Protein Düşük Yatan Konformasyon durumlarını tespit etmek için Yüksek Basınçlı NMR Deneyleri

Yüksek basınç, bir protein konformasyon örneğinin göreli popülasyonunu değiştirmek için tercih edilmesi olan yöntemdir. Yüksek enerjili konformasyon durumlarını izole etmek ve karakterize etmek için son derece yararlıdır. pH veya sıcaklık gibi tüm pertürbasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, basınç pertürbasyonunun uygulanması kolaydır ve tamamen tersine çevrilebilir.

Ayrıca, öncelikle cam boşlukları veya boşluk hacimleri olan bölgeleri etkileyen yerel bir pertürbasyondur. Başlamak için, azot-15 etiketli numuneyi bir cam pipet kullanarak zirkonya tüpüne sokun ve tüpün altındaki numune koltuklarını sağlayın. Numunenin iletim sıvısı ile karışmasını önlemek için, numuneyi 200 mikrolitre mineral yağ ile kaplayın ve ardından tüpün geri kalanını iletim sıvısı ile doldurun.

Zirkonya tüpünün üzerine tek kullanımlık bir O-halka koyun ve tüpü tabana kaydırın. Daha sonra tüpü yüksek basınçlı bağlama hattına bağlayın ve tabanı elle hücreye sıkın. Daha sonra daha düşük basınçta sızıntıları önlemek için 14,7 newton metre tork uygulayın.

Basınç hücresi tertibatının bütünlüğünü kontrol etmek için, hücre desteği ve muhafaza kabı kullanarak tüpü spektrometrenin dışında 300 bara kadar basınçlandırın. 15 dakika sonra basıncı bir çıla sıfırlayın ve temiz tüy bırakmayan bir mendille sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Basınçsız tüpü, bağlama hattını dikkatlice yönlendirerek spektrometreye yerleştirin.

Tüp örnek oturma konumuna ulaşana kadar tüpü spektrometreye kaydırın. Protium ve nitrojen kanallarını kilitleyin, dolgu yapın, eşleştirin ve ayarlayın ve optimize edilmiş dolguları geleceğe sakla. Hetero tek kuantum tutarlı spektroskopi ile enine gevşeme optimize spektroskopisi kurun ve atmosferik koşullarda bir referans deneyi kaydetmeye devam edin.

Her 500 çubuk için bir çubuktan 2,5 kilobara kadar bir dizi 2D deneme kaydedin. Kesin katlama veya açılma oranları biliniyorsa, her 500 bar'in artışından sonra, numunenin 15 ila 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Katlama veya açılma geçişinin çekim noktası ulaştığında, sığdırma hassasiyetini artırmak için ek denemeler kaydedin.

Bu protokol, ikinci RNA tanıma motifi heterojen nükleer ribonükleoprotein A1 olan RRM2'nin basınç bağımlılığını araştırmak için kullanılmıştır. Hetero tek kuantum tutarlılık spektroskopisi spektroskopisi ile enine gevşeme optimize spektroskopisi bir çubukta, 1,5 kilobar, iki kilobar ve 2,5 kilobars'ta toplandı. RRM2, 2,5 kilobar aralığında neredeyse tamamen açılmış. Bireysel basınç yoğunluğu profilleri, ortaya çıkan reaksiyonla ilişkili standart Gibbs serbest enerji ve hacmindeki ilgili değişiklikleri elde etmek için burada gösterilen denkleme göre monte edildi.

Etki alanı yapısında eşlendiğinde, en büyük hacim değişikliği büyüklüğüne sahip kalıntılar etki alanı yapısal çekirdeğinde bulunurken, en küçük hacim değişikliği büyüklüğüne sahip olanlar esas olarak beta iplikçikleri ile beta iplikçikleri arasındaki bağlantı döngülerinde C terminali sarmalına yerleştirilmiştir. Katlanmış durum topluluğunun sıkıştırılabilirlik ve konformasyonsal heterojenlik derecesini araştırmak için protium kimyasal kaymaları analiz edildi. Protium kimyasal kaymalarının bir basınç fonksiyonu olarak bireysel profilleri, meksağa özgü doğrusal ve doğrusal olmayan katsayıları çıkarmak için gösterilen denklem kullanılarak monte edilmiştir.

En büyük doğrusal olmayan katsayılara sahip kalıntılar çoğunlukla etki alanının yapısal çekirdeğinde bulunurken, en küçük doğrusal olmayan katsayılara sahip kalıntılar çoğunlukla farklı yapısal motifleri birbirine bağlayan döngüler içinde yer aldı. Sızıntıları önlemek için tüpü doğru bir basınç seti olarak kurmak önemlidir. Eğer bir sızıntı olursa, mineral yağ izlerini temizlemek için sondanın muhtemelen çıkarılması gerekir.