Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme
November 20th, 2021
Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.
Beyin damarı, nüfuz eden arteriyeller, kılcal damarlar ve yükselen venülelerden oluşan karmaşık bir ağdır. Bu damarlar, alfa düz kas aktini ifade eden ensheathing perisitleri gibi duvar hücreleri tarafından kaplanır ve nüfuz eden arteriyellerden ilk dört dalda bulunur. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi RCaMP'nin ifadesiyle bu hücrelerdeki kalsiyum geçicilerini görselleştirmek için Acta2-RCaMP 1.07 transgenik fareler kullanıyoruz.
Kalsiyum bu hücrelerin kasılmasında ve kan akışı kontrolünde güçlü bir rol oynar. Kılcal perisitler vasküler ağda daha aşağı akışta bulunur ve diğer transgenik modellerde etiketlenebilir. Ancak, bu yöntemde perisitleri ısıtmaya odaklanıyoruz.
Farelerimize cerrahi olarak görüntüleme için beyin damarlarına erişime izin veren kronik bir kraniyal pencere yerleştirildi. Burada, anestezi yapılan hayvanlarda perisit kalsiyum verileri ve kan akışı hakkında bilgi edinmek için gereken iki foton görüntüleme ve analitik yöntemin ardından gerekli hazırlık adımlarını ve kuyruk damarı enjeksiyonlarını özetliyoruz. Kuyruk damarı kateter enjeksiyonu için aşağıdaki öğeler gereklidir:insülin şırıngaları, 15 santimetrelik pe10 boru parçası, 30 gauge iğne, gazlı bez, salin, forseps, yeşil floresan dektran boyası, pense ve makas.
Ayrıca kan akışı ölçümleri için izoflurandan daha iyi olduğu için görüntülemeden önce enjekte edeceğimiz ketamin Xylazine anestezili bir iğnemiz var. Penseyi kullanarak, göbekten 30 kalibrelik bir iğne kırın. İğneyi, salin dolu bir şırıngaya bağlı PE10 boru parçasının ucuna dikkatlice yerleştirin.
Bu enjeksiyon için kateter. Bir fareyi izofluran ile uyuşturmak ve I-Lube jeli uygulamak. Yanal damarı genişletmek için kuyruğuna ılık su ile bir eldiven alanı yerleştirin.
Kuyruğu etanol ile temizledikten sonra, iğneyi damara yerleştirin ve iğnenin doğru yerleştirildiğinden emin olmak için kateterden hafifçe salin enjekte edin. Kateterdeki şırınnayı floresan dektran boyası ile dolu bir şırınna için değiştirin. Tüpe kabarcık girmemesini sağlamak için boyayı yavaşça enjekte edin.
Dektran şırındını salin şırınd ile değiştirin ve tüpte boya kalana kadar boruyu durulayın. İğneyi çıkarın ve gazlı bezle bastırın. Görüntüleme için ketamin Xylazine anestezisi enjekte edin.
Fare kafası bir ısıtma yastığına sabitlenmişken, kranial pencereyi diş aplikatörleriyle temizleyin. Pencereye ultrason jeli uygulayın ve iki foton mikroskobu hedefine odaklanın. İki foton görüntüleme için, emisyon tespiti için floresanlar, heyecan verici ve fotomultiplier tüpler için ayarlanabilir titanyum Safir lazerli bir mikroskop kullanıyoruz.
Mikroskop yazılımında, dalga boylarını hem RCaMP hem de floresan dektranı heyecanlandırmak için 990 nanometreye ayarlayın. Daha sonra pockel hücre voltajını ve PMT dedektörü hassasiyetini ayarlayarak lazer gücünü ayarlayın. Bu parametreler ve daha yüksek çözünürlük ile canlı tarama, RCaMP pozitif duvar hücreleri ve floresan etiketli kan plazması görülebilir.
Vasküler ağdaki perisitleri düzgün bir şekilde bulmak için bir derinlik yığınının alınması önerilir. PO damarlarının yakınındaki dokunun üstüne odaklandığınızda, bunu Zed serisi yığınının sıfır noktası ve üst noktası olarak ayarlayın, ardından dokuda istenen derinliğe odaklanın ve bunu yığının altı olarak ayarlayın. Mikroskop yığının daha derinlerine doğru ilerlerken lazer gücü artacak şekilde ayarlanmalıdır.
Görüntü işleme yazılımında Zed serisini açmak, iki kanalı renkli görüntüler olarak birleştirin ve ilgi çekici perisitler ve kan damarları için yığında tarayın. Perisit içeren ilgi çekici bölgeleri seçin ve gelecekteki görüntüleme oturumlarında bu noktaları yeniden bulmada yardımcı olacak pozisyonları kaydedin. Bir perisit kalsiyum olayını toplamak ve taşımak için, alım kare hızını saniyede 10 kareden fazlasına çıkarın.
Görüntüleme süresini 60 saniye olarak ayarlayın ve kaydetme yolunu benzersiz bir dosya adıyla güncelleştirin. Daha düşük çözünürlüğü hesaba katmak ve perisit hakkında daha yakından bir görünüm elde etmek için gemiye optik olarak yakınlaştırın. T serisini alın.
Kan damarı çapını ve kırmızı kan hücresi hızını ölçmek için, mikroskopla tek boyutlu tarama başlatmak için hat taramasını seçin. İlk olarak tarama süresini milisaniye olarak ayarlayın. Daha sonra ilgi çekici damarı ikiye bölen ve gemi boyunca paralel hareket eden bir çizgi çizin.
Bu, soldaki damar çapının ve sağdaki damardan hareket eden kırmızı kan hücrelerinin çizgilerinin bir kimografını oluşturacaktır. Bu iletişim kuralında kullanılan programların ve paketlerin tam listesi için malzeme tablosuna bakın. Öncelikle görüntü işleme yazılımında elle ilgi çekici bölgeleri seçin.
T serisi dosyasını yükleyin, yığının ortalamasını alın ve renkli bir görüntü yapın. Çokgen aracını seçin ve soma ve prosesler gibi görünür ensheathing perisit yapılarını özetler. İlgilendiğiniz her bölgeye benzersiz bir ad verin ve bunları daha sonra programlama yazılımına yüklenebilen bir zip klasörü olarak kaydedin.
Programlama yazılımını açın ve görüntü işleme paketlerinin klasörlerinin yolda olduğundan emin olun. Kalsiyum T serisini programlama yazılımına içe aktarın ve her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Bu durumda, kanal 1'de hücresel bir sinyal ve ikinci kanalda kan plazmasıdır.
Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için verileri programlama yazılımı içinde bir film olarak çizin. Kırmızı RCaMP kanalına kanayan floresan dektrandan yeşil floresanları çıkarmak için görüntü işleme paketindeki kanalların karıştırın. İlk olarak, bu durumda yalnızca florofor 1, RCaMP içeren bir bölge seçin.
İkincisi, plazmada sadece florofor 2, floresan içeren bir bölge seçin. Son olarak, floroforu olmayan bir arka plan alanı seçin. Bu, her kanaldaki her piksele uygulanan bir spektral katkı matrisi oluşturur.
Bu yapılardaki kalsiyum olaylarının tespitini artıracak RCaMP sinyalinin lokalizasyonunu önemli ölçüde geliştirir. Kalsiyum görüntüleme verilerinin görüntü işleme paketleri içinde analiz edilebilmesinin birden fazla yolu vardır. İlk olarak, karıştırılmamış kalsiyum filminde hücresel sinyal analizini çalıştırın ve ilgi çekici bölgeleri perisitlerden seçilen zip klasöründen daha önce elle yükleyin.
Bölgelerin yeniden boyutlandırılması gerekmediğinden ölçek faktörünü bire ayarlayın. İşlemden sonra, her ROY'un çizimlerini ve normalleştirilmiş kalsiyum izlerini farklı renklerde oluşturun. Kod, tek tek izlemelerdeki kalsiyum olaylarının çoğunu algılamazsa, kısa geçiş filtrelenmiş verilerin eşiğini T serisinin ilk 30 karesi olan temel dönemin standart sapmasının üç katına düşürme gibi iyileştirme kutusundaki yerleşik parametreleri değiştirin.
Sinyalleri tespit etmek ve sınıflandırmak için, normalleştirilmiş kalsiyum izi uzun geçişli ve bant geçişi filtrelenir, bu da genlik ve tahminler için verileri yumuşatmaya yardımcı olur, aynı zamanda sinyallerin tek tepeler, çoklu tepeler veya platolar olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur. Daha fazla istatistiksel analiz için verileri CSV dosyası olarak çıktısını verin. Hücresel sinyal analizini karıştırılmamış kalsiyum filminde ikinci kez çalıştırın ve X, Y ve zaman olmak üzere üç boyutta floresanlardaki aktiviteye ve değişime göre otomatik ilgi alanı tanımlama bölgesini seçin.
Belirlenen ilgi alanlarını görüntülemek için işlem sonuçlarını çizin farklı renklerdir. Algoritma filmde gözle açıkça görülebilen ROY'leri algılamazsa, verileri zamanında yumuşatan Gauss filtresini artırmak ve ROY'leri bulma eşiğini taban çizgisinin standart sapmasının üç katına çıkarmak gibi yerleşik parametreleri değiştirin. Daha fazla görselleştirme için ROY'leri bir film olarak çizin.
Daha fazla istatistiksel analiz için verileri CSV dosyası olarak çıktısını verin. Hat tarama kimograf veri dosyasını programlama yazılımına içe aktarın ve her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Kimografideki çapa karşılık gelen alanı seçmek için bir kutu açan hat taramasında çap analizi işlevini çalıştırın.
Kimograf floresanlarının sınırlarının dışına, damar çapına karşılık gelen bir kutu çizin. Gemi çapı için tam genişliği yarı maksima cinsinden ölçmek ve bir arsa oluşturmak için bu veri sınıfını işleyin. Daha sonra dönüşüm analizinde hız oranını çalıştırın ve kimograf floresanlarının sınırına bir kutu çizin.
Kırmızı kan hücrelerinin hızını, akısını ve doğrusal yoğunluğunu hesaplamak için bu veri sınıfını işleyin. Daha fazla analiz için kan akışı sonuçlarını bir CSV dosyası olarak çıktı. Hücresel yapıların elle seçilmesi, normalleştirilmiş kalsiyum izleri düşük geçiş ve bant geçişi filtrelendikten sonra, tek tepeler ve çoklu zirveler gibi farklı sinyal zirveleri de dahil olmak üzere bu bölgelerdeki kalsiyum dalgalanmalarının tespit edilmesine izin verir.
Ayrıca, ilgi çekici bölgeler, görüntü işleme algoritmaları kullanılarak floresanların yoğunluğunun zaman içinde değiştiği etkin pikselleri gruplayarak tanımlanır. Bu, sinyalin beklenen boyutunu ve şeklini kapsayacak şekilde zaman, eşik ve uzamsal parametreleri ayarlayarak herhangi bir dinamik hücresel sinyale uygulanabilir. Sinyal tanımlama eşiğini azaltmak daha fazla ilgi alanı bulur.
Açık, hemodinamik kimograflar, ensheathing perisitlerinin yakınındaki kan damarlarında çap ve kırmızı kan hücresi hızını ölçmek için analiz edilir. Çap, floresanların maksimum yarısı kadar tam genişlikten hesaplanır. Kırmızı kan hücresi hızı, hızı hesaplamak için açının radon dönüşümüne girdiği etiketlenmemiş kırmızı kan hücrelerinden yapılan çizgilerden yaklaşık olarak elde edilir.
Floresan doygunluğun, düşük sinyal-gürültü oranının veya görüntüleme alanının hareketinin olduğu düşük kaliteli kimograflar, verilerin belirlenemeyeceği kırmızı haçlar olarak belirtilen hata noktalarıyla güvenilmez çizimler oluşturur. Elde edilen verilerin kalitesi iyi bir sonuç için kritik öneme sahiptir ve bu protokolde açıklanan adımları takip ederek iyi sonuçlar sağlar. Bu videoda, beyin ensheathing perisitlerinin kombine kalsiyum görüntüleme prosedürü ve iki foton mikroskopisi ile kan akışı ölçümleri özetlenmiştir.
Bu teknikler, beyin damar ağı içindeki duvar hücresi fizyolojisi ve lokalizasyonu ile ilgili soruları ele almak için yararlıdır, ancak beyindeki veya diğer organ sistemindeki herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini incelemek için uyarlanabilirler.
Genel Bakış
Bu protokol, anestezi altındaki farelerde beyin kapsayan perisitlerinden floresan kalsiyum görüntüleme verilerinin elde edilmesini ve analizini ve kan akışı ölçümlerini özetlemektedir. Görselleştirme için Acta2-RCaMP 1.07 transgenik fareleri kullanarak, araştırmacıların mural hücrelerdeki kalsiyum geçici değişikliklerini araştırmalarına olanak tanır. Açıklanan yöntemler, çeşitli hücre tiplerini ve fizyolojik rollerini incelemek için uyarlanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Fizyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Beyin vaskülatürü, mural hücreler tarafından çevrili arterler, kılcal damarlar ve venüllerden oluşur.
- Beyin kapsayan perisitleri alfa düz kas aktini eksprese eder ve kan akışının düzenlenmesinde rol oynar.
- Bu yöntem, bu mural hücrelerde ve ilişkili kan damarlarında kalsiyum dinamiklerinin görselleştirilmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Perisitleri olan kalsiyum geçici değişikliklerini görselleştirmek için detaylı bir metodoloji sağlamak.
- Beyin kan akışında perisitlerinin fizyolojik rollerinin incelenmesini sağlamak.
- Benzer çalışmalar için diğer hücre tiplerine uyarlanabilir bir protokol kurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Anestezi altındaki transgenik farelerde kalsiyum dinamiklerinin iki-fotonlu görüntüleme.
- Hazırlık, kronik bir kafa penceresi ve boya enjeksiyonu için kuyruk damarından kateterizasyon içerir.
- Veri elde etme, perisit aktivitelerini ve kan akışını gelişmiş görüntüleme teknikleri kullanarak ölçmeyi içerir.
Ana Sonuçlar
- Beyin kapsayan perisitleri boyunca kalsiyum olaylarının ve kan akış verilerinin başarılı görüntülemesinin elde edilmesi.
- Bir spektral katkı matrisi aracılığıyla RCaMP sinyallerinin geliştirilmiş lokalizasyonu veri doğruluğunu artırır.
- Metodoloji, vasküler tepkilerinin ve kalsiyum sinyalizasyonunun dinamik görselleştirilmesini destekler.
Sonuçlar
- Bu çalışma, mural hücrelerin fizyolojik rollerini anlamak için sağlam bir protokol göstermiştir.
- Görüntüleme teknikleri, kan akışının düzenlenmesiyle ilgili kalsiyum dinamikleri hakkında bilgiler sağlar.
- Uygulamaların, nöronal mekanizmalar, plastisite ve vasküler biyoloji alanlarındaki daha geniş uygulamalara uzanır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct measurement of intracellular calcium dynamics in brain pericytes, a key cell type in neurovascular coupling and blood flow regulation. By linking pericyte activity to hemodynamic outputs, it provides a mechanistic readout for target validation in CNS drug discovery. The approach supports de-risking of vascular targets by delivering quantitative, reproducible data on cellular signaling and vascular function in vivo.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring calcium transients in ensheathing pericytes, which regulate capillary blood flow.
- Operational Value: Enables functional validation of mural cell targets through correlation of calcium signaling with vessel diameter and red blood cell velocity.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking pericyte calcium events to hemodynamic outputs, informing mechanism-based compound screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing a reproducible window for chronic in vivo imaging.
- Quantitative Outputs: Generates calcium trace data and hemodynamic metrics (diameter, velocity) suitable for assay standardization and inter-laboratory comparison.
- Scalability: Supports platform reuse across studies by enabling region-of-interest mapping and automated signal detection via image processing algorithms.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects pericyte calcium dynamics to neurovascular dysfunction, a feature in neurodegenerative and ischemic disease models.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing a consistent readout of mural cell activity across experimental phases.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target modulation by correlating intracellular signaling with functional vascular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, offering a functional bridge between cellular signaling and tissue-level physiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by measuring calcium dynamics in pericytes, key regulators of cerebral blood flow.
- Screening: Delivers assay-ready outputs including normalized calcium traces and hemodynamic kymographs for compound effect evaluation.
- Analytics: Provides statistical-ready CSV outputs from unmixed signals, enabling quantitative comparison of calcium event frequency, amplitude, and kinetics.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by allowing longitudinal imaging of the same cranial window across timepoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform through standardized surgical preparation, dye injection, and image processing workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurovascular target modulation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tail vein catheterization, two-photon settings, and spectral unmixing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering functional target engagement data linked to hemodynamic readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on pericyte-mediated vascular responsiveness.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic mouse handling, cranial window surgery, and two-photon microscopy.
- Depends on tunable titanium sapphire laser systems, photomultiplier tubes, and image processing software for spectral unmixing and signal analysis.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia protocols (ketamine/xylazine) and dye injection procedures to minimize flow artifacts.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other cell types or organs, particularly in promoter selection and indicator compatibility.
- Includes practical limitations such as imaging depth constraints and signal bleed-through, which are addressed via spectral contribution matrix and background subtraction.
