Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Yöntemimiz, hamile ve hamile olmayan hayvanların rahim dokusunda bulunan farklı lenfosit alt nüfuslarının bileşiminin ve fonksiyonel özelliklerinin değerlendirilmesini sağlar. Bu protokol, proteinin yüzey ekspresyonunun, hücre canlılığının ve işlevselliğinin korunmasını sağlarken uterus lenfositlerinin izolasyonu için izin verir. Bu nedenle, sonraki uygulamalar için uygundur.

Deneyin başındaki fetüs çıkarma ve lökosit toplama teknik olarak zorlu adımlardır. Uzun bir deney olduğundan, antikor boyama adımlarına ulaştığınızda özellikle dikkat ve odaklanmaya ihtiyaç vardır. Başlamak için, hamile bir C57 siyah altı dişi fareden elde edilen rahim dokusunu steril bir petri kabına aktarın, daha sonra steril aletler kullanarak dokuyu çevreleyen yağı hafifçe çıkarın ve dokunun kurumasına izin vermemeye dikkat edin.

Her implantasyon bölgesini steril aletlerle parçalayarak fetüsleri çıkarın, ardından uterusun bir mililitre toplama ortamı içeren orijinal beş mililitrelik toplama tüpüne geri dönün. Makas kullanarak, toplama tüpündeki dokuyu kıyma, ardından tüpü 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra tüpe önceden ısıtılmış üç mililitre önceden ısıtılmış enzymatic sindirim karışımı ekleyin.

Enzimatik sindirim aktivitesini geliştirmek için tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Kuluçka tamamlandıktan sonra, tüpü girdaplayın ve enzymatic aktiviteyi inhibe etmek için buzda tutun, ardından sindirim dokusunu düzgün etiketlenmiş 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Kalan tüm dokuyu toplamak ve 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarmak için beş mililitrelik toplama tüpünü toplam 10 mililitre buz soğuğu beş milimolar EDTA PBS çözeltisi ile durulayın.

Sindirilen doku örneğini 400 kez 10 dakika santrifüjleyin G.Süpernatantı atın, peleti hafifçe hareket ettirin ve daha sonra önceden ısıtılmış beş milimoler EDTA PBS çözeltisinin 10 mililitresinde yeniden dürttü. Hücre topaklanmasını azaltmak için, numuneyi ajitasyonla 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından 10 saniye boyunca yüksekte girdaplayın. İlişkisiz dokudaki hücre kümelerini çıkarmak için, steril 50 mililitre santrifüj tüpünün üzerine 70 mikrometrelik bir süzgeç yerleştirin, ardından steril bir mililitre şırınganın pistonunu kullanarak sindirilen dokuyu süzgeçten geçirerek tüpe zorlayın.

Tüm hücreleri toplamak için süzgeci toplam 10 mililitre soğuk PBS ile birkaç kez yıkayın, daha sonra 50 mililitre santrifüj tüpünü 400 kez 10 dakika boyunca harcayın G.Süpernatantı attıktan sonra, doğuştan gelen lenfoid hücreler A seçeneği veya B seçeneği kullanılarak izole edilebilir.A seçeneği için, peleti bir pipet voy kullanarak çağrı başına% 80 izotonik beş mililitrede yeniden depolayın. Daha sonra pipet voy'u yavaş hızda kullanarak, 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde yeniden dürtilen peletin üzerine çağrı çözeltisi başına% 40 olmak üzere sekiz mililitreyi dikkatlice kaplayın. Pipet yavaşça ve sürekli olarak, 15 mililitreyi yaklaşık 45 derecelik bir açıyla tutar.

Kaplamayı bozmadan, tüpü orta hızlanma ve oda sıcaklığında minimum molalarla 850 kat G'de 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, çağrı başına katmanları rahatsız etmeden tüpü santrifüjden dikkatlice çıkarın. Daha sonra, çağrı başına iki çözeltinin arayonundaki lökosit halkasını bozmadan, çağrı katmanı başına üst kısmın 0,5 ila bir mililitresi hariç hepsini atmak için steril bir pastör pipet kullanın.

Pipete emilen çağrı başına çözelti miktarını minimumda tutmaya çalışırken, lökosit halkasını dikkatlice toplayın ve hücreleri yeni etiketli 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelere% 10 ısı ve aktif FBS ile desteklenmiş 10 mililitre steril RPMI ortamı ekleyin, ardından hücreleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatant atın ve kırmızı kan hücresi lizizine devam edin.

B seçeneğini kullanarak hücreleri izole etmek için, sindirilen dokuyu hücre süzgecinden geçirdikten ve sonucu daha önce gösterildiği gibi hücre süspansiyonunda santrifüjledikten sonra, peleni çağrı başına sekiz mililitre % 35 izotonik ve RPMI ortamı ile yeniden biriktirin ve hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü orta hızlanma ve minimum molalarla oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 940 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra bir aspiratör veya pipet voy kullanarak, peleti% 10 ısı ve aktif FBS ile desteklenmiş 14 mililitre RPMI ortamında yeniden canlandırmadan önce süpernatantı dikkatlice epire edin.

Örneği 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin, ardından aspirasyonla süpernatantı atın ve kırmızı kan hücresi lizizine ilerleyin. Kırmızı kan hücrelerini iz bırakmak için, numuneyi bir X kırmızı kan hücresi liz çözeltisinin üç mililitresinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yayalım, ardından reaksiyonu durdurmak için numuneye 10 mililitre PBS ekleyin. Süpernatantı attıktan sonra tüpü beş dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin, 10 mililitre pbs daha ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın.

Peleti% 10 ısı inaktive FBS ile desteklenmiş bir mililitre RPMI ortamında yeniden kaydedin, ardından hücre süspansiyonunu steril bir 70 mikrometre hücre süzgecinden geçirin. Hücreleri saydıktan sonra hücre süspansiyonunun konsantrasyonu 100 mikrolitre PBS'de bir ila 2 milyon hücreye ayarlanır ve lekeleme ve faks analizine devam eder. Uterus grubu bir LC'ler geleneksel NK hücrelerini, doku yerleşik NK hücrelerini ve yaşam ve hamilelik sırasında değişen yüzdeleriyle grup bir LC'leri içerir.

Bu alt kümeler, akış sitometrisi kullanılarak, önce hücreleri ışığı dağıtma yeteneklerine göre gating, daha sonra tek satın alınabilir CD 45 pozitif CD üç negatif CD 19 negatif hücreyi yalıtarak ve ardından NK 1.1 ve NKP 46 pozitif olan birinci grup IC'leri tanımlayarak ayırt edilebilir. Grup bir IRC'lerde, CD49A negatif EM'ler pozitif geleneksel NK hücreleridir. CD49A pozitif Ems pozitif hücreler doku yerleşik NK hücreleridir.

Ve CD49 pozitif Ems negatif hücreleri grup bir rahim ICC'leridir. Dalak ve rahim lenfositlerinin anti NK P46 ve anti NK 1.1 antikorları ile lekelenmesi, dalak lenfositlerinin yüzeylerinde uterus meslektaşlarından daha yüksek miktarda NKP 46 ifade ettiğini göstermektedir. Enzimmatik doku ayrışmasında, sindirim ortamında kullanılan enzimlere bağlı olarak yüzey epitopları değiştirilebilir.

Örneğin, liberaz TM kullanıldığında MHC CD49 NKG2A reseptörü için boyama zayıftır. Ancak liberaz DH ile sindirim, 1611 antikor klonu tarafından NKG2A tanımayı korur. Gebelik günü 8.5'te rahim dokusu örneklerinde bulunan birinci grup IC'lerin yaklaşık %6.5'i kan türemiştir.

Kan kirleticiler, florokrom ile konjuge edilen anti CD45 antikorları ile intravital lekeleme yoluyla dışlanabilir. Zaman toplantıları için ayarlarken, farelerin gece olduğunu göz önünde bulundurmalısınız. Bu nedenle, gece boyunca çiftleşme meydana geldiğinden öğleden sonra mümkün olduğunca geç kurulmalıdırlar.

Ayrıca dişileri seçerken, vajinal septuma sahip olmadıklarına emin olmalısınız. Hücrelerin dışındaki ve içindeki birçok proteine bakmak için tipik olarak akış sitometrisi analizi yaparız. Ayrıca RNA dizilimi de dahil olmak üzere gen ekspresyonını incelemek için nükleik asit ekstraksiyonu yapıyoruz.

Ayrıca rahim doğuştan gelen lenfoid hücrelerin yanıtlarını incelemek için fonksiyonel tahlilleri de yapıyoruz.