Büyük Hayvan Modellerinde Preklinik Çalışmalar İçin Hücre Yığınlarında Adeno İlişkili Virüs Vektörlerinin Üretimi

Burada, hücre yığınlarında yetişen yapışan HEK 293 hücrelerini ve benzeşim kromatografisi saflaştırmayı kullanarak araştırma sınıfı AAV vektörlerinin büyük ölçekli üretimi için ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz. Bu protokol sürekli olarak >1 x 10¹³ vektör genomları /mL verir ve büyük hayvan çalışmaları için uygun vektör miktarları sağlar.

AAV viral vektörlerin üretimi için bu protokol uygun maliyetlidir ve klinik öncesi, büyük hayvan modellerinde kullanılmak üzere yüksek saflık, yüksek titre, araştırma sınıfı AAV verir. Bu teknik, hücre kültürü odalarındaki yapışan HEK293 hücrelerini kullanır, bu da zaman verimli ve daha az uygulamalıdır ve hücrelerde daha az bozulmaya izin verir. Bu protokol, gen tedavisi alanı için viral vektör üretimine büyük ölçüde yardımcı olabilir ve heparan sülfatını da bağlayan diğer AAV serotiplerinin üretimi için de kullanılabilir.

Başlamak için, %80 izdiah süresine ulaştığında hek293 hücrelerini kültürden toplayın. Hücre kültürü plakasını üç mililitre PBS ile hafifçe yıkamadan önce ortamı epire edin. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve üç mililitre tripsin ekleyin.

Plakaları 37 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatır. İnkübasyondan sonra, plakaya yedi mililitre tam DMEM ekleyerek tripsin nötralize edin ve süpernatantı 50 mililitre konik tüplerde toplayın. Hücrelerin homojen olduğundan emin olmak için tüpleri hafifçe ters çevirin.

Hücre yoğunluğunu belirlemek için, hücre örneklerinin 10 mikrolitresini 10 mikrolitre trippan mavisi ile karıştırın. Ve hücre sayacında analiz etmek için karışımı bir hücre sayma slaydına ekleyin. Kültür odasını görmek için hücre süspansiyonu bir litre önceden ısıtılmış komple DMEM ile karıştırın.

Hücreleri eşit olarak dağıtmak için odayı hafifçe döndürün. Odayı % 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücre kültürü odasına ek olarak, 10 ila dördüncü hücredeki kültür hücreleri, izdiah için bir referans olarak 15 santimetrelik bir plakada karelenmiştir.

65 saatlik inkübasyondan sonra, hücreler% 80 ila 90 birleştiğinde, polietilenimin-DNA ve DMEM karışımını yavaşça hücre kültürü oda portuna ekleyin. Sıvıyı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce tüm sıralara eşit olarak dağıtın ve 72 saat boyunca% 5 karbondioksit dağıtın. Kuluçkadan sonra, ortam bulutlu görünene kadar hücreleri yerinden çıkarmak için hücre kültürü odasını kuvvetlice sallayın ve dört veya 500 mililitre santrifüj tüpüne dökün.

Hücreleri 18.000 kez G'de 30 dakika boyunca 4 santigrat derecede santrifüjleme ile peletleyin. Netleştirilmiş süpernatantı bir litrelik PETG şişesine dökün ve hücre peletlerini 50 mililitrelik santrifüj tüplerde 50 mililitre lisanslı tamponda yeniden depolayın. Tüpleri 37 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra, tüpleri 30 dakika boyunca 18.000 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatantı aynı tek litrelik PETG şişesine aktarın. Eksi 80 santigrat derecede depolayın. Kaba lisatı bir gecede dört santigrat derecede çözün.

Çözdükten sonra 0,22 mikron filtre kullanarak filtreleyin. Saflaştırma adımlarından hemen önce, kullanılan her heparin-Sepharose sütunu için dört mililitre filtre ön işlem tamponu ekleyerek santrifüj konsantratörü devre dışı bırakmak. Boruyu peristaltik bir pompaya yerleştirin.

Çözümleri ve medyayı sırayla çalıştırın. Boruya beş mililitre heparin-Sepharose sütun takarak ve sütun boyunca 25 mililitre Bazell DMEM çalıştırarak kromatografiye hazırlanın. Daha sonra filtrelenmiş ham maddeden 0,2 mikromolarını saniyede bir ila iki damla akış hızında sütuna yükleyin.

300 milimolar sodyum klorür HBSS ile beş mililitreyi magnezyum ve kalsiyumla beş kez elüet etmek için sütunu sırayla yıkayın ve beş elutionu E1 ila E5 olarak etiketlayın. Hazır olduğunuzda, ön işlem tamponu içeren santrifüj konsantratörü iki dakika boyunca 900 kez G'de döndürün. Akışa geç. Santrifüj konsantratör filtresini dört mililitre HBSS ile magnezyum ve kalsiyum ile iki dakika boyunca 1000 kez G'de döndürerek yıkayın.

Daha sonra elution E2'yi santrifüj konsantratörüne ekleyin ve beş dakika boyunca 1000 kez G'de döndürün. Akışa geç. Benzer şekilde, konsantre virüs yaklaşık bir mililitre olana kadar elution E3'i santrifüj konsantratörüne çevirin.

Konsantre virüsü P200 filtreli bir uç kullanarak santrifüj konsantratöründen çıkarın ve steril 1,5 mililitre santrifüj tüpüne toplayın. Virüsün toplanmasından sonra, santrifüj konsantratörü magnezyum ve kalsiyum ile 200 mikrolitre HBSS ile durulayın. Pipet, zara yapışmış herhangi bir virüsü yerinden çıkarmak için 30 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde yukarı ve aşağı ve konsantre virüsü aynı 1,5 mililitre santrifüj tüpünde toplayın.

Tüpü iyice karıştırın. Kolonu yıkayın ve dört santigrat derecede saklamadan önce% 20 etanol ile doyuun. Pompa borusunu bir azı dişi sodyum hidroksitte saklayın.

AAV6.2FF kapsid transdüksiyon verimliliği, intramüsküler uygulama üzerine 28 gün boyunca farelerde, hamsterlarda ve kuzularda karşılaştırıldı. Fareler, serumdaki insan IgG mililitresi başına 171 ila 237 mikrogram arasında ifade edilen AAV6.2FF insan IgG'nin kilogramı başına 12.vektör genomlarına beş kez 10 kez uygulandı. Hamster, farelerden çok daha yüksek insan IgG seviyelerini ifade eden AAV6.2FF insan IgG'nin kilogramı başına 13.vektör genomlarına iki kez 10 kez uygulanır.

Büyük hayvan modeli plazmada mililitre insan IgG seviyesi başına ortalama 35 mikrogram ifade edebildi. Büyük hayvan modelleri, AAV transgene in vivo ekspresyonunun ifadesini belirleyebilir ve transgenlerin ilgi çekici rahatsızlığa veya hastalığa karşı terapötik etkisi olup olmadığını belirleyebilir. Çalışma, iskelet kasında yeni bir AAV 6 serotip vektörü olan AAV6.2FF'nin büyük transdüksiyon yeteneğinin yanı sıra AAV viral vektörlerinin in vivo düşük immünojenikliğini de gözler önüne serdi.