Malign Periferik Sinir Kılıfı Tümör Hücrelerinde Floks Alellerinin Ex vivo Ablasyonu ile Tümörigenezde Gen Fonksiyonlarının Tanımlanması
August 25th, 2021
Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli kaynaklı tümörlerde in vivo embriyonik öldürücü olan gen nakavtlarını gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz ve daha sonra nakavtın tümör büyümesi, proliferasyon, sağkalım, göç, invazyon ve transkriptom in vitro ve in vivo üzerindeki etkisini değerlendiriyoruz.
Bu protokol, embriyonik ölümcül gen nakavtının tümör büyüme rolünü incelemek için alternatif bir in vivo yöntem sunar. Bu yöntemin avantajı, normalde embriyonik ölümcül olan gen nakavtlarının, in vivo fonksiyon kaybı etkilerini incelemek için genetiği değiştirilmiş bir fare modelinden türetilen tümörlerde gerçekleştirilebilmesidir. Bu teknik, geleneksel gen nakavt fare modellerinden elde edilemeyen embriyonik esansiyel genlerin in vivo rolünün incelenmesini gerektiren hastalıklara uygulanabilir.
Hayvan modelinin oluşturulması zaman alır ve uygun rekombinasyonun sağlandığından emin olmak için adenoviral enfeksiyon için en uygun MOI'yi belirlemek için ampirik testler gereklidir. Başlangıç olarak, fareyi istenen genotiple tanımlayın. Tümör taşıyan bir fare insancıl son noktasına ulaştığında, fareyi ötenazi yapın ve tümörü çıkarmak için steril bir neşter bıçağı kullanın.
Formalin fiksasyon parafinin erken pasaj kültürü üretimini gömmesi ve analitik analizler için flaş dondurma için doku segmentlerini oluşturmak üzere bir neşter bıçağı kullanarak ekmek somunu tarzı kesimlerde tümörü üç bölüme ayırın. Hematoksilin ve eozin ile beş mikrometre kalınlığında formalin sabit, parafin gömülü doku bölümünü sabitleyin. Bir patolog tümörü doğruladıktan sonra, tümör tanısını doğrulamak için immünohistokimyasal boyama işlemini gerçekleştirin.
Yeni toplanan malign periferik sinir kılıfı tümör dokusunu buz üzerinde 10 mililitre buz gibi soğuk steril PBS'ye yerleştirin ve daha sonra erken geçiş kültürleri oluşturmak için steril bir çalışma alanına aktarın. Tümör dokusunu iki ila dört milimetrelik parçalara ayırın ve 10 mililitre büyüme ortamı içeren 10 santimetrekarelik işlenmiş bir doku kültürü kabında sekiz ila 10 kez tritüre edin. Bu dokuları yüksek glukozlu DMEM-10 büyüme ortamında 10 nanomolar neuregulin-1 beta ve iki mikromolar forskolin ile desteklenmiş olarak kültüre alın.
DMEM-10 büyüme ortamı içeren 10 santimetrekarelik işlenmiş doku kültürü kabı başına 1.5 kat 10 ila 10 yoğunlukta erken paslanmış tümör hücrelerini altıncı hücrelere tohumlayın. 12 ila 16 saat sonra, yapışkan kültürleri iki ila dört mililitre DPBS ile yıkayın ve hücreleri 10 mililitre serumsuz DMEM'de hücre başına yaklaşık 400 plak oluşturan birimde adenovirüs ile enfekte edin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, yaklaşık% 50 ila% 100 pozitif hücrelerle etkili enfeksiyon sağlamak için floresan mikroskobunda EGFP sinyali için hücreleri kısaca kontrol edin ve ardından FACS, EGFP pozitif enfekte olmuş hücreleri sıralar.
FACS sıralamadan sonra, hücrelerin bir doku kültürü inkübatöründe en az 24 ila 48 saat iyileşmesine izin verin ve daha sonra hücreleri in vitro hücre bazlı analizler veya in vivo aşılama için hazırlayın. Sıralanmış EGFP-pozitif hücrelerin bir kısmından izole edilen genomik DNA kullanarak PCR gerçekleştirerek Erbb4 delesyonunu onaylayın. Proliferasyon testlerini, görüntü tabanlı otomatik bir sitometre kullanarak 96 kuyucuklu bir plakaya kaplanmış sıralanmış tümör hücreleri üzerinde önümüzdeki yedi gün boyunca gerçekleştirin.
Hücreleri kancalar ve propidiyum iyodür boyaları ile lekeleyin ve her bir kuyucuktaki canlı ve ölü hücrelerin sayısını saymak için otomatik bir plaka okuyucu kullanarak hücrelerin görüntülerini yakalayın. Standart asit guanidinyum fenol ve kloroform bazlı yöntem kullanarak total RNA'yı sıralanmış tümör hücrelerinden izole edin. Varsayılan ayarları kullanarak programa özgü adımları izleyerek RNA dizisi hizalamasını gerçekleştirmek için yazılımı açın.
RNA araması analiz yöntemini seçin ve ardından fare referans genomunu seçin. Sıralama çekirdeği tarafından sağlanmışsa BED dosyasını yükleyin. FASTQ sıralama dosyalarını yükleyin ve dosyalara benzersiz çoğaltma adları atayın.
Grup FASTQ dosyalarını çoğaltır ve dosyaları bir çoğaltma kümesine atayın. İstatistiksel ve normalizasyon analizinin güçlü istatistiksel güce sahip diferansiyel gen ekspresyon sinyallerini tanımlaması için, analiz yazılımını açın ve GFP FASTQ dosyalarını kontrol veri seti olarak seçin. Ardından, istatistiksel ve normalleştirme yöntemi olarak DESeq2'yi seçin ve derleme ve analizi başlatın.
Erbb4 gen kaybının biyolojik ve yol önemini belirlemek için tanımlanmış istatistiksel olarak anlamlı Erbb4 aracılı DEG üzerinde fonksiyonel zenginleştirme analizini gerçekleştirmek için açık erişimli fonksiyonel zenginleştirme analizi araçlarına entegre gen ontolojisi veri setlerini kullanın. Enfekte olmuş hücrelerde in vivo allogreft büyüme potansiyelini değerlendirmek için tümör hücrelerini anestezi uygulanan farenin siyatik sinirine enjekte edin. Tümör gerekli boyuta ulaştığında, tümörü daha önce gösterildiği gibi ötenazi yapılmış bir fareden iki-üç bölümde diseke edin.
Bir doku bölümünü gece boyunca% 4 Paraformaldehit'e sabitleyin ve ardından sabit bölümü parafine yerleştirin. FFPE dokusundan beş mikrometre kalınlığında kesitler yaptıktan sonra, bölümü slaytlara monte edin ve daha önce gösterildiği gibi H&E ve immün boyama kullanarak aşılanmış dokudaki tümör hücrelerinin varlığını doğrulayın. İki deneysel durum arasındaki in vivo Erbb4 ekspresyon farklılıklarını doğrulamak için, formalin sabit, parafin gömülü dokuyu Erbb4'e özgü antikorlarla boyayın.
Malign periferik sinir kılıfı tümör doku hücrelerinin adenovirüs ile transdüksiyonu analiz edildi. EGFP eksprese eden hücreler floresan mikroskopi kullanılarak tespit edildi ve faz-kontrast mikroskobu kullanılarak toplam hücre sayısı belirlendi. Cre-mediated gen ablasyonundan sonra, transfeksiyon etkinliğine bağlı olarak, PCR genotiplemesi, kontrol transdüksiyonuna kıyasla tam bir gen nakavtı ve indüklenmiş ve indüklenmemiş hücrelerin heterojen bir popülasyonunu gösterdi.
Malign periferik sinir kılıfı tümör dokularının ortotopik allogreftlerinde bulunan karakteristik histopatoloji, orijinal genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinden türetilen tümörlere kıyasla hücre morfolojisinde farklılık göstermiştir. Erbb4 ablasyonu, adeno5-CMV-Cre-ablated hücrelerde hücresel yoğunluğu ve hücresel proliferasyonu azalttı ve adeno5-CMV-GFP ile transdüke olmuş hücreleri kontrol etti. Adeno5-CMV-Cre veya EGFP virüsü ile transdüe edilen tümör hücrelerinde Erbb4 ekspresyonu, adeno5-CMV-Cre transdüe allogreftlerde kontrol adeno5-CMV-EGFP ile tedavi edilen allogreft tümörlere kıyasla azalmıştır.
Vasküler yoğunluk, CD31 için immünoreaktivite tespiti ile değerlendirildi ve temsili sonuçlar, adeno5-CMV-Cre-transdüe edilmiş hücrelerin allogreftlerinde, kontrol adeno5-CMV-EGFP ile transdüke hücrelere kıyasla belirgin şekilde azalmış vasküler yoğunluk gösterdi. Gen ablasyonundan sonra, hücreler proliferasyon, göç, 3D büyüme veya mikroçevre değişiklikleri gibi birçok farklı hücre bazlı tahlil türü için ve ayrıca in vivo ortotopik enjeksiyonlar için kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, embriyonik ölümcül gen nakavtlarının tümör büyümesindeki rolünü incelemek için in vivo bir yöntem sağlar. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri kullanarak, araştırmacılar bu nakavtların tümör özellikleri üzerindeki etkilerini araştırabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Onkoloji
- Genetik
Arka Plan
- Gen nakavtları tipik olarak embriyonik ölümcüldür.
- Bu genleri tümörlerde incelemek, geleneksel modellerden elde edilemeyen bilgiler sunar.
- Adenovirüs enfeksiyonunu rekombinasyon için optimize etmek için ampirik testler gereklidir.
- Hayvan modelleri, istenen genotiplere dayalı olarak dikkatli seçim gerektirir.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonic ölümcül gen nakavtlarının tümör büyümesi üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- İşlev kaybı etkilerini in vivo olarak keşfetmek.
- Hastalık bağlamlarında temel genleri incelemek için bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İstenen genotipte farenin tanımlanması.
- Tümör taşıyan farelerin insancıl uç noktalarda ötanazi yapılması.
- Analizler için tümörlerin çıkarılması için steril tekniklerin kullanılması.
- Nakavt sonrası tümör büyümesi, çoğalması ve diğer özelliklerin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Tümörlerde embriyonik ölümcül gen nakavtlarının incelenmesinin fizibilitesini göstermiştir.
- Tümör davranışı ve gen fonksiyonu hakkında bilgiler sağlamıştır.
- Genetiği değiştirilmiş fare modellerinin kullanımının avantajlarını vurgulamıştır.
- Hastalık mekanizmalarını anlamak için potansiyel uygulamaları göstermiştir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, temel genlerin in vivo olarak incelenmesine izin verir.
- Tümör biyolojisinde araştırma için yeni yollar açar.
- Gelecekteki çalışmalar bu protokol üzerine inşa ederek çeşitli genetik faktörleri keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical bottleneck in target validation: the inability to study embryonic lethal genes in traditional knockout models. By enabling conditional ablation in short-term tumor cultures derived from GEM models, it provides a renewable, low-passage system for de-risking therapeutic targets in solid tumors. The approach supports mechanistic interrogation of gene function in migration, invasion, metastasis, and secretome-mediated communication, directly informing go/no-go decisions in oncology target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of embryonic lethal genes as therapeutic targets in MPNST and related solid tumors.
- Operational Value: Provides a renewable source of low-passage tumor-derived cells with reduced in vitro growth artifacts for consistent target interrogation.
- Predictive Value: Supports assessment of gene ablation effects on proliferation, viability, transcriptome, and orthotopic allograft growth to inform target confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified, EGFP-sorted tumor cells amenable to proliferation, migration, 3D growth, and microenvironment assays.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of cellular proliferation via image-based cytometry and viability via propidium iodide staining for assay standardization.
- Transcriptomic Screening: Facilitates RNA-seq and DESeq2 analysis to identify differentially expressed genes and pathway-level consequences of target ablation.
Translational & Preclinical Research
- In Vivo Validation: Supports orthotopic allograft growth assessment in immunocompromised mice to evaluate tumor growth potential post-ablation.
- Microenvironment Analysis: Permits quantification of vascular density via CD31 immunostaining to assess angiogenic dependencies of the targeted gene.
- Secretome Interrogation: Enables study of intercellular communication and metastasis-related phenotypes in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, particularly for targets where conventional knockout is embryonically lethal. It bridges in vitro mechanistic studies with in vivo functional validation in a physiologically relevant tumor context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis interrogation of gene function in tumorigenesis via ablation of floxed alleles in primary tumor cells.
- Screening: Enables standardized, reproducible cellular assays (proliferation, viability) using FACS-purified, virus-transduced tumor cells.
- Analytics: Generates quantitative molecular and phenotypic readouts including PCR-confirmed knockout, RNA-seq differential expression, and functional enrichment of Erbb4-mediated DEGs.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo allograft models, enabling assessment of tumor growth, cellular density, and vascularization.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any embryonic lethal gene in MPNST or analogous tumor models via adenoviral Cre delivery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling loss-of-function studies of essential genes in a tumor-specific context.
- Operational Value: Standardizes tumor dissociation, culture, viral transduction, and FACS purification for reproducible target validation workflows.
- Strategic Value: Improves target prioritization by providing direct evidence of gene function in tumor proliferation, survival, and microenvironment modulation.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by validating targets in a disease-relevant, genetically defined model system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in GEM model handling, tumor dissection, and aseptic tissue culture techniques.
- Dependent on access to fluorescence microscopy, FACS sorting, and automated cytometry for infection efficiency and proliferation analysis.
- Necessitates molecular biology capabilities for genomic DNA isolation, PCR genotyping, and RNA extraction for downstream transcriptomics.
- Requires bioinformatics support for RNA-seq alignment, DESeq2 normalization, and functional enrichment analysis using gene ontology tools.
- Limited to tumors derived from appropriate GEM models; success depends on empirical optimization of adenoviral MOI for efficient Cre-mediated recombination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:52
Tumor Dissection and Staining
1:46
Ex Vivo Ablation of Floxed Erbb4 Alleles in MPNST Cells
3:52
Proliferation Assays in MPNST Cells with Ablated Erbb4 Alleles
4:23
RNA-Seq Analyses and Gene Identification with Altered Expression by Erbb4 Loss
6:04
Orthotopic Allograft of MPNST Cells with Ablated Erbb4 Alleles and Erbb4 Ablation Effects Analysis
7:10
Results: Effect of Adenovirus Transduction on MPNST Cells and Allografts
9:09
Conclusion
