Name: Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 22 s
Description: Öğrenin, Acta2-RCaMP 1.07 transgenik farelerde iki foton görüntüleme ile beyin perisit kalsiyum dinamiklerini ve kan akışını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, mural hücrelerin fizyolojik rollerini incelemek için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Meza, Mitacs ve Research Manitoba bursları tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma için kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri, Araştırma Manitoba, Manitoba Tıbbi Hizmet Vakfı, Kanada Beyin Araştırma Fonu aracılığıyla Manitoba Üniversitesi ve Brain Canada'dan başlangıç finansmanı, Health Canada ve Azrieli Vakfı'nın finansal desteğiyle sağlandı. Burada ifade edilen görüşler mutlaka Sağlık Bakanı'nın veya Kanada Hükümeti'nin görüşlerini temsil etmez.

<ol><li>Armulik, A., Genové, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+Developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Berthiaume, A. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+pericytes+in+vivo+maintains+capillary+coverage+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of pericytes in vivo maintains capillary coverage in the adult mouse brain.</a> Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).</li>
<li>Rungta, R. L., Chaigneau, E., Osmanski, B. -F. F., Charpak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+compartmentalization+of+functional+hyperemia+from+the+synapse+to+the+pia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vascular compartmentalization of functional hyperemia from the synapse to the pia.</a> Neuron. 99 (2), 362-375 (2018).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nature Methods. 9 (3), 273-276 (2012).</li>
<li>Gonzales, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+pericytes+determine+the+direction+of+blood+flow+at+capillary+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contractile pericytes determine the direction of blood flow at capillary junctions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 27022-27033 (2020).</li>
<li>Hartmann, D. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericyte+structure+and+distribution+in+the+cerebral+cortex+revealed+by+high-resolution+imaging+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Pericyte structure and distribution in the cerebral cortex revealed by high-resolution imaging of transgenic mice.</a> Neurophotonics. 2 (4), 041402(2015).</li>
<li>Grant, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (3), 411-425 (2017).</li>
<li>Hill, R. A., Tong, L., Yuan, P., Murikinati, S., Gupta, S., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+blood+flow+in+the+normal+and+ischemic+brain+is+controlled+by+arteriolar+smooth+muscle+cell+contractility+and+not+by+capillary+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regional blood flow in the normal and ischemic brain is controlled by arteriolar smooth muscle cell contractility and not by capillary pericytes.</a> Neuron. 87 (1), 95-110 (2015).</li>
<li>28345 - STOCK Tg(RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J. Jackson Laboratory. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jax.org/strain/028345">https://www.jax.org/strain/028345</a> (2021).</li>
<li>Ohkura, M., Sasaki, T., Kobayashi, C., Ikegaya, Y., Nakai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genetically+encoded+red+fluorescent+Ca2%2B+indicator+for+detecting+optically+evoked+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An improved genetically encoded red fluorescent Ca2+ indicator for detecting optically evoked action potentials.</a> PLoS ONE. 7 (7), (2012).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+calcium+imaging+of+astrocytes+reveals+distinct+cellular+compartment+responses+to+sensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> JoVE. (143), e56297(2019).</li>
<li>Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+algorithm+for+automated+detection%2C+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. 56 (3), 147-156 (2014).</li>
<li>Barrett, M. J. P., Ferrari, K. D., Stobart, J. L., Holub, M., Weber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHIPS%3A+an+extensible+toolbox+for+cellular+and+hemodynamic+two-photon+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">CHIPS: an extensible toolbox for cellular and hemodynamic two-photon image analysis.</a> Neuroinformatics. 16, 145-147 (2018).</li>
<li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (1), 55-60 (2014).</li>
<li>Nilsson, H., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasomotion%3A+mechanisms+and+physiological+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+interventions%22%5BJournal%5D)">Vasomotion: mechanisms and physiological importance.</a> Molecular interventions. 3 (2), 79-89 (2003).</li>
<li>Rungta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+arbors+in+layer+II+%2F+III+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular arbors in layer II / III somatosensory cortex.</a> Communications Biology. , (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Mevcut yöntem, bir kateter ile fare kuyruğu damar enjeksiyonu, derinlik yığınları için iki foton mikroskop görüntü alımı, hücre kalsiyum sinyal filmleri, hemodinamik kimografların oluşturulması ve görüntü işleme algoritmalarımızla kalsiyum ve hemodinamik analiz hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir17 (Şekil 1). Bu tekniklerin in vivo görüntüleme sonucunu iyileştiren ve oturum sırasında zaman, kaynak ve hayvan stresini azaltan çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, kuyruk damarı enjeksiyonu için kateter kullanılması, iğne, şırınga ve farenin dolaşımına enjekte edilen madde miktarı üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Ek olarak, kuyruk dokusuna boya enjeksiyonu önleyerek pahalı reaktiflerden tasarruf sağlar. İkinci olarak, ensheathing perisitlerinde genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörlerini ifade eden transgenik fareler kullanıyoruz ve bunları beyin damar ağı içinde, sonraki görüntüleme seanslarında hücre tanımlamasını ve yer değiştirmesini uzun süreli kolaylaştıran bir derinlik z-yığını ile nasıl lokalize edeceğimizi gösteriyoruz. Bu perisit çalışmalarında önemli bir faktördür ve uygun hücre sınıflandırmasısağlar 6,7. Üçüncü olarak, dinamik hücresel sinyalleri ölçmek için iyi bir başlangıç noktası olan kalsiyum filmleri ve hemodinamik hat tarama verilerini toplamak için parametrelerimizi sunuyoruz. Son olarak, görüntü işleme algoritmalarımızı sunuyoruz17Görüntü ön işleme (spektral karıştırma gibi), kalsiyum görüntü analizi ve hemodinamik analiz (çap, hız vb.) için birden fazla yaklaşım içeren kapsamlı bir görüntü işleme araç kutusu. Bu algoritmalar, sonuçları analiz etmek için gereken kullanıcı uzmanlığı düzeyini en aza indirirken, verilerin hızlı ve kolay bir şekilde görselleştirilmesi için çizimler oluşturabilir. Ayrıca, aynı parametrelerle birden çok veri kümesini hızlı bir şekilde işlemek için birkaç kod satırıyla otomatik hale getirebilir. Bu, potansiyel olarak veri görselleştirmeyi ve araştırmacının zaman yatırımını artırabilir.
İyi kalsiyum görüntüleme verilerini toplamanın anahtarı, net floresan sinyal alımı için lazer gücünü ve PMT ayarlarını yapmak, aynı zamanda tüm kalsiyum olayını yakalamak için yeterli kare hızında veri toplamaktır. Bu protokoldeki veriler saniyede 10-11 karede elde edildi, bu da ensheathing perisitlerindeki daha yavaş kalsiyum salınımlarını yakalar. Analiz sırasında analiz sonucunu iyileştirebilecek birkaç adım da vardır. İlk olarak, spektral karıştırma, floroforların emisyon spektrumu arasında önemli bir örtüşüyorsa faydalıdır (Şekil 2). Floresan-dektran bu protokolde kullanılmıştır, çünkü hemodinamik ölçümler için yaygın olarak kullanılan uygun maliyetli ve ticari olarak kullanılabilen bir dektran konjugedir5. Spektral karıştırma, kalsiyum sinyallerinin daha iyi tespiti için verilerin temizlenmesine yardımcı olur, ancak daha dar emisyon spektrumlarına sahip alternatif floroforlar da kullanılabilir. İkincisi, hücresel yapıları ROI olarak elle seçmek (Şekil 3) soma veya proses dalları gibi farklı hücresel altı bölgelerdeki kalsiyum olaylarını sınıflandırmak için yararlıdır. Aktivite bazlı yatırım getirisi seçimi (Şekil 4)16, bireysel kalsiyum olayları hakkında daha mekansal ve zamansal bilgi sağlar. Bu, belirli bir alandaki kalsiyum olaylarının sıklığını veya olayların diğer hücresel alanlara yayılmasını belirlerken yararlı olabilir. Görüntüleme verilerini analiz etmek için programlama yazılımının kullanılması, veriler toplu olarak işlendiğinde araştırmacılara saatler kazandırabilir, ancak en iyi sonuçlar için parametreleri ayarlamak için biraz ilk zaman yatırımı gerektirir. En önemli faktörler aktif bölgenin beklenen boyutu(μm 2cinsinden) ve sinyalin süresidir (minimum sinyal süresi ve maksimum sinyal süresi tanımlanmalıdır). Araştırmacılar, hangi parametrelerin verilerine en iyi şekilde uyduğunu belirlemek için önce bazı örnek T serisi filmleri incelemelidir. Son olarak, mikroskopta elde edilen düşük kaliteli veriler kalsiyum ve hemodinamik analizini büyük ölçüde engelleyebilir (Şekil 6). Bu nedenle, başlangıçta mikroskop alma ayarlarını optimize etmeye özen edilmelidir. Bu faktörler göz önünde bulundurularak, diğer dokularda veya hücre tiplerinde kalsiyum görüntüleme veya diğer dinamik hücresel sinyallerin (örneğin floresan sodyum, potasyum, metabolit veya voltaj dalgalanmaları) analizine uyacak şekilde uyarlanabilen bu protokol.
Bu iletişim kuralının birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, veriler anestezi altında toplanır, bu da beyin aktivitesini etkiler ve kan akışını etkileyebilir. Benzer görüntüleme, daha fizyolojik sonuçlar için kafa fiksasyonunu kabul etmek için eğitilmiş uyanık farelerde de yapılabilir. Ek olarak, 3 boyutlu bir hücrenin ve kan damarının 2 boyutlu görüntülerini topladığımızı hatırlamak önemlidir vivo. Bu nedenle, bu hücrelerdeki kalsiyum olaylarının bir fraksiyonu veya kan damarının tek bir bölümündeki kan akışını aynı anda yakalayabiliriz.
Dikkat edilmesi gereken bir başka sınırlama, iki fotonlu kalsiyum görüntülemenin, odak düzlemine girip çıkan hareketin kalsiyum dalgalanmaları ile karıştırılabileceği hareket eserlerine karşı hassas olmasıdır. Bu protokol, hayvanın hareketini sınırlayan anestezi altında gerçekleştirildi; bununla birlikte, hareket eserleri farenin nefes alma hızı, kalp atış hızı, olası doku şişmesi ve ensheathing perisitleri, damar kasılması veya vasomotion durumunda 4,6,18,19ile tanıtılabilir. Hareket eserleri çeşitli stratejilerle azaltılabilir. Bu protokolde kullanılan görüntü işleme paketleri, görünür vaskülat13,17'ye dayanarak görüntüleri T serisi içinde hizalamak için 2D konvolüsyon motoru kullanan isteğe bağlı bir hareket düzeltme adımı içerir. Odak düzleminde önemli değişiklikler olan çerçeveler bu algoritma tarafından tanımlanır ve analizden hariç tutulabilir. Ek olarak, görüntüleme işleme paketleri içinde, harekete bağlı kalsiyum dalgalanmalarını normalleştirmek için floresan izlerini oluştururken Z skoru gibi istatistiksel stratejiler kullanmak mümkündür20. İki fotonlu görüntülemede hareket yapıtlarını hesaba katmak için en sağlam yaklaşım, kalsiyum göstergesi (örneğin, GCaMP) ve kalsiyumdan bağımsız bir floresan muhabiri (örneğin, mCherry) gibi aynı hücre içindeki iki floresan göstergenin ifadesini birleştirmektir. Floresan muhabirdeki dalgalanmalar daha sonra harekete bağlanabilir ve hareket yapıtlarını normalleştirmek için kalsiyum gösterge sinyalinden çıkarılır.
Bu protokolün amacı, en uygun kalsiyum görüntüleme ve kan akışı verilerinin in vivo olarak nasıl toplanır konusunda net bir anlayış sağlamak ve araştırmacıların sonuçlarını iyileştirmek için uygulayabilecekleri yeni yöntemler ve analiz araçları sunmaktır. Bu teknikler, farklı perisit popülasyonlarının kan akışı kontrolünde veya farklı beyin hastalığı durumlarındaki rolünü incelemek için uygulanabilir. Bu görüntüleme parametreleri diğer hücre tiplerinde ve organ sistemlerinde kalsiyum ve kan akışını incelemek için de kullanılabilir ve benzer ilkeler, kalsiyum dışında genetik olarak kodlanmış diğer sensörler tarafından mümkün olan diğer dinamik görüntüleme teknikleri için de geçerlidir.

Merkezi sinir sistemi vaskülat, delici arteriküller, kılcal damarlar ve yükselen venülelerden oluşur. Bu ağ içinde, damar düz kas hücreleri arteriyoleleri ve perisitleri kaplayan vasküler hücreler, hücresel süreçleri ilk arteriole dalları ve kılcal damarlar boyunca genişletir1. Perisitlerin beyin içinde kan-beyin bariyeri 1 ,2,göç ve hareketlilik3, potansiyel kök hücre özelliklerinin bakımı ve beyin kan akışının düzenlenmesi 4,5 ,6dahil olmak üzere çeşitlirolleresahip olduğu görülmektedir. Perisitlerin fonksiyonel rollerinin çoğu, hücre içi kalsiyumda bu hücrelerin genişlemesini veya daralmasını düzenleyebilecek dalgalanmalarla bağlantılıdır4,5,6.
Birkaç yeni çalışma, farklı beyin perisitleri7,8. Penetrasyon arteriyüllerinin ilk 4 dalındaki duvar hücreleri, kontrtil protein α pürüzsüz kas aktinin (αSMA) ifadelerine ve çıkıntılı, ovoid somata damarlarını saran süreçlere dayanan ensheathing perisitlerdir 7,8,9. Ensheathing perisitlerindeki kalsiyum dalgalanmalarını görselleştirmek için, bu protokol yeni bir transgenik fare hattı kullanır, Acta2-RCaMP1.07, Tg (RP23-370F21-RCaMP1.07)B3-3Mik/J10olarak da bilinir. Bu fareler, αSMA eksprese hücrelerinde (damar düz kas hücreleri ve ensheathing perisitleri) genetik olarak kodlanmış kırmızı kalsiyum göstergesi RCaMP1.07'yi ifade eder. Üreme kolonileri, hemizygotlarla noncarrier hayvanları geçerek korunur. RCaMP1.07, hücre içi kalsiyum 10,11'ebağlanırken floresan artıran calmodulin bağlayıcıetki alanına sahip kırmızı bir floresan proteindir. Bu protokol, floresan boyaların kuyruk damarı enjeksiyonu, uyuşturulmuş farelerde mikroskop görüntü alımı ve programlama platformları ile veri analizi dahil olmak üzere iki foton mikroskopisi ile ensheathing perisitlerin ve kan akışı ölçümlerinin kombine kalsiyum görüntüleme adımlarını özetlemektedir (Şekil 1). Bu teknikler, duvar hücresi fizyolojisi ile ilgili soruları ele almak için yararlıdır, ancak beyindeki veya diğer organ sistemindeki herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini incelemek için uyarlanabilir.
Bu makalede sunulan deney için 10 aylık bir dişi Acta2-RCaMP1.07 fare kullanıldı. Fare iki ay önce kronik kraniyal pencere ve kafa sonrası implantasyon için ameliyat oldu. Cerrahi protokole ilişkin detaylar önceki çalışmalarda ele alınmıştır12,13 ve benzeri işlemler daha önce yayınlanan diğer protokollerde de gerçeklenmiştir14,15. Vaskülat, intravenöz olarak enjekte edilen yeşil floresan-Dektran (70.000 MW, anionik çözelti, % 2.5 w/v) ile etiketlenmiştir. Bu boya uygun maliyetlidir ve ticari kaynaklardan kolayca temin edilebilir, ancak RCaMP emisyonu ile örtüşebilecek ve mikroskop görüntü alımı sırasında kanayabilecek daha geniş bir emisyon spektrumu vardır. Spektral karıştırma adımları, bunu atlatmak için aşağıdaki Bölüm 4'te özetlenmiştir, ancak EGFP'ye dayananlar gibi daha dar emisyon spektrumlarına sahip diğer yeşil boyalar da kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Acta2-RCaMP1.07</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>28345</td><td>Video protokolünde kullanılan hayvan modeli 10 aylık, 1 günlük bir dişi faredir.</td></tr><tr><td>Aplikatörler (Normal)</td><td>MATLAB</td> NA NA için Bisco <td>X-80250P</td><td></td></tr><tr><td>BioFormats paketi</td><td></td><td></td><td>Bu protokolde "görüntü işleme paketleri" olarak adlandırılmıştır. Uygun: https://docs.openmicroscopy.org/bio-formats/</td></tr> <tr><td>CHIPS MATLAB toolbox</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Bu protokolde "görüntü işleme algoritmaları" olarak adlandırılmıştır. Barrett MJP, Ferrari KD, Stobart JL, Holub M, Weber B. CHIPS: hücresel ve hemodinamik iki fotonlu görüntü analizi için genişletilebilir bir araç kutusu. Nöroinformatik. 2018; 16(1):145-147. doi:10.1007/s12021-017-9344-y. Renk seçenekleri: https://github.com/EIN-lab/CHIPS</td></tr><tr><td>Berrak Ultrason Jeli, Orta viskoziteli</td><td>HealthCare Plus</td><td>UGC250</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, floresein, 70.000 MW, anyonik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 70.000 MW, nötr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1830</td><td></td></tr><tr><td>Eye Lube Plus</td><td>Optixcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Image J</td><td>NA</td><td>Bu protokolde "görüntü işlemci yazılımı" olarak adlandırılmıştır.&nbsp; Mevcut: https://imagej.net/Fiji/Downloads</td></tr><tr><td>GCaMP6sfl/fl</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baş Direği sabitleme platformu</td><td>Zürih Üniversitesi</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (Narketan 100 mg / mL)</td> <td>Vetoquinol</td><td>440893</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2020b</td><td></td><td>NA</td><td>Bu protokolde "programlama platformu" olarak adlandırılmıştır. Uygun olanlar: https://www.mathworks.com/downloads/</td></tr> <tr><td>İğne 0.3mmx25mm</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Objektif XLUMPLFLN20XW</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/lumplfln-w/</td></tr> <tr><td>PDGFR&beta;-CreERT2</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>30201</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen Boru, PE10 ID 28mm (0.11") OD 61mm (.024&rdquo;)</td><td>BD Intramedic 427401</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prairie View</td><td>Bruker Floresan Mikroskobu</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html Ultima In Vitro Multifoton Mikroskobu</td><td>Bruker Floresan Mikroskobu</td><td>NA</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/fluorescence-microscopy/multiphoton-microscopes/ultima-in-vitro.html</td></tr><tr><td>Tank Altı Isıtıcı</td><td>Reptitherm U.T.H</td><td>E169064</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine (Rompun 20 mg/mL)</td><td>Bayer HealthCare</td><td>2169592</td><td></td></tr></tbody></table>

vivo transgenik farelerde beyin perisit kalsiyumu ve hemodinamik görüntüleme

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Protein biyolojisi ve fare genetiğindeki son gelişmeler, beyin hücrelerinin hücre içi kalsiyum dalgalanmalarının in vivo olarak ölçülmeyi ve bunu lokal hemodinamik ile ilişkilendirmeyi mümkün kıltlamaktadır. Bu protokol, kronik bir kraniyal pencere ile hazırlanmış transgenik fareler kullanır ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi RCaMP1.07'yi, vasküler düz kas hücreleri ve ensheathing perisitleri gibi duvar hücrelerini özellikle etiketlemek için α pürüzsüz kas aktilin promotörü altında ifade eder. Kan akışını izlemek için floresan boyaların intravenöz enjeksiyonu için bir kuyruk damar kateterinin nasıl hazırlanacağı ve ketamin /ksilazine uyuşturulmuş farelerde kraniyal pencereden in vivo olarak iki foton mikroskopisi ile beyin perisit kalsiyumu ve lokal kan damarı hemodinamiklerinin (çap, kırmızı kan hücresi hızı vb.) nasıl ölçüleceğinin adımları özetlenmiştir. Son olarak, bu süreçlerin diğer hücresel görüntüleme verilerine nasıl uyarlanabilebileceğine vurgu yapılarak, Barrett ve ark. 2018 tarafından geliştirilen görüntü işleme algoritmaları aracılığıyla kalsiyum dalgalanmalarının ve kan akışı filmlerinin analizi için ayrıntılar sağlanmaktadır.

Floresan-dektran, ensheathing perisitlerinde RCaMP tespitini etkileyen kırmızı kanala kanayabilen geniş bir emisyon spektrumuna sahiptir (Şekil 2A). Yazılım programında veri toplama işleminden sonra spektral karıştırma, floresan kanamasını azaltır (Şekil 2B, daha düşük), sonraki analiz adımlarında kalsiyum sinyal tespitini artırır.
Bu protokolde kullanılan görüntü işleme algoritmaları ile kalsiyum analizi, ROI'leri ve hücre içi kalsiyum dalgalanmalarını (yani kalsiyum sinyallerini) tanımlamak için birkaç farklı yaklaşım sağlar. Hücresel yapıların elle seçilmesi, normalleştirilmiş kalsiyum izleri düşükgeçişli ve bant geçişli filtrelendikten sonra, tek tepeler ve çok tepeler gibi farklı sinyal zirveleri de dahil olmak üzere bu bölgelerdeki kalsiyum dalgalanmalarının tespitine izin verir (Şekil 3B). Ayrıca, ROI'ler Ellefsen ve ark. 201416 ve Barrett ve ark. 201817 (Şekil 4)tarafından geliştirilen görüntü işleme algoritmaları kullanılarak floresan yoğunluğunun zaman içinde değiştiği aktif pikselleri gruplayarak tanımlanır. Bu, sinyalin beklenen boyutunu ve şeklini kapsayacak şekilde zaman, eşik ve uzamsal parametreleri ayarlayarak herhangi bir dinamik hücresel sinyale uygulanabilir. Sinyal tanımlama eşiğini azaltmak daha fazla ilgi alanı bulur (Şekil 4B).
Parlak ve net hemodinamik kimograflar, ensheathing perisitlerinin yakınındaki kan damarlarında çapı ve RBC hızını ölçmek için analiz edilebilir (Şekil 5A, B). Çap, floresan maksimum yarım tam genişlikten hesaplanır (Şekil 5C). RBC hızı, açının hızı, akıyı (hücreler/hücreler) ve doğrusal yoğunluğu (hücreler/mm) hesaplamak için radon dönüşümüne girdiği etiketsiz RBC'lerden yapılan çizgilerden yaklaşık olarak elde edilir; Şekil 5D). Floresan doygunluğunun, gürültü oranının zayıf sinyalinin veya görüntüleme alanının hareketinin olduğu düşük kaliteli kimograflar (Şekil 6A) verilerin belirlenemediği hata noktaları (kırmızı haçlar) ile güvenilmez çizimler oluşturur (Şekil 6B, C). Elde edilen verilerin kalitesi iyi bir sonuç için kritik öneme sahiptir ve bu protokolde açıklanan adımları takip ederek iyi sonuçlar sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig01.jpg"> Şekil 1. Protokolün özeti. Protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Protokol 4 adıma ayrılmıştır. 1) Prosedür hazırlığı: ekipman ve kateter hazırlama kurulumu; 2) Kuyruk damarı enjeksiyonu; 3) İki fotonlu mikroskopi ile veri toplama; 4) Görüntü işleme algoritmaları ile veri analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig02.jpg"> Şekil 2. Spektral floroforların karıştırılmamış. A) RCaMP ensheathing perisit ve floresan-dektran etiketli kan damarının temsili ortalama görüntüsü bir T serisi alımından. Ölçek çubuğu= 10 μm.B) Üst: Tek tek kanallar göz önüne alındığında, Kanal 1'de (solda) Kanal 2'den kanama belirgindir. Alt: Spektral karıştırmadan sonra, taşma payı azalır ve RCaMP'den gelen sinyal perisit yapısında daha belirgindir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig03.jpg"> Şekil 3. Elle seçilmiş ROI'ler ve optimize edilmiş kalsiyum izleri. A) Kullanılan görüntü işleme yazılımında (gökkuşağı şekilleri) seçilen ilgi alanları kalsiyum sinyal izlerini tanımlamak için kullanılabilir. B) Normalleştirilmiş izlerden gelen sinyal tepeleri, verileri filtreleyen düşük geçiş ve bant geçişi ile tanımlanır. Sinyal eşiğini taban çizgisinin standart sapmasının 3 katı (ilk 30 kare) olarak tanımladık ve bu eşiğin üzerindeki tüm zirveler bir sinyal (daha düşük izleme) olarak kabul edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig04.jpg"> Şekil 4. Kalsiyum analizi için otomatik, aktivite tabanlı ROI'ler. Aynı veriler, taban çizgisinin (A) standart sapmasından 7 kat, taban çizgisinin (B) standart sapmasından 3 kat daha fazla eşik ile analiz edildi. Etkin pikselleri tanımlama eşiğini azaltmak, perisitler içinde daha fazla ROI (B) ve sinyal zirvesi (pasta grafik) bulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig05.jpg"> Şekil 5. Kimograf hemodinamik ölçümleri. A) Geminin içinden örnek hat taraması. B) Çap (sol) ve hız (sağ) için iyi tanımlanmış kimograf örneği. Doğru floresan bandı içindeki siyah çizgiler, net vasomotion dalgalanmaları ile RBC.C) Çap analizine karşılık gelir. D) Y ekseni için çizimlerle hız analizi= RBC akı(hücreler/ler), çizgi yoğunluğu (hücreler/mm), hız (mm/s) ve çizgi açısı (derece), sinyalden gürültü oranına (rastgele birimler, a.u.), X ekseni=zaman (sn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62725/62725fig06.jpg"> Şekil 6. Düşük Kaliteli Hemodinamik ölçümlerin temsili. A) Floresan doygunluğu, düşük sinyal-gürültü oranı veya satın alma sırasında görüntüleme alanının hareketi ile düşük kaliteli kimograf örnekleri. B ve C) Kimografilerin kalitesiz olması nedeniyle hata noktaları (kırmızı noktalar) olan çap ve hız verilerinin Şekil 7'ye benzer çizimleri. (görüntü E, Y ekseni=Çap (μm), X ekseni=zaman (sn); görüntü F, Y ekseni= RBC akı(hücreler/ler), çizgi yoğunluğu (hücreler/mm), hız (mm/s) ve çizgi açısı (derece), sinyalden gürültüye oranı (a.u.), X ekseni=zaman (sn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62725/62725fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Beyin damarı, nüfuz eden arteriyeller, kılcal damarlar ve yükselen venülelerden oluşan karmaşık bir ağdır. Bu damarlar, alfa düz kas aktini ifade eden ensheathing perisitleri gibi duvar hücreleri tarafından kaplanır ve nüfuz eden arteriyellerden ilk dört dalda bulunur. Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi RCaMP'nin ifadesiyle bu hücrelerdeki kalsiyum geçicilerini görselleştirmek için Acta2-RCaMP 1.07 transgenik fareler kullanıyoruz.Kalsiyum bu hücrelerin kasılmasında ve kan akışı kontrolünde güçlü bir rol oynar. Kılcal perisitler vasküler ağda daha aşağı akışta bulunur ve diğer transgenik modellerde etiketlenebilir. Ancak, bu yöntemde perisitleri ısıtmaya odaklanıyoruz.Farelerimize cerrahi olarak görüntüleme için beyin damarlarına erişime izin veren kronik bir kraniyal pencere yerleştirildi. Burada, anestezi yapılan hayvanlarda perisit kalsiyum verileri ve kan akışı hakkında bilgi edinmek için gereken iki foton görüntüleme ve analitik yöntemin ardından gerekli hazırlık adımlarını ve kuyruk damarı enjeksiyonlarını özetliyoruz. Kuyruk damarı kateter enjeksiyonu için aşağıdaki öğeler gereklidir:insülin şırıngaları, 15 santimetrelik pe10 boru parçası, 30 gauge iğne, gazlı bez, salin, forseps, yeşil floresan dektran boyası, pense ve makas.Ayrıca kan akışı ölçümleri için izoflurandan daha iyi olduğu için görüntülemeden önce enjekte edeceğimiz ketamin Xylazine anestezili bir iğnemiz var. Penseyi kullanarak, göbekten 30 kalibrelik bir iğne kırın. İğneyi, salin dolu bir şırıngaya bağlı PE10 boru parçasının ucuna dikkatlice yerleştirin.Bu enjeksiyon için kateter. Bir fareyi izofluran ile uyuşturmak ve I-Lube jeli uygulamak. Yanal damarı genişletmek için kuyruğuna ılık su ile bir eldiven alanı yerleştirin.Kuyruğu etanol ile temizledikten sonra, iğneyi damara yerleştirin ve iğnenin doğru yerleştirildiğinden emin olmak için kateterden hafifçe salin enjekte edin. Kateterdeki şırınnayı floresan dektran boyası ile dolu bir şırınna için değiştirin. Tüpe kabarcık girmemesini sağlamak için boyayı yavaşça enjekte edin.Dektran şırındını salin şırınd ile değiştirin ve tüpte boya kalana kadar boruyu durulayın. İğneyi çıkarın ve gazlı bezle bastırın. Görüntüleme için ketamin Xylazine anestezisi enjekte edin.Fare kafası bir ısıtma yastığına sabitlenmişken, kranial pencereyi diş aplikatörleriyle temizleyin. Pencereye ultrason jeli uygulayın ve iki foton mikroskobu hedefine odaklanın. İki foton görüntüleme için, emisyon tespiti için floresanlar, heyecan verici ve fotomultiplier tüpler için ayarlanabilir titanyum Safir lazerli bir mikroskop kullanıyoruz.Mikroskop yazılımında, dalga boylarını hem RCaMP hem de floresan dektranı heyecanlandırmak için 990 nanometreye ayarlayın. Daha sonra pockel hücre voltajını ve PMT dedektörü hassasiyetini ayarlayarak lazer gücünü ayarlayın. Bu parametreler ve daha yüksek çözünürlük ile canlı tarama, RCaMP pozitif duvar hücreleri ve floresan etiketli kan plazması görülebilir.Vasküler ağdaki perisitleri düzgün bir şekilde bulmak için bir derinlik yığınının alınması önerilir. PO damarlarının yakınındaki dokunun üstüne odaklandığınızda, bunu Zed serisi yığınının sıfır noktası ve üst noktası olarak ayarlayın, ardından dokuda istenen derinliğe odaklanın ve bunu yığının altı olarak ayarlayın. Mikroskop yığının daha derinlerine doğru ilerlerken lazer gücü artacak şekilde ayarlanmalıdır.Görüntü işleme yazılımında Zed serisini açmak, iki kanalı renkli görüntüler olarak birleştirin ve ilgi çekici perisitler ve kan damarları için yığında tarayın. Perisit içeren ilgi çekici bölgeleri seçin ve gelecekteki görüntüleme oturumlarında bu noktaları yeniden bulmada yardımcı olacak pozisyonları kaydedin. Bir perisit kalsiyum olayını toplamak ve taşımak için, alım kare hızını saniyede 10 kareden fazlasına çıkarın.Görüntüleme süresini 60 saniye olarak ayarlayın ve kaydetme yolunu benzersiz bir dosya adıyla güncelleştirin. Daha düşük çözünürlüğü hesaba katmak ve perisit hakkında daha yakından bir görünüm elde etmek için gemiye optik olarak yakınlaştırın. T serisini alın.Kan damarı çapını ve kırmızı kan hücresi hızını ölçmek için, mikroskopla tek boyutlu tarama başlatmak için hat taramasını seçin. İlk olarak tarama süresini milisaniye olarak ayarlayın. Daha sonra ilgi çekici damarı ikiye bölen ve gemi boyunca paralel hareket eden bir çizgi çizin.Bu, soldaki damar çapının ve sağdaki damardan hareket eden kırmızı kan hücrelerinin çizgilerinin bir kimografını oluşturacaktır. Bu iletişim kuralında kullanılan programların ve paketlerin tam listesi için malzeme tablosuna bakın. Öncelikle görüntü işleme yazılımında elle ilgi çekici bölgeleri seçin.T serisi dosyasını yükleyin, yığının ortalamasını alın ve renkli bir görüntü yapın. Çokgen aracını seçin ve soma ve prosesler gibi görünür ensheathing perisit yapılarını özetler. İlgilendiğiniz her bölgeye benzersiz bir ad verin ve bunları daha sonra programlama yazılımına yüklenebilen bir zip klasörü olarak kaydedin.Programlama yazılımını açın ve görüntü işleme paketlerinin klasörlerinin yolda olduğundan emin olun. Kalsiyum T serisini programlama yazılımına içe aktarın ve her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Bu durumda, kanal 1'de hücresel bir sinyal ve ikinci kanalda kan plazmasıdır.Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için verileri programlama yazılımı içinde bir film olarak çizin. Kırmızı RCaMP kanalına kanayan floresan dektrandan yeşil floresanları çıkarmak için görüntü işleme paketindeki kanalların karıştırın. İlk olarak, bu durumda yalnızca florofor 1, RCaMP içeren bir bölge seçin.İkincisi, plazmada sadece florofor 2, floresan içeren bir bölge seçin. Son olarak, floroforu olmayan bir arka plan alanı seçin. Bu, her kanaldaki her piksele uygulanan bir spektral katkı matrisi oluşturur.Bu yapılardaki kalsiyum olaylarının tespitini artıracak RCaMP sinyalinin lokalizasyonunu önemli ölçüde geliştirir. Kalsiyum görüntüleme verilerinin görüntü işleme paketleri içinde analiz edilebilmesinin birden fazla yolu vardır. İlk olarak, karıştırılmamış kalsiyum filminde hücresel sinyal analizini çalıştırın ve ilgi çekici bölgeleri perisitlerden seçilen zip klasöründen daha önce elle yükleyin.Bölgelerin yeniden boyutlandırılması gerekmediğinden ölçek faktörünü bire ayarlayın. İşlemden sonra, her ROY'un çizimlerini ve normalleştirilmiş kalsiyum izlerini farklı renklerde oluşturun. Kod, tek tek izlemelerdeki kalsiyum olaylarının çoğunu algılamazsa, kısa geçiş filtrelenmiş verilerin eşiğini T serisinin ilk 30 karesi olan temel dönemin standart sapmasının üç katına düşürme gibi iyileştirme kutusundaki yerleşik parametreleri değiştirin.Sinyalleri tespit etmek ve sınıflandırmak için, normalleştirilmiş kalsiyum izi uzun geçişli ve bant geçişi filtrelenir, bu da genlik ve tahminler için verileri yumuşatmaya yardımcı olur, aynı zamanda sinyallerin tek tepeler, çoklu tepeler veya platolar olup olmadığını belirlemeye yardımcı olur. Daha fazla istatistiksel analiz için verileri CSV dosyası olarak çıktısını verin. Hücresel sinyal analizini karıştırılmamış kalsiyum filminde ikinci kez çalıştırın ve X, Y ve zaman olmak üzere üç boyutta floresanlardaki aktiviteye ve değişime göre otomatik ilgi alanı tanımlama bölgesini seçin.Belirlenen ilgi alanlarını görüntülemek için işlem sonuçlarını çizin farklı renklerdir. Algoritma filmde gözle açıkça görülebilen ROY'leri algılamazsa, verileri zamanında yumuşatan Gauss filtresini artırmak ve ROY'leri bulma eşiğini taban çizgisinin standart sapmasının üç katına çıkarmak gibi yerleşik parametreleri değiştirin. Daha fazla görselleştirme için ROY'leri bir film olarak çizin.Daha fazla istatistiksel analiz için verileri CSV dosyası olarak çıktısını verin. Hat tarama kimograf veri dosyasını programlama yazılımına içe aktarın ve her kanalda ne olduğunu tanımlayın. Kimografideki çapa karşılık gelen alanı seçmek için bir kutu açan hat taramasında çap analizi işlevini çalıştırın.Kimograf floresanlarının sınırlarının dışına, damar çapına karşılık gelen bir kutu çizin. Gemi çapı için tam genişliği yarı maksima cinsinden ölçmek ve bir arsa oluşturmak için bu veri sınıfını işleyin. Daha sonra dönüşüm analizinde hız oranını çalıştırın ve kimograf floresanlarının sınırına bir kutu çizin.Kırmızı kan hücrelerinin hızını, akısını ve doğrusal yoğunluğunu hesaplamak için bu veri sınıfını işleyin. Daha fazla analiz için kan akışı sonuçlarını bir CSV dosyası olarak çıktı. Hücresel yapıların elle seçilmesi, normalleştirilmiş kalsiyum izleri düşük geçiş ve bant geçişi filtrelendikten sonra, tek tepeler ve çoklu zirveler gibi farklı sinyal zirveleri de dahil olmak üzere bu bölgelerdeki kalsiyum dalgalanmalarının tespit edilmesine izin verir.Ayrıca, ilgi çekici bölgeler, görüntü işleme algoritmaları kullanılarak floresanların yoğunluğunun zaman içinde değiştiği etkin pikselleri gruplayarak tanımlanır. Bu, sinyalin beklenen boyutunu ve şeklini kapsayacak şekilde zaman, eşik ve uzamsal parametreleri ayarlayarak herhangi bir dinamik hücresel sinyale uygulanabilir. Sinyal tanımlama eşiğini azaltmak daha fazla ilgi alanı bulur.Açık, hemodinamik kimograflar, ensheathing perisitlerinin yakınındaki kan damarlarında çap ve kırmızı kan hücresi hızını ölçmek için analiz edilir. Çap, floresanların maksimum yarısı kadar tam genişlikten hesaplanır. Kırmızı kan hücresi hızı, hızı hesaplamak için açının radon dönüşümüne girdiği etiketlenmemiş kırmızı kan hücrelerinden yapılan çizgilerden yaklaşık olarak elde edilir.Floresan doygunluğun, düşük sinyal-gürültü oranının veya görüntüleme alanının hareketinin olduğu düşük kaliteli kimograflar, verilerin belirlenemeyeceği kırmızı haçlar olarak belirtilen hata noktalarıyla güvenilmez çizimler oluşturur. Elde edilen verilerin kalitesi iyi bir sonuç için kritik öneme sahiptir ve bu protokolde açıklanan adımları takip ederek iyi sonuçlar sağlar. Bu videoda, beyin ensheathing perisitlerinin kombine kalsiyum görüntüleme prosedürü ve iki foton mikroskopisi ile kan akışı ölçümleri özetlenmiştir.Bu teknikler, beyin damar ağı içindeki duvar hücresi fizyolojisi ve lokalizasyonu ile ilgili soruları ele almak için yararlıdır, ancak beyindeki veya diğer organ sistemindeki herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini incelemek için uyarlanabilirler.

brain-pericyte-calcium-hemodynamic-imaging-transgenic-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster'ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster&#39;ın kas Hazırlık

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Biz yukarıda ikili birincil somatosensor corticies (S1) Thy1içinde çift optik pencerelerden nöronal aktivite ölçmek için deneysel bir işlem tarif-GCaMP6s transgenik fareler 2-foton (2 P) mikroskopi vivo içindekullanma.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

Beyin kılcal perisitler kan-beyin bariyer özellikleri ve kan akışının düzenlenmesinde önemli oyunculardır. Bu protokol, beyin kapiller perisitlerin nasıl izole edilebildiğini, kültürlü, hücre tipine göre karakterize ve floresan problarla hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunun araştırılması için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır.

Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

İn vivo görüntüleme, sağlık ve hastalıkta biyoloji çalışmaları için güçlü bir araçtır. Bu protokol, standart iki foton mikroskobu ile fare retinasının transpupiller görüntülemesini tanımlar. Ayrıca, retinanın birden fazla hücresel kohortunu floresan olarak etiketlemek için farklı in vivoimaging yöntemleri göstermektedir.

Transpupiller İki Foton Fare Retinasının In vivo Görüntülenmesi

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin, Acta2-RCaMP 1.07 transgenik farelerde iki foton görüntüleme ile beyin perisit kalsiyum dinamiklerini ve kan akışını nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, mural hücrelerin fizyolojik rollerini incelemek için uyarlanabilir.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Daha fazla video keşfet