikoz seviyesi desilitre başına 215 miligrama düşerse, şişedeki hacmi 200 mililitreye düşürün.

Kalan 200 mililitrelik ortamdaki hücreleri karıştırın ve akridin turuncu veya propidium iyodür boyama ile hücre sayımı ve canlılık ölçümü için 0,5 mililitrelik bir örnek çıkarın. Hücre sayısı eşitse veya dokuzuncuya 10'dan fazlaysa, bir şişenin içeriğini ikiye bölün ve her şişeyi% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş AIM-V ortamı ile bir litreye kadar doldurun. Hücre sayısı 10 ila dokuzuncudan azsa, hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş taze bir litre kültür ortamı ile besleyin ve şişeleri inkübatöre geri verin.

Ortak kültürde 10 günün sonunda, biyoreaktör şişelerini teker teker hasat edin ve tüm hücreleri uygun boyutta bir transfer paketine çekin. Kalite kontrol örneklerini çıkardıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 ila 500 kez G'de santrifüjleyin ve üstnatantı atın. Hücreleri, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 ila 500 kez G'de% 0,5 HSA ile desteklenmiş dengeli bir kristaloid çözelti çözeltisinde yıkayın.

%0,5 HSA ile 100 ila 300 mililitre dengeli kristaloid çözelti hedef hacminde yeniden askıya alın. Hücreler, karşı akış sonrası santrifüjleme kesirinden ayrıldı. İkisi saf lenfosit popülasyonu verdi, mükemmel ortalama canlılığı ile 95.80% Gama-Delta T hücrelerine özgü genişleme, zoledronik asit ile elutriasyondan sonra lenfosit fraksiyonunda bulunan doğal öldürücü hücrelerin başlangıç yüzdesi bağlıydı.

Gama-Delta T hücreli ilaç maddesinin T hücre reseptörü alfa beta tükenmesi ile zenginleştirilmesi tutarlıydı. Üç sağlıklı donörden üretilen Gama-Delta T hücreli ilaç ürünü, ortalama %0,11 CD20 pozitif B hücresi ve %0,00 T hücreli reseptör alfa beta pozitif T hücrelerinin %1'inden daha az salınım kriterini karşıladı. Nihai üründeki doğal öldürücü hücrelerin ortalama yüzdesi% 35'ten az hücre yüzeyi boyama ve akış sitometrik analizinin salınım kriterini karşılayan yaklaşık% 17.06 idi, ilaç maddesinin ve ilaç ürününün kimliğini, saflığını ve işlem saflıklarını karakterize etmek için kullanılmıştır.

AAPC ve Gama-Delta T hücreli uyuşturucu maddesinin ortak kültüründen elde edilen ikinci yeniden genişleme, tüm salınım kriterlerini karşılayan bir Gama-Delta T hücreli ilaç ürünü üretti. T hücre popülasyonu zenginleştiren pathonlar ürünün genişlemesini ve özelliklerini etkiler. Zenginleştirme sürecini başlatmadan önce, zenginleştirme yöntemlerinin yeterince değerlendirilmesi ve araştırılması gerekmektedir.