C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi
2 Eylül 2021
Bu protokol, C. elegans amyotrofik lateral skleroz modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki hassas tahlil, C. elegans suşları için genel yarar ile değiştirilmiş hareketlilik ile açıklanmaktadır.
Protokolümüz C.elegans hareketini ölçen iki tahlil sunuyor. Bu yöntemler, Amyotrofik Lateral Skleroz veya ALS modelleri tarafından sergilenenler gibi hareketlilik fenotiplerini değerlendirir. Radyal Locomotion Testi, katı bir yüzeyde gezinmeyi tespit etmek için uygun maliyetli ve kolay bir yöntemdir.
Yüzme Tahlilleri, sıvıdaki kırbaçlama hareketlerinin tarafsız tespiti için bilgisayar tabanlı izleme kullanır. Bu yöntemler C.elegans hareket farklılıklarını ölçmek için yararlıdır. ALS'yi incelememize rağmen, değiştirilmiş hareketlilik ile herhangi bir suş için kullanılabilirler.
NGM test plakalarını ters çevirin. Ve c.elegans suşlarının tahlil edilmesi için alt kısmı bir tanımlayıcı ile etiketle. Baş aşağı plakanın ortasındaki işaretleyici ile küçük bir nokta yapın.
Bir diseksiyon mikroskobu ile çalışırken, solucanları test plakasının ortasına aktarın. Ve 30 dakikalığına bir zamanlayıcı ayarlayın. Kapağı tekrar tabağa koyun ve bir kenara koyun.
Tüm suşlar belirlenen test plakalarına gelene kadar solucanları aktarmaya devam edin. 30 dakika sonra, kapağı çıkararak ve plakayı kesme mikroskobu altında yüzüstü yerleştirerek ilk plakayı puanlamaya başlayın. Tüm solucanlar Auger'dan görünene kadar mikroskop odağını ayarlayın.
Orta noktadan farklı bir renkli keçeli uç kalem kullanarak, her solucanın konumuna küçük bir nokta koyun. Bazı solucanlar oraya varabileceğinden plakanın kenarını kontrol edin. Ayrıca, merkez noktadan kaç solucanın hareket etmediğini sayın ve kaydedin.
Her solucan için merkez noktasından son konum işaretlerine olan mesafeyi ölçün ve bir cetvel kullanarak mesafeyi kaydedin. İlk solucan noktası bir çizgi ile işaretlenir. Plakayı saat yönünde döndürerek her nokta için ardışık olarak uzunluk verilerini kaydedin.
Videoları ayarlamak ve kaydetmek için ilişkili yazılımı açın. Video yakalama simgesine tıklayın. Dimmer düğmesine bastırın ve ışığı ayarlamak için saat yönünde çevirin.
Video yakalama penceresinde, ayarlar sekmesine tıklayın ve video modunu 2456x2052_Mono8, kare hızı 14'e, tek renkli olarak çıkışa ayarlayın. 0.00300 saniye pozlama. Kazanç 1 dB'ye.
Gama bire. Ve 180'e dön. Yakalama sekmesine geri dönün, kayıt klasörünü seçin ve dosya öneki metin kutusuna girerek bir dosya adı atayın.
Arabellek gibi diğer yakalama ayarlarını 128 kareye ve süreyi bir dakikaya ayarlayın. Test plakasını cihaz sahnesine yerleştirin ve video yakalama ekranına ortalayın, ardından kapağı çıkarın. 1 ml M9'da yaklaşık 50 solucanı test plakasına yıkamak için bir mikropipette kullanın.
Hayvanları merkeze getirmek için plakayı hafifçe döndürün veya hayvanları ayırmak için birkaç damla M9 eklemek için bir mikropipette kullanın. Solucanların yüzmeye alışmasına izin vermek için 60 saniye boyunca bir zamanlayıcı ayarlayın. Işık düğmesini, ekranın mümkün olduğunca parlak olacak şekilde aşırı pozlamadan ayarlayın.
Ekranı izlerken odaklama halkasını kameranın lens gövdesine çevirerek kamera odağını manuel olarak ayarlayın. 60 saniye sonra kayıt düğmesine basın, görüntü sırasını içe aktar" iş akışı menüsünden ilk düğmeyi seçin ve bir videoyu bulup çift tıklayın. İş akışı menüsünden Sıra Bilgilerini Ayarla'yı seçin"Yeni menü penceresinde adlandırma düzenini denetleyin, notlar ekleyin ve meta verileri doğrulayın.
Görüntüyü Ayarla"yı seçtiğinizde Görüntü Ayarlamaları" adlı yeni bir açılır menü açılır. Arka plan yumuşatmayı 10, Gauss yumuşatmayı beşe, Delikleri ikiye, Küçük nesne filtresini sıfıra doldurarak ve İntegral Türev Segmentasyonunu atlayarak görüntü işleme ayarlarını yapın. Eşik seviyesini, hayvanların tamamen yeşille doldurulması, ancak yine de arka plandan farklı olması için ayarlayın.
Ardından Uygula'yı tıklatın"İş akışı menüsünden Algıla ve İzle'yi seçin"üç ila yedi solucan seçin ve algılama sekmesinde solucanları algıla"düğmesini tıklatın. İzleme sekmesine gidin. İzleme parametrelerinde Geri İzlemeYi Kullan"ı işaretleyin ve görüntünün kenarındaki solucanları izleme seçeneğinin işaretini kaldırın.
Maksimum izlenen hipotezi beşe ayarla. İzleme modunu yüzmeye ayarlayın. Gelişmiş ayarlar bölümüne gidin ve solucanların sınıra dokunabileceği çerçeveleri 50 olarak ayarlayın.
Çerçeve solucanları 500'e kadar çakıtabilir. Pozisyon toleransı 0,50'ye. Ve şekil toleransı 0.50'ye.
Bu ayarları kaydedin ve yapılandırma olarak kaydederek bir denemedeki tüm videolar için dağıtın. Sol üst simge menüsünde yapılandırma yöneticisine gidin ve Kaydet" simgesini tıklatın. Bu yapılandırmaya bir ad ve açıklama verin.
Ve Tamam'ı tıklatın"İş akışı menüsünde Projeyi Kaydet"İş akışı menüsüne gidip Toplu İşlem"i tıklatarak videoları izleyin'e tıklayın. Bu toplu işleme menüsünün dosya seçimi bölümünün altındaki Ekle düğmesini tıklatın. işlenecek tüm proje dosyalarına gidin ve seçin.
Ardından Aç"Başlat'a tıklayın" düğmesine tıklayın ve ilk dosyadaki yeşil ilerleme göstergesine dikkat edin. Tüm dosyaların işlenmesine izin verin. Okunan tüm dosyalar tamamlandığında, yazılımı kapatın.
Verileri Çözümle"parça özetine gidin. Ve verileri elektronik tablo okunabilir bir biçimde dışa aktarmak için sağ alttaki Dışa Aktar düğmesini kullanın. Forma sayfalama işlevlerini kullanarak her parça için dakika başına dönüşleri hesaplamak için Dönüş Sayısı"nı ve İzleme Süresini"ni kullanın.
Beş farklı türün gelişimsel olarak sahnelenmiş L4 larvalarının uyarılmamış dağılımı Radyal Locomotion Testi kullanılarak ölçüldü. Ve dakikada mikro metre olarak grafiklendi. Çubuk grafikler olarak görüntülenen veriler, gerinimler arasındaki göreli farkları daha net hale getirir.
Grafik içinde çizilen her solucanın son yer değiştirmesi, popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Sıvıdaki daralma veya dalgalanma sıklığı açısından yüzme oranları, tarafsız bilgisayar destekli puanlama ve analiz kullanılarak ölçüldü. Ve dakikada kırbaç olarak grafiklendi.
Çubuk grafik verileri, suşlar arasındaki göreli farklılıkların görülmesini kolaylaştırır. Puanlanan her bir solucandan elde edilen veriler grafik içinde çizilirken, popülasyon içindeki varyasyonun daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Radyal Locomotion Tahlilinde hafif TDP-43 suşu vahşi tip N2 suşundan önemli ölçüde farklı değildi.
Bununla birlikte, Yüzme Testinde, hem hafif hem de güçlü TDP-43 suşları sadece vahşi tip N2'den değil, aynı zamanda bir birinden de önemli ölçüde farklıydı. ALS mutant TDP-43 suşu Radyal Locomotion tarafından ciddi emekleme bozukluğuna sahiptir ve sıvıda çırpınmaz. Tau-ekspresyon suşunun Radyal Locomotion'da ciddi bozuklukları vardır, ancak Yüzme Testi'nde kırbaçlanabilir.
Bu yöntemlerle göz önünde bulundurulacak en önemli husus, çoğaltmalar arasında tutarlı denetimler sağlamaktır. Bu, hareketlilikteki değişimlerin çevresel koşullardan değil fenotipik farklılıklardan kaynaklanmalarını sağlar. Bu yöntemler, iki büyük C.elegans hareketlilik paradigmasının kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.
Takip yöntemleri ek davranışsal karakterizasyon, biyokimyasal analiz veya kas veya nöron fonksiyonunun araştırılması içerebilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, farklı suşlar arasındaki hareketlilik farklarını ele alarak, amiyotrofik lateral skleroz (ALS) C. elegans modellerinde motor bozulmayı değerlendirmek için tasarlanmış iki testi sunmaktadır. Testler, her ikisi de hareketliliği değişmiş C. elegans hareket özelliklerine dair bilgiler sağlayan bir Radyal Lokomosyon Testi ve bir Yüzme Testi'ni içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal analizler
- Model organizmalar
Arka Plan
- Motor bozukluk, ALS'de önemli bir semptomdur.
- C. elegans, motilite ve nöromüsküler fonksiyonların incelenmesi için yararlı bir modeldir.
- Hareket farklılıklarının değerlendirilmesi, motor bozukluğun şiddetini ayırt etmeye yardımcı olabilir.
- Deneyler, çeşitli C. elegans suşlarında lokomosyonun kantitatif ölçümlerini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Motor bozukluk şiddetini sınıflandırmak için hassas analizler geliştirmek.
- Bir ALS modelindeki lokomosyon fenotiplerini incelemek.
- Motor farklılıkları olan herhangi bir C. elegans suşu için uygulanabilir metodolojiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yöntemler arasında Radyal Lokomosyon Analizi ve bir Yüzme Analizi yer almaktadır.
- Biyolojik model olarak C. elegans kullanılmaktadır.
- Her iki analiz de kontrollü koşullar altında hareketin kantitatif olarak puanlanmasını içerir.
- Kritik prosedürler arasında aklimatizasyon süreleri ve hareket verilerini kaydetmek için hassas ölçüm teknikleri bulunmaktadır.
- Lokomosyonun takibi ve analizi için bilgisayar yazılımı kullanılmaktadır.
Temel Sonuçlar
- Deneyler, C. elegans suşları arasındaki hareket paternlerinin ayırt edilmesini sağlar.
- Veriler, lokomosyondaki varyasyonları vurgulayarak suşa özgü önemli fenotipleri ortaya çıkarmaktadır.
- Çırpınma frekansı gibi ölçümlerden çıkarılan sonuçlar, temel fizyolojik farklılıklara dair bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Çalışma, C. elegans kullanılarak ALS modellerinde motor bozukluğun değerlendirilmesi için etkili metodolojileri ortaya koymaktadır.
- Söz konusu analizler, nöromüsküler fonksiyonların ve hastalık mekanizmalarının anlaşılmasını kolaylaştırır.
- Bulgular, motor bozukluk ve terapötik müdahaleler üzerine yapılacak gelecekteki çalışmalara ışık tutabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Uygunluk
C. elegans ALS modellerinde motor bozukluğun kantitatif değerlendirmesi, nöromüsküler hedeflerin ve yolakların erken aşamada riskten arındırılmasını sağlar. Bu doğrulanmış lokomosyon analizleri, fonksiyonel fenotipleme ve müdahale taramaları için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir son noktalar sunar. Bu tür analizlerin entegrasyonu, hastalıkla ilgili model sistemlerdeki öngörü güvenini artırır ve keşif ile preklinik araştırmalar arasındaki translasyonel sürekliliği destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- ALS ile ilişkili genetik varyantların yönetilebilir bir in vivo sistemde fonksiyonel sorgulanmasını sağlar.
- Belirli moleküler perturbasyonlarla bağlantılı motor fenotipleri ayırt ederek mekanistik risk azaltımını destekler.
- Hedef önceliklendirmesi için kantitatif son noktalar sağlayarak portföy elemesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Yüksek kapasiteli bileşik veya genetik taramalar için uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir mobilite analizleri sunar.
- Suşlar ve müdahaleler arasında güçlü karşılaştırmalar yapmak için kantitatif lokomosyon metrikleri oluşturur.
- Analiz platformunun çeşitli nöromüsküler ve nörodejeneratif hastalık modelleri için yeniden kullanımına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Fenotipik çıktıları hastalıkla ilişkili motor bozukluklarla ilişkilendirerek translasyonel biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
- Genetik keşiften, terapötik hipotezlerin preklinik doğrulanmasına kadar süreklilik sağlar.
- Hedef dışı veya kompanzatuar etkilerin in vivo erken tespitine olanak tanıyarak biyolojik riski azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu motilite analizleri; hedef doğrulaması, öncü bileşik belirleme ve nöromusküler bozukluklar için translasyonel araştırmalar arasında köprü kurarak, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürecin içerisinde yer almaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Kantitatif motor fenotipleme yoluyla hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Bileşik ve genetik modifikatör değerlendirmeleri için tekrarlanabilir, ölçeklenebilir uç noktalar sunar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırma için objektif lokomosyon metrikleri ve istatistiksel çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: In vivo fenotipleri, hastalıkla ilgili fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli motilite ve nörodejenerasyon çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöromüsküler hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Motilite değerlendirmesini standartlaştırarak ekipler arası tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Go/no-go (devam/dur) kararlarına veri sağlar ve erken aşama programların riskini azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Nöromüsküler hastalık varlıklarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- C. elegans yönetimi ve davranışsal fenotiplendirme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Görüntüleme cihazlarına ve bilgisayar tabanlı takip yazılımına erişim gereklidir.
- Deney koşullarının ve kontrollerin ekipler arası sıkı bir şekilde standardize edilmesini gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile çeşitli genetik arka planlara ve hareketlilik fenotiplerine uyarlanabilir.
- Karıştırıcı değişkenliği minimize etmek için tutarlı çevresel koşullara bağlıdır.
