Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması
7 Mart 2022
Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.
Dendritik hücreler veya DC'ler, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık sistemini birbirine bağlayan temel bağışıklık hücreleridir. DC'ler heterojen olsa da, bu yöntem transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere hangi genlerin DC gelişimini düzenleyebileceğini anlamamıza yardımcı olur. Bu teknik, DC gelişimini kontrol eden bir geni progenitör in vitrolarından tanımlamak için basit ve hızlı bir yol sağlar.
Başlamak için, ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri veya iHSPC'leri, FLT3 ligandının mililitresi başına 100 nanogram ve bir mikromoler beta estradiol ile desteklenmiş tam RPMI 1640 ortamında koruyun. Lentiviral transdüksiyon için, iHSPC'leri kuyu başına beşinci hücrelere bir kez 10 ve FLT3 ligand, beta estradiol ve polibren içeren bir mililitre tam ortam yoğunluğunda 12 kuyu plakasında plakalayın. Daha sonra, 100'lük çok miktarda enfeksiyonda her kuyuda kısa saç tokası RNA'sını taşıyan lentivirüs ekleyin.
Daha sonra, plakayı 1100 kez g ve 37 santigrat derecede 90 dakika döndürün, ardından enfekte hücreleri bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Ertesi gün, hücreleri santrifüjlemede 15 mililitre tüpe toplayarak polibreni çıkarın, medyayı FLT3 ligand ve beta estradiol içeren taze komple ortamla değiştirdikten sonra. Ek 24 saat sonra, enfekte hücreleri seçmek için ortama mililitre puromisicin başına altı mikrogram ekleyin.
Seçim ortamını her üç günde bir değiştirin ve hücreleri en az bir hafta boyunca muhafaza ederek, saplı bir şekilde transdüklenmiş iHSPC'leri genişletin. LACZ, Tcf4 ve Id2 için FLT3 ligand ve beta estradiol ile birlikte eksiksiz bir ortamda kararlı nakavt iHSPC'leri oluşturun ve koruyun. İn vitro farklılaşmayı başlatmak için farklılaşmamış iHSPC'leri 15 mililitre tüpler halinde toplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletlayın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücreleri sadece FLT3 ligini içeren tam bir ortamda yeniden depolayın ve daha sonra mililitre başına 12 kuyu plakasına mililitre başına iki kez 10 ila beşinci satış yoğunluğunda tohumlayın. Üç gün sonra, FLT3 ligandını içeren bir mililitre taze tam ortam ekleyin.
Ek iki gün sonra, farklılaştırılmış hücreleri akış sitometrisine göre analiz etmeye devam edin. Akış sitometrik analizi için, hücreleri plakada iki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetlayın, ardından hücreleri 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Tüpleri santrifüj edin ve hücreleri 50 mikrolitre faks arabelleği içinde yeniden canlandırmadan önce üst kapağı atın.
Ardından, 32 hibridoma süpernatant tarafından 50 mikrolitre anti-CD16 ekleyin ve buz üzerinde beş ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, floresan boya konjuge antikorları doğrudan hücrelere ekleyin ve karanlıkta buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra, hücreleri bir mililitre faks arabelleğiyle yıkayın ve örneği santrifüj edin.
Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 100 mikrolitre faks arabelleğine yeniden ayırın ve örnekleri akış sitometrisine göre analiz edin. iHSPCS'de LacZ, Tcf4 ve Id2'nin kısa saç tokası RNA aracılı nakavtlarından sonra, RTQ-PCR tarafından nakavt verimliliğinin onaylanması, Tcf4 ve Tcf4 nakavt iHSPC'lerinin ifadesinin LacZ knockdown iHSPC'lerdekine kıyasla azaldığını gösterdi. Benzer sonuçlar Id2 knockdown iHSPC'lerinde Id2 ifadesi için de gözlenmiştir.
LacZ nakavt iHSPC'leri beş gün boyunca kült ettikten sonra, dendritik hücre popülasyonu temsil eden CD11c pozitif hücrelerin sıklığı% 95 civarındaydı, Ancak Tcf4 veya Id2'yi devirmek CD11c pozitif dendritik hücrelerin neslini biraz azalttı. LacZ nakavt iHSPC'lerinden elde edilen CD11c pozitif dendritik hücrelerin daha fazla analizi, %70'inin geleneksel dendritik hücreler, %22'sinin ise plazmasikoid dendritik hücreler olduğunu ortaya koydu. Tcf4 nakavt iHSPC'leri, LacZ nakavtının kontrol ettiği plazmasikoid dendritik hücrelerin önemli ölçüde daha düşük bir yüzdesini oluşturdu.
Buna karşılık, Id2 nakavt iHSPC'leri LacZ devirme kontrollerinden önemli ölçüde daha düşük bir konvansiyonel dendritik hücre yüzdesi, ancak plazmasikoid dendritik hücrelerin daha yüksek bir yüzdesini oluşturdu. Spin enfeksiyonları lentivirüs taşıyan shRNA'nın iHSPC'lere transdüksiyon verimliliğini arttırır. Bu teknik transkripsiyon faktörlerinin rolünü ele almak ve DC gelişiminde rol alması muhtemel sitokin sinyal transdüksiyon veya metabolizmada diğer genlerin çalışmasını kolaylaştırır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, shRNA'nın lentiviral transdüksiyonu yoluyla dendritik hücre (DC) gelişimini etkileyen transkripsiyon faktörlerinin taranmasına yönelik bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, DC'lerin in vitro diferansiyasyonu için stabil knockdown hücre hatlarının oluşturulmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
- Transkripsiyonel Regülasyon
Arka Plan
- Dendritik hücreler, doğal ve adaptif bağışıklığın birbirine bağlanması için kritik öneme sahiptir.
- DC gelişiminin anlaşılması, bağışıklık yanıtlarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Bu çalışma, DC farklılaşmasını düzenleyen genlerin tanımlanmasına odaklanmaktadır.
- Yöntem, ölümsüzleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri kullanmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- DC gelişiminde transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol geliştirmek.
- Fonksiyonel çalışmalar için stabil knockdown hücre hatları oluşturmak.
- Progenitör hücrelerden DC'lerin in vitro diferansiyasyonunu kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- iHSPC'lerin tam RPMI 1640 besiyerinde sürdürülmesi.
- FLT3 ligandı ve beta estradiol ile destekleme.
- iHSPC'lerin shRNA ile lentiviral transdüksiyonu.
- Transdüksiyon verimliliğini artırmak için polybrene kullanımı.
Temel Sonuçlar
- Stabil knockdown hücre hatlarının başarıyla oluşturulması.
- DC gelişiminde rol oynayan transkripsiyon faktörlerinin belirlenmesi.
- In vitro diferansiyasyon kapasitelerinin gösterilmesi.
- İmmün hücre gelişiminin gen düzenlemesine ilişkin içgörüler.
Sonuçlar
- Protokol, DC gelişiminin incelenmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- İmmünolojideki temel düzenleyici genlerin belirlenmesi için kullanılabilir.
- Bu yaklaşım, immün yanıtların anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
Bu yöntem, dendritik hücre soy hattı belirlenmesinde transkripsiyon faktörü fonksiyonunun sistematik olarak sorgulanmasına olanak tanıyarak, immünoloji odaklı keşif programlarında hedef doğrulamayı destekler. Genetik perturbasyonu yeniden üretilebilir bir in vitro sistemdeki fenotipik çıktıya bağlayarak, erken evre hedef hipotezleri için mekanistik risk azaltma sağlar. Bu yaklaşım, kaynak yoğun öncü bileşik tanımlama çalışmalarından önce immünomodülatör hedeflerin önceliklendirilmesinde öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Dendritik hücre gelişiminde potansiyel terapötik hedefler olarak transkripsiyon faktörlerinin fonksiyonel sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: Ölümsüzleştirilmiş hematopoetik progenitörlerde lentiviral shRNA iletimini kullanarak knockdown taraması için ölçeklenebilir bir platform sunar.
- Öngörücü Değer: Hedef modülasyonunu dendritik hücre alt kümesi çıktısıyla ilişkilendirerek, soy sapması verilerine dayalı karar verme süreçlerini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Transkripsiyon faktörü nakavt sonrası CD11c-pozitif hücrelerin ve alt küme dağılımının (cDC'ye karşı pDC) kantitatif akış sitometrisi okumalarını oluşturur.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış sitokin koşulları (FLT3 ligandı, beta estradiol) ve puromisin aracılığıyla seçim içeren standartlaştırılmış bir diferansiyasyon analizi kurar.
- Analiz Hazırlığı: Bileşik tarama veya yolak modülasyon çalışmalarında tekrarlı kullanıma uygun stabil nakavt hücre hatları üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Progenitörlerden erken dendritik hücre spesifikasyonunu modeller ve transkripsiyon faktörü ağlarıyla bağlantılı biyobelirteç stratejileri hakkında bilgi sağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Konvansiyonel dendritik hücre kaderinin desteklenmesinde Id2'nin ve plazmasitoid dendritik hücre gelişiminin desteklenmesinde Tcf4'ün rolunu netleştirir.
- Preklinik Uyum: Aşı adjuvanı veya otoimmünite programları ile ilgili olan immün hücre farklılaşmasını etkileyen hedeflerin değerlendirilmesini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, keşif biyolojisi aşamasına uygun olup, lider bileşik tanımlama için assay geliştirme öncesinde hedef hipotez testlerinin yapılmasına olanak tanır ve elde edilen veriler, immünomodülasyondaki preklinik aday seçimini bilgilendirir.
- Keşif Biyolojisi: Hematopoetik öncüllerden dendritik hücre soy hattı belirlemesini yöneten transkripsiyonel düzenleyicilerin mekanistik analizini destekler.
- Deney Geliştirme: Diferansiyasyon verimliliğini ve alt küme dağılımını izlemek için tekrarlanabilir, kantitatif immünofloresan ve akış sitometrisi uç noktaları oluşturur.
- Analitikler: Knockdown koşulları arasında karşılaştırmaya olanak tanıyan ve hedef etkisinin istatistiksel değerlendirmesini destekleyen ölçülebilir okumalar (CD11c+, cDC, pDC yüzdesi) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Erken öncül diferansiyasyonunu, enfeksiyon veya tolerans durumlarındaki yanıtların modellenmesi için ilgili olan alt immün fonksiyonlarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Sitokin sinyali, metabolizma veya dendritik hücre gelişimini etkileyen transkripsiyonel ağlarda ek genlerin taranması için yeniden kullanılabilir bir platform kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Transkripsiyon faktörü nakavtunu, dendritik hücre alt kümesi oluşumundaki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek hedef doğrulama güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış besiyeri koşulları ve seçilim belirteçleri aracılığıyla, laboratuvarlar arasında diferansiyasyon ve okuma protokollerinin standartlaştırılmasını sağlar.
- Stratejik Değer: Soy hattına özgü etkilerin erken fonksiyonel kanıtlarını sunarak, immünomodülatör hedef seçimindeki biyolojik riski azaltır.
- Portföy Etkisi: Hedeflerin dendritik hücre kader kararları üzerindeki etkilerine dayanarak risk ayarlı önceliklendirmeye bilgi sağlar ve verimli kaynak tahsisini destekler.
Uygulama Hususları
- Lentiviral transdüksiyon, hematopoetik hücre kültürü ve akış sitometrisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Lentiviral shRNA kütüphanelerine, puromisin seçimine ve sitokin takviyeli besiyerlerine (FLT3 ligandı, beta estradiol) erişime bağlıdır.
- Stabil nakavt oluşumu için transdüksiyon verimliliğinin (örneğin, spin enfeksiyonu yoluyla) ve seçilim süresinin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Akış sitometrisi ile dendritik hücre alt kümelerinin doğru tanımlanması için diferansiyasyon zamanlamasının ve antikor panellerinin optimizasyonunu içerir.
- In vitro modelleme ile sınırlıdır; bulguların translasyonel geçerlilik için primer insan veya fare sistemlerinde doğrulanması gerekir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
