Name: Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Öğrenin, lentiviral transdüksiyon ve shRNA ile dendritik hücre gelişimini inceleyin. Bu yöntem, iHSPC'lerden kararlı knockdown hücre hatları oluşturarak immünolojide gen düzenlemesini araştırmanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Tz-Ling Chen'in teknik desteği için minnettarız. Ulusal RNAi Çekirdek Tesisi'ne (Academia Sinica, Tayvan) shRNA lentivirüs (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw) sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Tayvan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 ve MOST 109-2320-B-002-054-MY3) tarafından desteklendi.

Lentivirüsün kullanımı, Ulusal Tayvan Üniversitesi Tıp Fakültesi Çevre Sağlığı ve Güvenliği Bölümü'nün düzenlemesine göre gerçekleştirilir.
1. Ölümsüzleştirilmiş hematopoetik gövde ve progenitör hücre hatlarının (iHSPC'ler) hazırlanması
<ol><li>iHSPC hücre hattını 100 ng/mL FL ve 1 μM β-estradiol içeren eksiksiz RPMI 1640 ortamında koruyun.</li>
	<li>Hücreleri her 3 günde bir 1:10 oranında geçiştirin. NOT: fetal sığır serumu (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol ve 10 μg/mL gentamisin ile takviye ederek tam RPMI 1640 ortamı yapın. Rekombinant murine FL ticari olarak da mevcuttur.</li>
</ol>2. Lentiviral transdüksiyon
<ol><li>Plaka iHSPC'leri 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol ve 8 μg/mL polibren içeren 1 mL'lik komple ortamda 12 kuyu plakalarında 1 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda. NOT: Polibrenin konsantrasyonu hücre tiplerine bağlıdır ve genellikle 4-8 μg / mL aralığındadır.</li>
	<li>100'lük çok miktarda enfeksiyon (MOI) ile her kuyuya shRNA taşıyan lentivirüs ekleyin. NOT: Lentiviral vektör pLKO.1-Puro dır ve puromycin seçim işaretleyicisi (Şekil 1). Sırasıyla LacZ, Tcf4 ve Id2'ye karşı shRNA'ların hedef dizileri Malzeme Tablosunda listelenir. MOI, enfeksiyon sırasında hücre başına eklenen virion sayısı ile tanımlanır. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62730/62730eq01.jpg">
</li>
	<li>Plakaları 37 °C'de 90 dakika boyunca 1.100 x g'da döndürün. NOT: Spin enfeksiyonu bir salıncak kova rotor kullanılarak gerçekleştirilir.</li>
	<li>Enfekte hücreler içeren plakayı bir inkübatörde 37 °C'de bir gece kuluçkaya yatırın. NOT: Hücreler polibrene duyarlıysa, spin enfeksiyonundan sonra hücreleri polibren olmadan tam ortamla yenileyin.</li>
	<li>Enfeksiyondan sonra 100 ng/mL FL ve 1 μM β-estradiol 24 saat içeren komple ortam ile hücreleri yenileyin.</li>
	<li>Ek 24 saat sonra enfekte hücreleri seçmek için ortama 6 μg / mL puromycin ekleyin. NOT: Transdüklenmiş lentiviral vektör genellikle püromisin dirençli gen de dahil olmak üzere genleri ifade etmek için 48 saat sürer. Puromycin konsantrasyonunun her hücre hattı için optimize olduğundan emin olun.</li>
	<li>100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol ve 6 μg/mL puromycin içeren seçim ortamını her 3 günde bir yenileyin ve hücreleri en az bir hafta boyunca muhafaza ederek, saplı olarak transdüklenmiş iHSPC hücrelerini genişletin. NOT: Puromisin seçimi genellikle 48 saat sonra yürürlüğe girer ve seçim süresi hücre türlerine bağlıdır.</li>
</ol>3. Ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR (RT-PCR) ile devirme verimliliğinin ölçümü
<ol><li>Toplam RNA'yı 1 x 107 shLacZ, shTcf4 ve shId2 kararlı devirme iHSPC hücrelerinden ticari RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak çıkarın ve RNA'yı sulu tabakadan izopropanol ile çökeltin, ardından RNA çökeltisini% 75 etanol ile yıkayın.</li>
	<li>RNA'yı (~ 5 μg) 5 μL DEPC ile işlenmiş H2O ile çözün ve konsantrasyonu 1 μg/μL'ye ayarlayın.</li>
	<li>1-3 μg RNA alın, DEPC ile işlenmiş H2O ile 17,4 μL'lik son hacme karıştırın, 1 μL 1 birim/μL RNase içermeyen DNase I ekleyin ve 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Bu adım, RNA örneklerindeki genomik DNA'yı sindirmektir.</li>
	<li>RNA örneklerine 1 μL 20 mM EDTA ekleyin, DNase I'i devre dışı bırakmak için 10 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın ve RNA örneklerini hemen 4 °C'ye koyun.</li>
	<li>1 μL oligo (dT) astar (45 μM), 6 μL 5x 1. tel tampon içeren reaksiyon karışımının 11,6 μL'sini ekleyin, RNA numunelerine 3 μL dNTP (2 mM), 0,6 μL RNaz inhibitörü (50 Birim/μL) ve 1 μL ters transkriptaz (200 Birim/μL) ve 1 saat boyunca 40 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Reaksiyon karışımını 70 °C'de 10 dakika ısıtarak durdurun ve reaksiyon karışımını 30 μL H2O ile seyreltin.</li>
	<li>Seyreltilmiş RT reaksiyon karışımının 2 μL'sini DNA şablonu olarak alın ve PCR, Tcf4 veya Id2'ye karşı astarlar kullanarak yükseltin (termosikler koşullar için Tablo 1'e bakın). NOT: Astar dizileri Malzeme Tablosu'na dahil edilir.</li>
</ol>4. Kararlı devirme iHSPC hücre hatlarının in vitro farklılaşması
<ol><li>iHSPC'lerde LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) veya Id2'nin (shId2) 100 ng/mL FL ve 1 μM β-estradiol içeren eksiksiz bir ortamda kararlı tek devrilmesini sağlayın.</li>
	<li>Hücreleri peletmek için shLacZ, shTcf4 ve shId2 farklılaştırılmamış iHSPC'leri 15 mL'lik bir tüpe ve santrifüje 5 dakika boyunca 500 x g'da toplayın.</li>
	<li>Üstnatant atın ve hücreleri yıkamak için 10 mL PBS ekleyin. Bu adımı iki kez yineleyin.</li>
	<li>iHSPC hücrelerini 2 x 105 hücre/mL yoğunlukta, yalnızca 100 ng/mL FL içeren 1 mL'lik tam ortamda 12 kuyu plakasına yeniden depolayın ve tohumlayın.</li>
	<li>Üç gün sonra 100 ng/mL FL içeren 1 mL taze komple ortam ekleyin.</li>
	<li>İki gün sonra akış sitometrisine göre farklılaştırılmış hücreleri (shLacZ, shTcf4 ve shId2 iHSPC'ler) analiz edin.</li>
</ol>5. Farklılaştırılmış DC'lerin akış sitometrik analizi
<ol><li>Hücreleri plakada 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyarak 1,5 mL tüpler halinde toplayın ve oda sıcaklığında (RT) 500 x g'da 5 dakika santrifüjlayın. NOT: Tüp bebek farklılaştırılmış DC'ler plakalara hafifçe yapışır. Nazik pipetleme, DC'lerin plakalardan kurtarılmasına yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Süpernatant atın ve hücreleri 50 μL FACS arabelleğine yeniden atın. Ardından, 50 μL anti-CD16/32 hibridoma supernatant ekleyin ve buz üzerinde 5-10 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Fc blokaj antikor, bazı miyeloid hücreler ve B hücreleri üzerinde ifade eden Fc reseptörlerine antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önler ve çeşitli satıcılar aracılığıyla ticari olarak kullanılabilir.</li>
	<li>Floresan boya konjuge antikorları (her antikor için 0,04 μg) doğrudan hücrelere ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kullanılan antikorlar APC/cy7 anti-mouse CD11c, FITC anti-mouse CD11b ve PE anti-mouse B220'dir. NOT: pDC'ler CD11c+CD11b-B220+ ve cDC'ler CD11c+CD11b+B220- olarak tanımlanır.</li>
	<li>RT'de 500 x g'da 5 dakika boyunca 1 mL FACS tampon ve santrifüj ile hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 100 μL FACS tamponunda yeniden biriktirin ve akış sitometrisine göre analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Witmer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+dendritic+cells+are+potent+stimulators+of+the+primary+mixed+leukocyte+reaction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siglec-H+is+an+IPC-specific+receptor+that+modulates+type+I+IFN+secretion+through+DAP12%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12.</a> Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).</li>
<li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections%2C+autoimmunity%2C+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).</li>
<li>Liu, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPC%3A+Professional+Type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).</li>
<li>Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).</li>
<li>Durai, V., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functions of murine dendritic cells.</a> Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).</li>
<li>Mashayekhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+are+the+critical+source+of+interleukin-12+that+controls+acute+infection+by+Toxoplasma+gondii+tachyzoites%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites.</a> Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Plantinga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+and+monocyte-derived+CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+initiate+and+maintain+T+helper+2+cell-mediated+immunity+to+house+dust+mite+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen.</a> Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).</li>
<li>Persson, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription-factor-dependent+CD103%28%2B%29CD11b%28%2B%29+dendritic+cells+drive+mucosal+T+helper+17+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation.</a> Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).</li>
<li>Kumamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD301b%2B+dermal+dendritic+cells+drive+T+helper+2+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity.</a> Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).</li>
<li>Cisse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+E2-2+is+an+essential+and+specific+regulator+of+plasmacytoid+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development.</a> Cell. 135 (1), 37-48 (2008).</li>
<li>Grajkowska, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoform-specific+expression+and+feedback+regulation+of+E+protein+TCF4+control+dendritic+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification.</a> Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).</li>
<li>Jackson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+expression+delineates+differential+checkpoints+in+the+genetic+program+of+CD8%CE%B1%2B+and+CD103%2B+dendritic+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages.</a> The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+interferon+regulatory+factor+4+in+CD11bhighCD8alpha-+dendritic+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).</li>
<li>Rodrigues, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+lineages+contribute+to+the+heterogeneity+of+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells.</a> Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).</li>
<li>Brown, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+basis+of+mouse+and+human+dendritic+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity.</a> Cell. 179 (4), 846-863 (2019).</li>
<li>Redecke, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+lines+with+myeloid+and+lymphoid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential.</a> Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).</li>
<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polybrene+increases+the+efficiency+of+gene+transfer+by+lipofection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection.</a> Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).</li>
<li>Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+enhances+lipid-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer.</a> Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).</li>
<li>Kirkling, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+facilitates+in+vitro+generation+of+cross-presenting+classical+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells.</a> Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Control+of+Dendritic+Cell+Functions%3A+Digesting+Information%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information.</a> Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).</li>
<li>Saxton, R. A., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth%2C+metabolism%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth, metabolism, and disease.</a> Cell. 168 (6), 960-976 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Lentivirüs bazlı shRNA vektörleri genellikle hücrelere viral transdüksiyon ile gen susturma için kullanılır ve konak genomuna istikrarlı entegrasyona izin verilir. Bununla birlikte, farklı hücre tiplerinde çeşitli transdüksiyon verimliliğinin göz önünde bulundurulması gerekir ve bu sorunun üstesinden gelmek için bir dizi yaklaşımda olunmuştur. 
Polibren, hücre zarındaki yükleri nötralize edebilen ve böylece transdüksiyon20 sırasında viryonun hücrelere bağlanmasını artıran poliklama polimerdir....

DC'ler doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığın temel düzenleyicileridir1. DC'ler esas olarak işlevsel olarak farklı iki popülasyona, yani PDC'lere ve CDC'lere ayrılır. Ayrıca, cDC'ler iki alt kümeden oluşur, yani tip I ve tip II cDC'ler veya cDC1'ler ve cDC2'ler, sırasıyla2. farelerde BST2, Siglec-H ve orta düzey CD11c'yi ifade eden pDC'ler3,4, iltihaplanma ve viral enfeksiyon sırasında büyük miktarlarda IFN-I salgılayabilen hücrelerdir5. Sağlam IFN-I-üretim yetenekleri nedeniyle, sistemik lupus eritematozus (SLE)6 da dahil olmak üzere otoimmün hastalıkların ilerlemesinde kilit rol oynadıklarından şüphelenilmektedir. Fare7'de XCR1, CD8a, CLEC9A ve CD103'ün yüzey ekspresyözü ile tanımlanan cDC1'ler, sitotoksik CD8 + T hücrelerinin (CTL' ler) antijen çapraz sunumu yoluyla aktivasyonu ve polarizasyonu konusunda uzmanlaşmıştır, böylece hücre içi patojenlere ve kansere yanıt olarak tip I bağışıklığı başlatılır8,9. Öte yandan, hem insanlarda hem de farelerde CD11b ve CD172α'yı (Sirpα olarak da bilinir) ifade eden cDC2'ler, CD4 + T hücrelerini aktive edebilir ve alerjen ve parazitlere karşı tip II bağışıklık tepkisini teşvik edebilir10, ayrıca hücre dışı bakteriler ve mikrobiyota tanımayı takiben tip III bağışıklığı modüle edebilir11,12.
DC'lerin çeşitlendirilmesi, BM'deki hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC' ler) bir grup TF tarafından belirlenir. Buna karşılık, DNA bağlama 2 (ID2) inhibitörü cDC spesifikasyonunu yönlendirir ve E protein aktivitesini engelleyerek pDC gelişimini engeller15. Ayrıca, cDC1'lerin geliştirilmesi IRF8 ve BATF3 gerektirirken, cDC2'lerin farklılaşması IRF416'ya bağlıdır. Son çalışmalar pDC'lerin heterojenliğini, CDC'leri17 ve cDC'leri ve transkripsiyonsal düzenlemelerini araştırdı18. DC ağının karmaşıklığı nedeniyle, DC'lerin gelişimini ve işlevselliğini kontrol eden diğer TF'leri tanımlamak için karşılanmamış bir platform kurma ihtiyacı vardır.
Burada, BM hücrelerinde (Hoxb8-FL hücreleri olarak da adlandırılır) Hoxb8'in östrojenle düzenlenmiş nükleer translokasyonunun ifade edildiği bir iHSPC kullandık 19. iHSPC'ler β-estradiol ve Flt3 ligand (FL) varlığında çoğalabilir ve farklılaşmamış bir aşamada kalabilirken, β-estradiol19'un çekilmesiyle FL'nin varlığında farklı DC türlerine farklılaşmaya başlarlar. Bu özelliğe dayanarak, progenitör aşamasında ilgi genlerini devirebilir, ardından PDC'lerin ve CDC'lerin in vitro farklılaşması üzerindeki etkisini inceleyebiliriz. Bu nedenle, bu yöntem DC'lerin gelişimini ve işlevini düzenleyen genleri keşfetmek için güçlü bir araçtır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>APC / Cy7 anti-fare CD11c Antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>117324</td> <td>(Klon: N418)</td></tr> <tr><td>FITC anti-fare / insan CD11b Antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>101206</td> <td>(Klon: M1 / 70)</td></tr> <tr><td>PE anti-fare / insan B220 Antikoru Biolegend</td><td></td><td>103208</td> <td>(Klon: RA3-6B2)</td></tr> <tr><td><güçlü > Hücre kültürü</ güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Mikro tüp</td><td>&nbsp; ExtraGene</td><td>TUBE-170-C</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plaka</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 orta</td><td>gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Reaktif< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>beta; -estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758-250MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol (&beta;-ME)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>FACS tamponu</td><td>ev yapımı</td><td></td><td>Formül: 1xPBS+%0.5 FBS+%0.1 NaN<>sub3</td></tr><tr><td>Flt3 ligand (FL)</td><td>ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIsure BIOLINE</td><td></td><td>BIO-38032</td><td></td></tr><tr><td>shRNA (Taregt dizisi/klon kimliği)</td><td>Şirket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shId2&nbsp; (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)</td><td>RNAi Konsorsiyumu (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)</td><td>RNAi Konsorsiyumu (TRC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)</td><td>RNAi Konsorsiyumu (TRC)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hematopoetik kök ve progenitör hücre hattı in vitrounda kısa saç tokası rna aracılı gen knockdown ile dendritik hücre gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Study of Dendritic Cell Development by Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in a Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Line In vitro

Dendritik hücreler (DC' ler), doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtları birbirine bağlayan önemli antijen sunan hücrelerdir. DC'ler heterojendir ve geleneksel DC'lere (cDC' ler) ve plazmasikoid DC'lere (PDC'ler) ayrılabilir. cDC'ler naif T hücrelerine antijen sunma ve etkinleştirme konusunda uzmanlaşmıştır. Öte yandan, pDC'ler viral enfeksiyon sırasında büyük miktarlarda I tipi interferonlar (IFN-I) üretebilir. DC spesifikasyonu, kemik iliğindeki (BM) DC atalarının erken bir aşamasında ortaya çıkar ve transkripsiyon faktörleri (TF' ler) ağı ile tanımlanır. Örneğin, cDC'ler ID2'yi yüksek oranda ifade ederken, pDC'ler E2-2'yi yüksek oranda ifade ediyor. Giderek daha fazla DC alt kümesi tanımlandığından, DC gelişimini kontrol eden belirli TF'leri anlamaya yönelik artan bir ilgi vardır. Burada, kısa saç tokası RNA 'sı (shRNA) taşıyan lentivirüsü ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (iHSPC' ler) hattına ulaştırarak DC'lerin farklılaşması için kritik öneme sahip TF'leri taramak için bir yöntem oluşturuyoruz. Seçim ve in vitro farklılaşmadan sonra, kararlı devirme hücre hatlarının cDC ve pDC potansiyeli akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu yaklaşım, potansiyel olarak DC kaderlerini yöneten genleri in vitro atalarından tanımlamak için bir platform sağlar.

Lentiviral vektör pLKO.1-Puro haritası gösterilmiştir (Şekil 1). LacZ (hedeflenmeyen bir kontrol), Tcf4 ve ID2'ye karşı shRNA'yı ifade eden lentivirüs'ün iHSPC'lerde teslim edildikten sonra, RT-qPCR tarafından onaylanan devirme verimliliği, ShLacZ iHSPC'lere kıyasla Tcf4 iHSPC'lerde Tcf4 ifadesinin azaldığını ortaya koydu (Şekil 2A). Öte yandan, shLacZ iHSPC'ler kontrolüne kıyasla shId2 iHS...

Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Dendritic cells (DCs) are important antigen-presenting cells that connect innate and adaptive immune responses. DCs are heterogeneous and can be divided ...

Dendritik hücreler veya DC'ler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık sistemini birbirine bağlayan temel bağışıklık hücreleridir. DC'ler heterojen olsa da, bu yöntem transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere hangi genlerin DC gelişimini düzenleyebileceğini anlamamıza yardımcı olur. Bu teknik, DC gelişimini kontrol eden bir geni progenitör in vitrolarından tanımlamak için basit ve hızlı bir yol sağlar.Başlamak için, ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri veya iHSPC'leri, FLT3 ligandının mililitresi başına 100 nanogram ve bir mikromoler beta estradiol ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında koruyun. Lentiviral transdüksiyon için, iHSPC'leri kuyu başına beşinci hücrelere bir kez 10 ve FLT3 ligand, beta estradiol ve polibren içeren bir mililitre tam ortam yoğunluğunda 12 kuyu plakasında plakalayın. Daha sonra, 100'lük çok miktarda enfeksiyonda her kuyuda kısa saç tokası RNA'sını taşıyan lentivirüs ekleyin.Daha sonra, plakayı 1100 kez g ve 37 santigrat derecede 90 dakika döndürün, ardından enfekte hücreleri bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, hücreleri santrifüjlemede 15 mililitre tüpe toplayarak polibreni çıkarın, medyayı FLT3 ligand ve beta estradiol içeren taze komple ortamla değiştirdikten sonra. Ek 24 saat sonra, enfekte hücreleri seçmek için ortama mililitre puromisicin başına altı mikrogram ekleyin.Seçim ortamını her üç günde bir değiştirin ve hücreleri en az bir hafta boyunca muhafaza ederek, saplı bir şekilde transdüklenmiş iHSPC'leri genişletin. LACZ, Tcf4 ve Id2 için FLT3 ligand ve beta estradiol ile birlikte eksiksiz bir ortamda kararlı nakavt iHSPC'leri oluşturun ve koruyun. İn vitro farklılaşmayı başlatmak için farklılaşmamış iHSPC'leri 15 mililitre tüpler halinde toplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri sadece FLT3 ligini içeren tam bir ortamda yeniden depolayın ve daha sonra mililitre başına 12 kuyu plakasına mililitre başına iki kez 10 ila beşinci satış yoğunluğunda tohumlayın. Üç gün sonra, FLT3 ligandını içeren bir mililitre taze tam ortam ekleyin.Ek iki gün sonra, farklılaştırılmış hücreleri akış sitometrisine göre analiz etmeye devam edin. Akış sitometrik analizi için, hücreleri plakada iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetlayın, ardından hücreleri 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri santrifüj edin ve hücreleri 50 mikrolitre faks arabelleği içinde yeniden canlandırmadan önce üst kapağı atın.Ardından, 32 hibridoma süpernatant tarafından 50 mikrolitre anti-CD16 ekleyin ve buz üzerinde beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan boya konjuge antikorları doğrudan hücrelere ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre faks arabelleğiyle yıkayın ve örneği santrifüj edin.Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 100 mikrolitre faks arabelleğine yeniden ayırın ve örnekleri akış sitometrisine göre analiz edin. iHSPCS'de LacZ, Tcf4 ve Id2'nin kısa saç tokası RNA aracılı nakavtlarından sonra, RTQ-PCR tarafından nakavt verimliliğinin onaylanması, Tcf4 ve Tcf4 nakavt iHSPC'lerinin ifadesinin LacZ knockdown iHSPC'lerdekine kıyasla azaldığını gösterdi. Benzer sonuçlar Id2 knockdown iHSPC'lerinde Id2 ifadesi için de gözlenmiştir.LacZ nakavt iHSPC'leri beş gün boyunca kült ettikten sonra, dendritik hücre popülasyonu temsil eden CD11c pozitif hücrelerin sıklığı% 95 civarındaydı, Ancak Tcf4 veya Id2'yi devirmek CD11c pozitif dendritik hücrelerin neslini biraz azalttı. LacZ nakavt iHSPC'lerinden elde edilen CD11c pozitif dendritik hücrelerin daha fazla analizi, %70'inin geleneksel dendritik hücreler, %22'sinin ise plazmasikoid dendritik hücreler olduğunu ortaya koydu. Tcf4 nakavt iHSPC'leri, LacZ nakavtının kontrol ettiği plazmasikoid dendritik hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir yüzdesini oluşturdu.Buna karşılık, Id2 nakavt iHSPC'leri LacZ devirme kontrollerinden önemli ölçüde daha düşük bir konvansiyonel dendritik hücre yüzdesi, ancak plazmasikoid dendritik hücrelerin daha yüksek bir yüzdesini oluşturdu. Spin enfeksiyonları lentivirüs taşıyan shRNA'nın iHSPC'lere transdüksiyon verimliliğini arttırır. Bu teknik transkripsiyon faktörlerinin rolünü ele almak ve DC gelişiminde rol alması muhtemel sitokin sinyal transdüksiyon veya metabolizmada diğer genlerin çalışmasını kolaylaştırır.

study-dendritic-cell-development-short-hairpin-rna-mediated-gene

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Bu videoda, ölümsüzleştirilmiş hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (iHSPC'ler) stabil knockdown hücre hatları elde etmek için shRNA lentiviral vektörlerinin transdüksiyonunu gerçekleştirmek için bir yöntem gösteriyoruz.

İn Vitro iHSPC'lerde Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Yıkımı: Spesifik Gen Ekspresyonunun Yıkılması için iHSPC'lere Lentivirus Tabanlı Bir shRNA Ekspresyon Sistemi Teslimatı

Bu videoda, yaygın lenfoid progenitör hücrelerden (CLP'ler) plazmositoid dendritik hücreler (pDC'ler) oluşturmak için bir in vitro test gösterilmektedir. Saflaştırılmış CLP'lerin Fms benzeri tirozin kinaz-3 ligandı (FL) varlığında γ ışınlanmış besleyici hücrelerle birlikte kültürlenmesi üzerine, CLP'ler, varlığı akış sitometrisi kullanılarak doğrulanan yapışmayan pDC'lere farklılaşır.

Ortak Lenfoid Progenitörlerden Plazmasitoid Dendritik Hücrelerin İn Vitro Üretimi

Bu protokol, FACS-aracılı hücre izolasyon hidrodinamik gen transferi, ve Peyer yama bağışıklık alt-akışı analizi içeren teknikleri kullanarak, ortak bir dendritik hücre progenitörlerinden Peyer yama plazmasitoid dendritik hücrelerin farklılaşmasını değerlendirmek için deneysel prosedürler açıklanmaktadır.

Hematopoetik progenitörlerin Evlatlık Transferi kullanarak Peter Parçacıklannda Murin plazmasitoid dendritik hücreleri Gelişimini değerlendirilmesi

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

RNA-sıralama ve biyoinformatik analizler fare EMLcells Lin-CD34 + ve Lin-CD34 alt gruplarda anlamlı ve farklı şekilde ifade transkripsiyon faktörleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu transkripsiyon faktörleri kendini sürekli yenileyen Lin-CD34 + ve kısmen farklılaşmış Lin-CD34 hücreleri arasındaki geçiş belirlenmesinde önemli rol oynayabileceğine.

RNA dizileme Analizi ile EML Hematopoetik Öncü Hücreler Self-yenileme ve farklılaşma Düzenlenmesi Anahtar Faktörler belirlenmesi

Bu çalışmada, Flt3 ligandı varlığında ortak lenfoid progenitörleri AC-6 besleyici hücrelerle birlikte kültürleyerek verimli bir şekilde pDC üretebilen bir in vitro kültür sistemi sunuyoruz.

AC-6 Besleyici Sistemi kullanılarak Ortak Lenfoid progenitörlerin dan Fare plazmositoid dendritik hücreler İn Vitro Nesil

Öğrenin, lentiviral transdüksiyon ve shRNA ile dendritik hücre gelişimini inceleyin. Bu yöntem, iHSPC'lerden kararlı knockdown hücre hatları oluşturarak immünolojide gen düzenlemesini araştırmanıza olanak tanır.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması (Video) | JoVE Journal

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Daha fazla video keşfet