Büyük Ölçekli Multi-omik Genom Çapında İlişkilendirme Çalışmaları (Mo-GWAS): Numune Hazırlama ve Normalleştirme Kılavuzları

Daha büyük popülasyonu araştırmak, doğal çeşitlilikten kaynaklanan gerçek varyasyon olan makine güdümlü bir varyasyonla birlikte gelir. Burada, aşağı akış entegrasyon analizi için teknik çeşitliliği azaltmaya yönelik bir yöntem gösteriyoruz. Bu tekniğin avantajları, ilgili analitik platformda çeşitli metabolitlerin analizini sağlarken, sistemik hatayı ortadan kaldırırken ve biyolojik varyansı korurken, yüz ayırma tabanlı bir ekstraksiyonu içerir.

Genotipik ve fenotipik bilgi elde edildikten sonra, bu yöntem herhangi bir yaşam krallığındaki herhangi bir farklı doğal popülasyona uygulanabilir. 20 mililitrelik hasat tüpleri almaya başlamak için, tüpleri homojenize etmek ve etiketlemek için iki adet beş milimetre ve iki adet sekiz milimetre çapında metal boncuk ekleyin. Ardından, taze yaprak ve kök dokusu örneklerini flaş dondurma yoluyla sıvı azotta hasat ettikten hemen sonra sıvı azotla bir dewar doldurun.

Hasat edilen biyolojik numuneleri daha fazla işlem için 80 santigrat derecede saklayın. Tüp tutucuları sıvı azotla önceden soğutun. Daha sonra, homojen bir toz elde etmek için dokuları bir dakika boyunca 25 hertz'de öğütün.

Doku homojen bir şekilde öğütülmemişse dondurmayı ve taşlamayı tekrarlayın. 50 miligram taze bitki malzemesini, tartım işlemi sırasında bitki malzemesinin donmuş kalmasını sağlamak için önceden soğutulmuş etiketli iki milimetre güvenli kilitli mikrosantrifüj tüplerinde tartın. Numunenin 1 ila 50 miligram alikotu olan bir mililitre önceden soğutulmuş ekstraksiyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde tutmadan önce tüpü kısa bir süre vorteksleyin.

Örnekleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 kez G'de bir yörüngesel çalkalayıcıda inkübe edin, ardından 10 dakika boyunca buz soğutmalı bir sonikasyon banyosunda sonikasyon yapın. Numunelere 500 mikrolitre ekstraksiyon karışımı eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve ekstraktları kısa bir girdap ile karıştırın, ardından karışımı dört santigrat derecede 5 dakika boyunca 11.200 kez G'de santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, ayrılmış üst lipit içeren fazın 500 mikrolitresini önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik güvenli kilitli mikrosantrifüj tüpüne aktarın, üst fazın geri kalanını çıkarın.

Ayrı olarak, 1,5 mililitrelik güvenli kilit mikrosantrifüj tüpleri, alt yarı kutupsal faz dört GCMS'nin 150 mikrolitresini ve yarı kutupsal faz dört U-H-P-L-C MS analizinin 300 mikrolitresini aktarır. Ekstrakte edilen tüm fraksiyonları ısıtmadan konsantre etmek ve kurutulmuş fraksiyonları 20 santigrat derecede saklamak için solvent buharlaşması için bir vakum yoğunlaştırıcı kullanın. Numuneyi ultra yüksek performansa hazırlamak için, sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisi veya H-P-L-C MS, kurutulmuş yarı kutupsal fraksiyonları 180 mikrolitre metanol ve su karışımında yeniden askıya alın.

Daha sonra yarı kutupsal fazı 2 dakika boyunca sonikleştirin, ardından bir dakika boyunca 11.200 kez G'de santrifüjleme yapın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantın 90 mikrolitresini bir cam şişeye aktarın ve ekstraktların iki mikrolitresini dökülen LCMS örneğine enjekte edin. Metabolit fraksiyonasyonunu, 40 santigrat derecede tutulan ters bir Faz C18 sütununda ve atık su A ve B'nin kademeli değişimleriyle dakikada 400 mikrolitrelik bir akış üzerinde gerçekleştirin, 102 1500 kütle / şarj oranı kütle aralığına sahip negatif iyonizasyon modunda test boş ve kalite kontrol numunelerinin kütle spektrumlarını elde edin.

Yarı kutupsal metabolit numuneleri için, negatif ve pozitif iyonizasyon modlarında veriye bağımlı tandem kütle spektrometrisinde havuzlanmış bir QC örneği çalıştırın. Ek açıklama için elde edilen kütle spektrumlarını kullanın. İç standardın dağılımını kontrol ederek veri kümesinin normalleştirilmesini gerçekleştirin.

Tek veya birden fazla dahili standardın sinyalini düzelterek verileri normalleştirin. Ardından, kromatogramdan elde edilen tepe yoğunluklarını tam numune ağırlığı üzerinden düzeltin. Çok partili seriler arasındaki yoğunluk sürüklenmesini düzeltmek için, R.Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları veya GWAS yapmadan önce, genotipik verileri% 5'ten daha az küçük alel frekansları ve% 10'dan fazla eksik bir oran için püskül kullanarak yerel olarak tahmin edilen dağılım grafiği düzgünleştirme gibi QC tabanlı düzeltme yöntemleri gerçekleştirin.

Bu, düşük frekanslı önyargıyı önleyecektir. Çevresel faktörlerden kaynaklanan önyargıyı ortadan kaldırmak için R paketi LME dördünü kullanın ve deneysel tekrarlar üzerinden normalleştirilmiş her özellik için en iyi doğrusal, tarafsız tahminleri veya blopları hesaplayın. R'deki rMVP paketiyle GWAS'yi gerçekleştirmek için her özelliğin bloplarını ayrı ayrı kullanın.Birkaç yaygın fasulye türündeki lipidomik veriler, farklı partilerden iki QC örneğinin ham baz tepe kromatogramlarına dayanarak gösterilir.

Bazı lipit sınıfları için sinyal yoğunluklarında bir değişiklik gözlendi. Sistemik hata, ham veriler üzerinde ana bileşen analizi yapıldığında daha belirgindi. Yerel olarak tahmin edilen dağılım grafiği yumuşatma da dahil olmak üzere normalleştirme prosedürü, QC örneklerinin kümelenmesine yol açtı.

Tek tek kümelere diseksiyon yapılırken, yedinci ve sekizinci gruptaki makine güdümlü hatalar, normalleştirmeden önce netleşti ve düzeltildi. GWAS için normalleştirilmiş ve dönüştürülmüş bireysel metabolomik kümeler kullanıldı ve çeşitli özellik belirteçleri ilişkilerinde bulundu. Temsili analizde, farklı bileşik sınıfları farklı renklerde vurgulanırken, çoklu bileşik sınıflarıyla ilişkili belirteçler en yakın geni ile gösterilir.

Veri normalleştirme ve dönüştürme en önemli adımlardan biridir. Sistemik hatayı düzeltmek için uygun düzeltmenin yapıldığından emin olun ve dağıtımda normalliği sağlayın. Analitik varyasyon için düzeltme yapılarak, metabolik korelasyon analizi ve karmaşık özelliklere ışık tutmak için fenomik verilere entegrasyon gibi çeşitli entegrasyon yaklaşımları gerçekleştirilebilir.