Name: Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Öğrenin, HEK293 hücre yığınlarında adeno ilişkili virüs vektörleri üretmek için maliyet etkin bir yöntemi. Bu protokol, gen tedavisi araştırmalarında yüksek saflıkta ve yüksek titrede AAV elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas ve Jacob G. E. Yates, Ontario Veteriner Koleji Öğrenci Burslarının yanı sıra Ontario Lisansüstü Bursları'nın da sahibiydi. Amira D. Rghei, Mitacs Accelerate Studentship'in alıcısıydı. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibesi (#66009) ve SKW'ye İşbirlikçi Sağlık Araştırma Projeleri (NSERC ortaklı) hibesi (#433339) tarafından finanse edildi.

1. Hücre yığınlarındaki HEK293 hücrelerinin çift plazmid transfeksiyon
<ol><li>37 °C'de ayarlanmış bir boncuk banyosunda hek293 hücrelerinin kriyo şişelerini çözün. NOT: Soğuk sıcaklığın kaplama sırasında hücreleri şoklamamasını sağlamak için hücreler çözülürken, önceden ısınan komple DMEM ila 37 °C. Optimum büyüme ve transeksiyon verimliliği sağlamak için hücrelerin ideal olarak 20'den az düşük geçiş sayısına sahip olduğundan emin olun. Hücrelerin mikoplazma içermediğinin onaylı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kriyo şişesinin içeriğini damla yönünde 10 mL önceden ısıtılmış komple DMEM içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve ardından HEK293 hücrelerini önceden ısıtılmış 20 mL'lik komple DMEM'de yeniden biriktirin. Hücreleri 15 cm'lik bir plakada tohumlayın ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkayayatırın.
</li>
	<li>Hücre kültürü odasında tohumlama için hücreleri bir 15 cm plakadan üçe bölün.<ol>
<li>Hücreler % 80 birleştiğinde, ortamı aspire edin ve monolayer'ı bozmamak için plakayı 3 mL PBS ile hafifçe yıkayın. Ardından, PBS'yi aspire edin ve 3 mL tripsin ekleyin.</li>
		<li>Hücreler plakadan kaldırınceye kadar 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın ve plakaya 7 mL komple DMEM ekleyerek tripsin nötralize edin.</li>
		<li>Tüm ortamları ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj yaparak hücreleri peletlayın.</li>
		<li>Süpernatantı 15 mL tüpten epire edin ve hücre peletini 3 mL'lik komple DMEM'de yeniden süzülür. 20 mL komple DMEM içeren her 15 cm plakaya 1 mL ekleyin; hücreleri eşit olarak dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın ve% 5 CO 2 ile 37 ° C'de kuluçkayayaslayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li><li><li></li><li></li><li> </li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62727/62727fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/62727fig01large.jpg" target="_blank"></a><ol start="10"><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li> </li><li></li></ol><ol><li><li> </li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li><ol><li><li></ol></li><li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62727/62727fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/62727fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol start="5"><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li></ol></li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li><li><li><li><li> <ol><li></li><li><li><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li> </li></ol></li><li> </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="3"><li><li><ol><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62727/62727fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/62727fig03large.jpg" target="_blank"></a><ol start="5"><li><ol><li><li><li><li></li><li></li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td></td><td></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><ol start="6"><li><ol><li></li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li> </li><li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><li></li></ol></li></ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62727/62727fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/62727fig04large.jpg" target="_blank"></a><ol start="2"><li><ol><li><li><li><li><li><li></ol></li></ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62727/62727fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/62727fig05large.jpg" target="_blank"></a><ol start="3"><li><ol><li> </li><li></ol></li></ol>

<ol><li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+A+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: A golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success-a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+factor+IX+gene+therapy+in+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (21), 1994-2004 (2014).</li>
<li>Kuzmin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+landscape+for+AAV+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The clinical landscape for AAV gene therapies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).</li>
<li>Ylä-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
<li>FDA approves novel gene therapy to treat patients with a rare form of inherited vision loss. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-novel-gene-therapy-treat-patients-rare-form-inherited-vision-loss</a> (2020).</li>
<li>FDA approves innovative gene therapy to treat pediatric patients with spinal muscular atrophy, a rare disease and leading genetic cause of infant mortality. FDA News Release. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-innovative-gene-therapy-treat-pediatric-patients-spinal-muscular-atrophy-rare-disease</a> (2020).</li>
<li>Statement from FDA Commissioner Scott Gottlieb, MD and Peter Marks, MD Ph.D., Director of the Center for Biologics Evaluation and Research on new policies to advance development of safe and effective cell and gene therapies. FDA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics">https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/statement-fda-commissioner-scott-gottlieb-md-and-peter-marks-md-phd-director-center-biologics</a> (2020).</li>
<li>Asokan, A., Schaffer, D. V., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AAV+vector+toolkit%3A+poised+at+the+clinical+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (4), 699-708 (2012).</li>
<li>Rose, J. A., Hoggan, M. D., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+from+an+adeno-associated+virus%3A+chemical+and+physical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid from an adeno-associated virus: chemical and physical studies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 56 (1), 86-92 (1966).</li>
<li>Lusby, E., Fife, K. H., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+inverted+terminal+repetition+in+adeno-associated+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the inverted terminal repetition in adeno-associated virus DNA.</a> Journal of Virology. 34 (2), 402-409 (1980).</li>
<li>Masat, E., Pavani, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immunity+to+AAV+vectors+in+gene+therapy%3A+challenges+and+potential+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Humoral immunity to AAV vectors in gene therapy: challenges and potential solutions.</a> Discovery Medicine. 15 (85), 379-389 (2013).</li>
<li>Ling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+from+Recombinant+Single-Stranded+D-Sequence-Substituted+Adeno-Associated+Virus+Vectors+in+Human+Cell+Lines+In+Vitro+and+in+Murine+Hepatocytes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression from Recombinant Single-Stranded D-Sequence-Substituted Adeno-Associated Virus Vectors in Human Cell Lines In Vitro and in Murine Hepatocytes In Vivo.</a> Journal of Virology. 89 (2), 952-961 (2014).</li>
<li>Cathomen, T., Stracker, T. H., Gilbert, L. B., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+identifies+a+cellular+regulator+of+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A genetic screen identifies a cellular regulator of adeno-associated virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14991-14996 (2001).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+aav+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of aav serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLOS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+AAV+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
<li>Pillay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+serotypes+have+distinctive+interactions+with+domains+of+the+cellular+AAV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) serotypes have distinctive interactions with domains of the cellular AAV receptor.</a> Journal of Virology. 91 (18), (2017).</li>
<li>Merkel, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+adeno-associated+virus+vectors+across+a+model+of+the+blood-brain+barrier%3B+a+comparative+study+of+transcytosis+and+transduction+using+primary+human+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Trafficking of adeno-associated virus vectors across a model of the blood-brain barrier; a comparative study of transcytosis and transduction using primary human brain endothelial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (2), 216-230 (2017).</li>
<li>van Lieshout, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+triple-mutant+AAV6+capsid+induces+rapid+and+potent+transgene+expression+in+the+muscle+and+respiratory+tract+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">A novel triple-mutant AAV6 capsid induces rapid and potent transgene expression in the muscle and respiratory tract of mice.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 323-329 (2018).</li>
<li>Wu, Z., Asokan, A., Grieger, J. C., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80 (22), 11393-11397 (2006).</li>
<li>Liu, J., Moon, Y. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+purification+of+adeno-associated+virus-DJ+for+liver-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Yonsei+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Simple purification of adeno-associated virus-DJ for liver-specific gene expression.</a> Yonsei Medical Journal. 57 (3), 790-794 (2016).</li>
<li>Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tools+for+production+and+purification+of+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Human Gene Therapy. 9 (18), 2745-2760 (1998).</li>
<li>Kimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+adeno-associated+virus+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 13601(2019).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>dsDNA copy number calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html">http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html</a> (2021).</li>
<li>qPCR Efficiency Calculator - CA. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html">http://www.thermofisher.com/ca/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/qpcr-efficiency-calculator.html</a> (2021).</li>
<li>Lamb, R. A., Kolakofsky, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. Fields Virology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication">https://www.scholars.northwestern.edu/en/publications/paramyxoviridae-the-viruses-and-their-replication</a> (1996).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (16), 7297-7301 (1995).</li>
<li>Kaludov, N., Brown, K. E., Walters, R. W., Zabner, J., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+4+%28AAV4%29+and+AAV5+Both+require+sialic+acid+binding+for+hemagglutination+and+efficient+transduction+but+differ+in+sialic+acid+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 4 (AAV4) and AAV5 Both require sialic acid binding for hemagglutination and efficient transduction but differ in sialic acid linkage specificity.</a> Journal of Virology. 75 (15), 6884-6893 (2001).</li>
<li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570(2019).</li>
<li>Backovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+protein+expression+and+adeno-associated+virus+like+particles+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Capsid protein expression and adeno-associated virus like particles assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 124(2012).</li>
</ol>

Sarah K. Wootton, AAV6.2FF kapsid için US10806802B2 abd patenti üzerinde bir mucittir.

Bu makalede açıklanan rekombinant AAV (rAAV) vektörlerinin üretimi, moleküler biyoloji araştırma laboratuvarlarının ve tesislerinin çoğunda bulunan ortak malzemeler, reaktifler ve ekipmanlar kullanmaktadır. Bu makale, okuyucu tarafından yüksek kaliteli in vitro ve in vivo sınıf rAAV üretilmesini sağlar. Her şeyden önce, rAAV üretimi için bu protokol, sezyum klorür saflaştırmayı içeren daha sıkıcı protokollere kıyasla verimlidir ve ultrasantrifüj kullanımını önler. HEK293 hücreleri transfected edildikten...

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerini kullanan gen tedavisi son otuz yılda büyük adımlar attı1,2. Konjenital körlük, hemofili ve kas-iskelet sistemi ve merkezi sinir sistemi hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli genetik hastalıklarda ortaya konan gelişmeler, AAV gen tedavisini klinik araştırmalarda ön plana çıkarmıştır3,4. 2012 yılında, Avrupa İlaç Ajansı (EMA), LPL eksikliğinin tedavisi için lipoprotein lipazını (LPL) ifade eden bir AAV1 vektörü olan Glybera'yı onayladı ve avrupa veya Amerika BirleşikDevletleri'ndebir gen tedavisi tedavisi için ilk pazarlama izni 5 . O zamandan beri, iki ek AAV gen tedavisi, Luxturna6 ve Zolgensma7, FDA onayı aldı ve pazarın önümüzdeki 5 yıl içinde 20258'ekadar beklenen 10-20 gen tedavisi ile hızla genişlemesi bekleniyor. Mevcut klinik veriler, AAV gen tedavisinin güvenli, iyi tolere edilmiş ve etkili bir modalite olduğunu ve AAV'nin ClinicalTrials.gov kayıtlı 244'ün üzerinde klinik çalışma ile onu en umut verici viral vektörlerden biri haline getirdiğini göstermektedir. AAV vektörlerini içeren klinik uygulamalara artan ilgi, AAV tedavilerinin büyük hayvan modellerinde değerlendirilmesini kolaylaştırmak için sağlam ve ölçeklenebilir üretim yöntemleri gerektirir, çünkü bu çeviri boru hattında kritik bir adımdır9.
AAV vektör üretimi için iki temel gereklilik AAV genom ve kapsiddir. Vahşi tip (wt)-AAV'nin genomları, yaklaşık 4,7 kb uzunluğunda10olan tek iplikli DNA'dır. wt-AAV genom, ambalajlama için önemli olan genomun her iki ucunda bulunan ters terminal tekrarlarını (ITR'ler) ve rep ve cap genleriniiçerir 11. Genom replikasyonu, viral kapsid montajı ve genomun viral kapsid içine kapsüllenmesi için gerekli olan rep ve cap genleri viral genomdan çıkarılır ve AAV vektör üretimi için trans olarak sağlanır12. Bu genlerin viral genomdan çıkarılması, terapötik transgenlere ve promotör ve polyA sinyali de dahil olmak üzere gerekli tüm düzenleyici unsurlara yer sağlar. ITR'ler, uygun genom replikasyonu ve viral kapsülleme sağlamak için vektör genomunda kalır13,14. Transgene ekspresyonunun kinetiğini iyileştirmek için, AAV vektör genomları, AAV genom replikasyon sırasında tek iplikten çift iplikli DNA dönüşümüne dönüştürme ihtiyacını azaltan, ancak kodlama kapasitesini ~ 2.4 kb15'e düşüren kendi kendini tamamlayıcı olacak şekilde geliştirilebilir.
AAV genom tasarımının ötesinde, kapsid serotip seçimi AAV vektörün doku ve hücre tropizmini belirler in vivo2. Doku trompisine ek olarak, farklı AAV serotiplerinin farklı gen ekspresyasyonu kinetiği gösterdiği gösterilmiştir16. Örneğin, Zincarelli ve ark.17 farklı AAV serotiplerini düşük ekspresyon serotipleri (AAV2, 3, 4, 5), ılımlı ifade serotipleri (AAV1, 6, 8) ve yüksek ekspresyon serotipleri (AAV7 ve 9) olarak sınıflandırdı. Ayrıca AAV serotiplerini yavaş başlangıçlı ifade (AAV2, 3, 4, 5) veya hızlı başlangıçlı ifade (AAV1, 6, 7, 8 ve 9) olarak kategorize ettiler. Bu farklı tromizmler ve gen ekspresyasyonu kinetikleri kapsid proteinlerindeki amino asit varyasyonlarından, kapsid protein oluşumlarından ve konak hücre reseptörleri/ ko-reseptörleri ile etkileşimlerden kaynaklanmaktadır18. Bazı AAV kapsidleri, intravasküler uygulama (AAV9) sonrasında kan-beyin bariyerini geçme veya dayanıklı transgene ekspresyasyonu için uzun ömürlü kas hücrelerinde yaşama (AAV6, 6.2FF, 8 ve 9)19,20gibi ek faydalı özelliklere sahiptir.
Bu makale, klinik öncesi büyük hayvan modellerinde kullanılmak üzere yüksek saflıkta, yüksek titreli, araştırma sınıfı AAV vektörleri üretmek için uygun maliyetli bir yöntemi detaylandırmayı amaçlamaktadır. Bu protokol kullanılarak AAV üretimi, hücre yığınlarında yetişen yapışan insan embriyonik böbreği (HEK)293 hücreye çift plazmid transfeksiyon kullanılarak elde edilir. Ayrıca, çalışma, AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 ve DJ21,22 dahil olmak üzere heparin bağlayıcı alanlar içeren AAV serotipleri için kullanılabilen heparin sülfat benzeşim kromatografisi saflaştırma için bir protokol açıklanmaktadır.
AAV vektörlerinin üretimi için bir dizi paketleme sistemi mevcuttur. Bunlar arasında, iki plazmid eş transfeksiyon sistemlerinin kullanımı, Rep ve Cap genlerinin ve Reklam yardımcısı genlerinin (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 ve VA RNA) bir plazmid (pHelper) içinde bulunduğu, plazmid üretimi için azaltılmış maliyet de dahil olmak üzere ortak üç plazmid (üçlü) transfeksiyon yöntemine göre bazı pratik avantajlara sahiptir23,24 . Transgene ifade kasetini (pTransgene) içeren AAV genom plazmidi, ITR'ler tarafından kuşatılmalı ve uzunluğu ~4,7 kb'ı geçmemelidir. Vektör titresi ve saflık transeksiyon sırasında potansiyel sitotoksik etkiler nedeniyle transgeneden etkilenebilir. Vektör saflığının değerlendirilmesi burada açıklanmıştır. Her biri için 1 x 1013 vg/mL veren bu yöntem kullanılarak üretilen vektörler fare, hamster ve yumurta hayvan modellerinde değerlendirildi.
Tablo 1: Gerekli çözümlerin bileşimi. Protokol boyunca çeşitli çözümler için gereken bileşenlerin yüzdeleri ve hacimleri de dahil olmak üzere gerekli bilgiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62727/Table%201-%2062727_R2.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; m filtre</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin</td><td>Fisher Scientific</td><td>SM2001C</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>10 odacıklı hücre yığını</td><td>Corning</td><td>3271</td><td></td></tr><tr><td>1L PETG şişe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2019-1000</td><td></td></tr><tr><td>%30 Akrilamid/Bis Solüsyonu</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu etekli plaka</td><td>FroggaBio</td><td>FS-96</td><td></td></tr><tr><td>Yapışkan plaka contaları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>Kan ve Doku Temizleme Kiti</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>Bromofenol mavisi Fisher Scientific B392-5 protokolünün 4.6 bölümünde DNA temizliği için kullanın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Yemekleri</td><td>Greiner bio-one</td><td>7000232</td><td>15 cm plakalar</td></tr><tr><td>Kültür Konik Boru</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>15 mL konik tüp</td></tr><tr><td>Kültür Konik Boru</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955240</td><td>50 mL konik tüp</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun 1000 mg/L D-glikoz, L-glutamin içeren Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)</td><td>Cytiva Yaşam Bilimleri</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32209</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Greenfield</td><td>P016EA95</td><td>Etil alkolü (%95 hacim) bölüm 3.7.4 için %20'ye ve bölüm 6.1.1.1 için %70'e seyreltin</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>Mg</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2+ ve Ca </td> ve <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH302268.02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS ile Mg2+ >< ve Ca <sup<> / sup></td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30588.02</td> olmadan HBSS<td></td></tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>Amerikan Doku Kültürü Koleksiyonu</td><td>CRL-1573</td><td>Aldıktan sonra, hücreleri ve kültürü üreticinin açıklamasına göre çözün. s protokolü. Hücreler minimum düzeyde geçtikten ve iyi bir şekilde büyüdükten sonra, gelecek için bir alt fraksiyonu alikotlarda dondurun ve sıvı nitrojen içinde saklayın. Her zaman 30 numaralı pasajın altındaki hücreleri kullanın. Kültürlenmiş hücreler 30 defadan fazla geçildikten sonra, depolanan alikotlardan bir kültürün yeniden başlatılması önerilir</td></tr><tr><td>HEK293 konak hücre proteini ELISA kiti</td><td>Cygnus Technologies</td><td>F650S</td><td>Üreticiyi takip edin s talimatları</td></tr><tr><td>Heparin sülfat sütunu</td><td>Cytiva Yaşam Bilimleri</td><td>17040703</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KC34120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-glutamin (200 mM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30034.02</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Hacimli Santrifüj Tüpü Destek Yastığı</td><td>Corning</td><td>CLS431124</td><td>Destek yastığı, santrifüj rotorunun uygun V-alt yastıklara sahip olması durumunda büyük hacimli santrifüj tüpleriyle kullanılmalıdır</td></tr>, Büyük <tr><td>Hacimli Santrifüj Tüpleri</td><td>Corning</td><td>CLS431123-6EA</td><td>500 mL santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü, kullanmadan önce sterilize edin</td></tr><tr><td>Moleküler Sınıf Su</td><td>Cytiva Yaşam Bilimleri</td><td>SH30538.03</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5125</td><td>DİKKAT. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP35810</td><td></td></tr><tr><td>Optimem, azaltılmış serum ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td>Kullanmadan önce sterilize edin</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Hücrelerde kullanım için 1x'e seyreltin</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi</td><td>Cytiva Yaşam Bilimleri</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>pHelper plazmid</td><td>De novo tasarım veya plazmit deposundan elde edilen</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pipet havzası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>Steril pipet havzaları satın alın</td></tr><tr><td>Polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton X-100)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td>DİKKAT. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>Polietilamin (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>Üreticinin takipçisi olun 1 litrelik bir çözelti üretme talimatları. 0.22&mu; m filtre ve 4 derecede saklayın; C</td></tr><tr><td>Polipropilen yarı etekli PCR Plakası</td><td>FroggaBio</td><td>WS-96</td><td></td></tr><tr><td>Polisorbat 20 (Tween 20)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>DİKKAT. Eldiven giyin</td></tr>: <tr><td>poliviniliden diflorür (PVDF) membran</td><td>Cytiva Yaşam Bilimleri</td><td>10600023</td><td>Manipüle etmek için forseps kullanın. Eldiven giyin.</td></tr><tr><td>Birincil antikor</td><td>Progen</td><td>65158</td><td></td></tr><tr><td>Protein Merdiveni</td><td>FroggaBio</td><td>PM008-0500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>pOrtanca plazmid</td><td>De novo tasarım veya plazmit deposundan elde edilen</td><td>NA</td><td>Bölüm 5.0'daki AAV titrasyonu ile uyumlu olması için genomda SV40 poliA içermelidir</td></tr><tr><td>Pompa hortumu</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96440-14</td><td>E1-E5 fraksiyonlarında boru uzunluğunu ve virüsün tutulmasını optimize</td></tr> edin <tr><td>RQ1 Dnase 10 Reaksiyon Tamponu</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Bölüm 4.0'daki protokolde 10x konsantrasyonda kullanım</td></tr><tr><td>RQ1 Rnaz içermeyen Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Örnek seyreltici</td><td>Cygnus Technologies</td><td>I700</td><td>HEK293 konak hücre proteini ELISA kiti</td></tr> <tr><td>ile kullanım için ayrıca satın alınmalıdırİkincil antikor, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G-21040</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız süt tozu</td><td>Oksoit</td><td>LP0033B</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28312</td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-4</td><td></td></tr><tr><td>SV40 poliA astar probu</td><td>IDT</td><td></td><td>Sentez için IDT'den alıntı yapmak için Tablo X'teki sırayı kullanın</td></tr><tr><td>Tetrametetilendiamin (TEMED)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15524010</td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Filtre</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810024</td><td>Ultra-4 Santrifüj 10K cihazı, hücre lizisi için 10000 moleküler ağırlık kesme</td></tr><tr><td>Evrensel Nükleazına</td> sahip olduğu için kullanılmalıdır <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Evrensel qPCR ana karışımı</td><td>NEB</td><td>M3003L</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Kağıt</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>DİKKAT. Laminer akış başlığı altında kullanın. Eldiven giyin</td></tr><tr><td>DİKKAT:&nbsp; Tehlikeli kimyasalların kullanımına ilişkin yönergeler için Malzeme Tablosuna bakın.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

büyük hayvan modellerinde preklinik Çalışmalar İçin hücre yığınlarında adeno İlişkili virüs vektörlerinin Üretimi

Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models

Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörleri, insanlar için onaylanmış üç AAV gen tedavisi ile klinik olarak en gelişmiş gen tedavisi vektörleri arasındadır. AAV için yeni uygulamaların klinik ilerlemesi, fareler gibi küçük hayvan modellerinden köpekler, koyunlar ve insan olmayan primatlar da dahil olmak üzere daha büyük hayvan modellerine geçişi içerir. AAV'yi daha büyük hayvanlara uygulamanın sınırlamalarından biri, büyük miktarlarda yüksek titre virüsü gereksinimidir. Süspansiyon hücre kültürü AAV vektör üretimi için ölçeklenebilir bir yöntem olsa da, çok az araştırma laboratuvarı ekipmana (örneğin biyoreaktörler) sahiptir veya bu şekilde AAV'nin nasıl üretileceği hakkında bilir. Ayrıca, AAV titreleri süspansiyon HEK 293 hücrelerinde üretildiğinde, yapışan HEK293 hücrelerine kıyasla genellikle önemli ölçüde daha düşüktür. Burada açıklanan hücre yığınları kullanarak yüksek titre AAV büyük miktarlarda üretmek için bir yöntemdir. AAV'yi titretmeye yönelik ayrıntılı bir protokol ve vektör saflığını doğrulama yöntemleri de açıklanmıştır. Son olarak, bir koyun modelinde AAV aracılı transgene ekspresyonunun temsili sonuçları sunulmuştur. AAV vektörlerinin yapışan hücrelerde büyük ölçekli üretimi için optimize edilmiş bu protokol, moleküler biyoloji laboratuvarlarının yeni AAV tedavilerinin daha büyük hayvan modellerinde test edilmesini ilerletmesini sağlayacaktır.

Küçük kemirgen modellerinden daha büyük hayvan modellerine ve nihai klinik uygulamaya çeviri, daha büyük hayvanları transdüze etmek ve terapötik etkiler elde etmek için gereken büyük miktarda AAV nedeniyle önemli bir zorluk ortaya sömektedir. Rasyonel olarak tasarlanmış AAV6.2FF kapsidinin transdüksiyon verimliliğini karşılaştırmak için, daha önce AAV63'ekıyasla murine kas hücrelerinde transdüksiyon verimliliğinde 101 kat artış gösterdi, fareler, hamsterlar ve kuzulara insan monoklonal antikorunu ...

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak >1 x 1013 vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Adeno-associated virus (AAV) vectors are among the most clinically advanced gene therapy vectors, with three AAV gene therapies approved for humans. ...

AAV viral vektörlerin üretimi için bu protokol uygun maliyetlidir ve klinik öncesi, büyük hayvan modellerinde kullanılmak üzere yüksek saflık, yüksek titre, araştırma sınıfı AAV verir. Bu teknik, hücre kültürü odalarındaki yapışan HEK293 hücrelerini kullanır, bu da zaman verimli ve daha az uygulamalıdır ve hücrelerde daha az bozulmaya izin verir. Bu protokol, gen tedavisi alanı için viral vektör üretimine büyük ölçüde yardımcı olabilir ve heparan sülfatını da bağlayan diğer AAV serotiplerinin üretimi için de kullanılabilir.Başlamak için, %80 izdiah süresine ulaştığında hek293 hücrelerini kültürden toplayın. Hücre kültürü plakasını üç mililitre PBS ile hafifçe yıkamadan önce ortamı epire edin. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve üç mililitre tripsin ekleyin.Plakaları 37 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatır. İnkübasyondan sonra, plakaya yedi mililitre tam DMEM ekleyerek tripsin nötralize edin ve süpernatantı 50 mililitre konik tüplerde toplayın. Hücrelerin homojen olduğundan emin olmak için tüpleri hafifçe ters çevirin.Hücre yoğunluğunu belirlemek için, hücre örneklerinin 10 mikrolitresini 10 mikrolitre trippan mavisi ile karıştırın. Ve hücre sayacında analiz etmek için karışımı bir hücre sayma slaydına ekleyin. Kültür odasını görmek için hücre süspansiyonu bir litre önceden ısıtılmış komple DMEM ile karıştırın.Hücreleri eşit olarak dağıtmak için odayı hafifçe döndürün. Odayı % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücre kültürü odasına ek olarak, 10 ila dördüncü hücredeki kültür hücreleri, izdiah için bir referans olarak 15 santimetrelik bir plakada karelenmiştir.65 saatlik inkübasyondan sonra, hücreler% 80 ila 90 birleştiğinde, polietilenimin-DNA ve DMEM karışımını yavaşça hücre kültürü oda portuna ekleyin. Sıvıyı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce tüm sıralara eşit olarak dağıtın ve 72 saat boyunca% 5 karbondioksit dağıtın. Kuluçkadan sonra, ortam bulutlu görünene kadar hücreleri yerinden çıkarmak için hücre kültürü odasını kuvvetlice sallayın ve dört veya 500 mililitre santrifüj tüpüne dökün.Hücreleri 18.000 kez G'de 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüjleme ile peletleyin. Netleştirilmiş süpernatantı bir litrelik PETG şişesine dökün ve hücre peletlerini 50 mililitrelik santrifüj tüplerde 50 mililitre lisanslı tamponda yeniden depolayın. Tüpleri 37 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, tüpleri 30 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatantı aynı tek litrelik PETG şişesine aktarın. Eksi 80 santigrat derecede depolayın. Kaba lisatı bir gecede dört santigrat derecede çözün.Çözdükten sonra 0,22 mikron filtre kullanarak filtreleyin. Saflaştırma adımlarından hemen önce, kullanılan her heparin-Sepharose sütunu için dört mililitre filtre ön işlem tamponu ekleyerek santrifüj konsantratörü devre dışı bırakmak. Boruyu peristaltik bir pompaya yerleştirin.Çözümleri ve medyayı sırayla çalıştırın. Boruya beş mililitre heparin-Sepharose sütun takarak ve sütun boyunca 25 mililitre Bazell DMEM çalıştırarak kromatografiye hazırlanın. Daha sonra filtrelenmiş ham maddeden 0,2 mikromolarını saniyede bir ila iki damla akış hızında sütuna yükleyin.300 milimolar sodyum klorür HBSS ile beş mililitreyi magnezyum ve kalsiyumla beş kez elüet etmek için sütunu sırayla yıkayın ve beş elutionu E1 ila E5 olarak etiketlayın. Hazır olduğunuzda, ön işlem tamponu içeren santrifüj konsantratörü iki dakika boyunca 900 kez G'de döndürün. Akışa geç. Santrifüj konsantratör filtresini dört mililitre HBSS ile magnezyum ve kalsiyum ile iki dakika boyunca 1000 kez G'de döndürerek yıkayın.Daha sonra elution E2'yi santrifüj konsantratörüne ekleyin ve beş dakika boyunca 1000 kez G'de döndürün. Akışa geç. Benzer şekilde, konsantre virüs yaklaşık bir mililitre olana kadar elution E3'i santrifüj konsantratörüne çevirin.Konsantre virüsü P200 filtreli bir uç kullanarak santrifüj konsantratöründen çıkarın ve steril 1,5 mililitre santrifüj tüpüne toplayın. Virüsün toplanmasından sonra, santrifüj konsantratörü magnezyum ve kalsiyum ile 200 mikrolitre HBSS ile durulayın. Pipet, zara yapışmış herhangi bir virüsü yerinden çıkarmak için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı ve konsantre virüsü aynı 1,5 mililitre santrifüj tüpünde toplayın.Tüpü iyice karıştırın. Kolonu yıkayın ve dört santigrat derecede saklamadan önce% 20 etanol ile doyuun. Pompa borusunu bir azı dişi sodyum hidroksitte saklayın.AAV6.2FF kapsid transdüksiyon verimliliği, intramüsküler uygulama üzerine 28 gün boyunca farelerde, hamsterlarda ve kuzularda karşılaştırıldı. Fareler, serumdaki insan IgG mililitresi başına 171 ila 237 mikrogram arasında ifade edilen AAV6.2FF insan IgG'nin kilogramı başına 12.vektör genomlarına beş kez 10 kez uygulandı. Hamster, farelerden çok daha yüksek insan IgG seviyelerini ifade eden AAV6.2FF insan IgG'nin kilogramı başına 13.vektör genomlarına iki kez 10 kez uygulanır.Büyük hayvan modeli plazmada mililitre insan IgG seviyesi başına ortalama 35 mikrogram ifade edebildi. Büyük hayvan modelleri, AAV transgene in vivo ekspresyonunun ifadesini belirleyebilir ve transgenlerin ilgi çekici rahatsızlığa veya hastalığa karşı terapötik etkisi olup olmadığını belirleyebilir. Çalışma, iskelet kasında yeni bir AAV 6 serotip vektörü olan AAV6.2FF'nin büyük transdüksiyon yeteneğinin yanı sıra AAV viral vektörlerinin in vivo düşük immünojenikliğini de gözler önüne serdi.

production-adeno-associated-virus-vectors-cell-stacks-for-preclinical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) vektörleri için giderek daha değerli hale...

Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 1013 vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

Bu yazıda, subkonjonktival enjeksiyon, mikroenjeksiyon iğneleri ile birlikte infüzyon/geri çekilme şırınga pompası ve gaz geçirmez çıkarılabilir şırıngadan oluşan bir enjeksiyon sistemi kullanılarak farelerde oküler dokular için geçerli bir vektör dağıtım yöntemi olarak gösterilmiştir. Bu enjeksiyon sistemi diğer göz içi uygulama yolları için de uyarlanabilir.

Küçük Hayvan Modellerinde Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Subkonjonktival Uygulaması

Burada, bir süspansiyon HEK293 hücre tabanlı AAV üretim protokolü sunulmakta olup, ticari satıcılardan araştırma amacıyla temin edilebilen bileşenleri kullanarak vektör üretimi için gereken zaman ve işçiliğin azaltılmasına neden olmaktadır.

HEK293 Süspansiyon Hücreleri Kullanılarak Yüksek Verimli Adeno İlişkili Vektör Partilerinin Üretimi

Gen terapisi alanı gelişmeye devam ettikçe, bu zorlukların üstesinden gelebilecek yenilikçi yöntemlere artan bir ihtiyaç var. Burada, in vivo çalışmalar için kalite standartlarını karşılayan, bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek verimli ve yüksek saflıkta AAV vektörleri üretme sürecini kolaylaştıran benzersiz bir yöntem sunulmaktadır.

Bir hücre fabrikası platformu kullanarak yüksek titre, yüksek kaliteli adeno-ilişkili virüs vektörleri oluşturmak için kolaylaştırılmış ve standartlaştırılmış bir prosedür

Deniz ve tatlı su sistemlerinin virüslerin ciro oranı bir azalma ve yeniden oluşmaları tekniği ile tahmin edilebilir. Veriler araştırmacılar, su sistemlerinde virüs aracılı mikrobiyal ölüm oranları anlaması için izin verir.

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Bu makale, endo-veya ectoparasitism algılamak için tarama sıçan ve fareler için çeşitli prosedürler açıklanmaktadır. Birkaç tanı testleri gösterilecektir, canlı hayvanlar üzerinde kullanım için uygundur ve bu hayvanın ötenazi sonra kullanılan hem de. Sıçan ve fare parazitlerin belirlenmesinde yardımcı Fotoğrafları dahil edilecektir.

Tanı Laboratuvarı Sıçanlar ve Fareler Ecto-Endoparasites

Öğrenin, HEK293 hücre yığınlarında adeno ilişkili virüs vektörleri üretmek için maliyet etkin bir yöntemi. Bu protokol, gen tedavisi araştırmalarında yüksek saflıkta ve yüksek titrede AAV elde edilmesini sağlar.

Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Daha fazla video keşfet