Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları
July 21st, 2021
Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.
Refakatçi-cochaperone etkileşimlerini incelemek için homojen boncuk bazlı bir test yaptık. Bu tekniği kullanarak, Hsp90 ve FKDP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimleri engelleyen küçük molekülleri tarar ve güçlü ve seçici inhibitörleri tanımlarız. Bu yüksek verimli eleme tekniği sağlam ve güvenilirdir.
Sonuçlar bir saat içinde elde edilebilir ve sadece az miktarda boncuk proteini ve bileşikleri gerektirir. Bu cochaperones ile Hsp90 etkileşimi Alzheimer hastalığı, Kanser, Otoimmün hastalık gibi insan hastalıklarına karıştı. Bu teknik, tıbbi önemi yüksek olan refakatçi-cochaperone inhibitörlerini tarama fırsatı sağlar.
İşte bu tahlilin temel prensibi. Hsp90C-Terminal peptid ile cochaperones'un TPR etki alanı arasındaki etkileşim donör ve alıcı boncukları yakınlığa getirdiğinde, oldukça güçlendirilmiş bir sinyal üretilir. Etkileşim inhibitörleri eklendiğinde donör ve alıcı boncuklar yakınlığa ulaşamaz ve tespit edilebilir bir sinyal üretilmez.
PBS'deki Hsp90 peptidi mililitre konsantrasyonunda bir miligramda seyrelterek başlayın. Yargısız kabul eden boncukları PBS'de seyreltin ve boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Seyreltilmiş boncukları yıkamak için santrifüj edin ve ardından süpernatantı dikkatlice çıkarın.
Konjugat için, kabul eden boncukları peptitler halinde 10'a 1 oranında ayarlayın. PBS seyreltilmiş peptit, Tween 20 ve Sodyum cyanaboroughhydride çözeltislerindeki paletid boncuklarına ve döner çalkalayıcı üzerinde uç ajitasyon ile kuluçkaya yatırın. Reaksiyonsuz bölgeleri engellemek için, boncuklara pH 8.0'ın bir azı dişi Tris hidroklorür çözeltisinin 20 mikrolitresini ekleyin ve 37 santigrat derecede bir saat kuluçka yaparak reaksiyonu söndürin.
Kuluçkanın sonunda, boncukları santrifüjleme ile yıkayın ve boncuk peletini bir mililitre Tris hidroklorür çözeltisinde yeniden askıya alın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, boncukları depolama tamponunda mililitre konsantrasyonunda mililitre konsantrasyonunda yeniden askıya alın ve konjuge kabul eden boncuk çözeltisini ışıktan korunan 4 santigrat derecede saklayın.
PBS'de mililitre konsantrasyonu başına 10 mikrogram glutatyon donör boncuk ekleyin. Mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyona GSTFKBP51 ekleyin ve karanlıkta 25 santigrat derecede reaksiyonu 10 dakika kuluçkaya bırakın. DMSO'daki test bileşiği seri seyreltmeleri yapın.
384 kuyu plakasının her kuyusunun köşesine 0,25 mikrolitre test bileşiği seyreltme ve üç taraflı ekleyin. Negatif kontrol için 0,25 mikrolitre DMSO ekleyin ve pozitif kontrol için kuyulara 0,25 mikrolitre Hsp90 C-Terminal peptit ekleyin. Her kuyuya GST etiketli proteinli glutatyon donör boncuk içeren çözeltinin 22,5 mikrolitresini ekleyin.
Tabağı ellerle iyice çalkalayın ve 15 dakika boyunca 25 santigrat derecede karanlıkta kuluçkaya yatırın. Kabul eden boncukları ekli Hsp90C-Terminal peptit ile mililitre konsantrasyonu başına 100 mikrogram PBS'de seyreltin. Her kuyuya 2,25 mikrolitre seyreltilmiş kabul edici boncuk ekleyin.
Plakayı gösterildiği gibi 15 dakika boyunca karanlıkta çalkalayın ve kuluçkaya bırakın. Plaka okuyucu aletini açın, plakanın sinyalini ölçün ve metin el yazmasında açıklandığı gibi verileri analiz edin. Karşılama iletişim kutusunda bir X-Y veri tablosu oluşturun, X numaraları, Y'yi seçin ve yan yana sütunlara üç çoğaltma değeri girin.
Konsantrasyon değerlerini X sütununa ve sinyal değerlerini Y sütununa içe aktarın. Çözümle'yi tıklatın, X konsantrasyonunu dönüştür'ü seçin ve logaritmalara dönüştür'ü seçin. Analiz et'i tıklatın ve X-Y analizi altında doğrusal olmayan regresyon seçin.
Doz yanıt inhibisyonu seçeneğini açın ve log ile yanıt değişken eğim denklemini seçin. IC50 değeri ve grafikleri içeren sonuçları görüntülemek için Tamam'ı tıklatın. Bu test, küçük moleküllerin taranmasında, Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki etkileşimlerin engellenmesi için kullanılmıştır.
0,8'den fazla Z puanı ve 13,35'lik sinyalden arka plan oranına, yüksek verim taraması için sağlamlığı ve güvenilirliği gösterir. Küçük moleküler ağırlık testi bileşiği D10'un refakatçi-cochaperone etkileşimlerinin inhibisyonu üzerindeki etkisi değerlendirildi ve D10'un doza bağımlı inhibisyon gösterdiği IC50 değerleri hesaplandı. Hsp90 GSTFKBP51 etkileşimleri için IC50 değeri 65 nanomolar idi.
Hsp90, GSTFKBP52 etkileşimleri için ise en yüksek bileşik konsantrasyon ile tam inhibisyon sağlanamazken, protein-protein etkileşiminin küçük moleküllerle seçici inhibisyonunun sağlanabileceğini göstermektedir. Kritik adım ekleme sırasıdır. İlk önce küçük bir molekül ile TPR hedefi arasında bir kompleks oluşturuyoruz.
Aksi takdirde daha uzun inkübasyon ve daha yüksek bileşik konsantrasyonlar gereklidir. Bu tekniği, Hsp90 ve FKB51 veya Hsp90 ve FKB52 arasındaki etkileşimi bozan küçük molekülleri taramak için kullanabiliriz. Ayrıca Hsp90, Hsp70 ve cochaperone tarama seçici inhibitörleri içeren bir TPR motifi arasındaki herhangi bir etkileşime de genişletilebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, özellikle Hsp90 ve FKBP51 veya FKBP52 arasındaki şaperon-koşaperon etkileşimlerini incelemek için homojen boncuk tabanlı bir analiz yöntemi tanımlar. Bu teknik, çeşitli insan hastalıkları ile ilgili olan bu etkileşimlerin güçlü inhibitörlerini tanımlamak için küçük moleküllerin yüksek verimli taramasına izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Farmakoloji
Arka Plan
- Hsp90, diğer proteinlerin katlanmasında rol oynayan bir şaperon proteinidir.
- FKBP51 ve FKBP52, Hsp90 ile etkileşime giren koşaperonlardır.
- Bu etkileşimlerin bozulması terapötik etkilere sahip olabilir.
- Bu etkileşimler Alzheimer, kanser ve otoimmün hastalıklar gibi hastalıklarda rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Hsp90-koşaperon etkileşimlerinin inhibitörlerini taraması için güvenilir bir analiz geliştirmek.
- Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini seçici olarak bozan küçük molekülleri tanımlamak.
- Minimal örnek gereksinimleri ile yüksek verimli taramayı sağlayan bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Glutatyon bağlı bağışçı boncuklar kullanan homojen boncuk tabanlı analiz.
- GST'ye kaynaştırılmış TPR-motif koşaperonları ve Hsp90 türevli peptitleri olan alıcı boncuklar.
- Küçük moleküllerin yüksek verimli taraması.
- Bir saat içinde hızlı sonuçlar elde edilebilir.
Ana Sonuçlar
- Hsp90-FKBP51 etkileşimlerinin güçlü ve seçici inhibitörlerinin tanımlanması.
- Analizin güvenilirliği ve sağlamlığının gösterilmesi.
- Yüksek tıbbi öneme sahip bileşiklerin taranması potansiyeli.
- Sonuçlar tedavi uygulamalarına yönelik daha fazla araştırma için destek sağlar.
Sonuçlar
- Geliştirilen analiz, şaperon-koşaperon etkileşimlerini incelemek için etkilidir.
- Potansiyel klinik öneme sahip küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmasını sağlar.
- Bu teknik, Hsp90 etkileşimleriyle ilişkili hastalıkların tedavileri üzerinde araştırma yapmayı ilerletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Targeting Hsp90-cochaperone interactions enables selective modulation of disease-relevant signaling pathways, offering a precision strategy for therapeutic intervention in oncology, neurodegeneration, and autoimmune disorders. The homogeneous bead-based assay provides a robust, scalable platform for early-stage target validation and lead identification by quantifying protein-protein disruption in a homogeneous environment. This supports mechanistic de-risking and predictive confidence in prioritizing chemical series with selective Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 inhibitory profiles.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Hsp90-FKBP51 and Hsp90-FKBP52 binary interactions to validate target engagement and pathway specificity.
- Operational Value: Requires minimal protein and compound input, supporting early-stage screening with limited material availability.
- Predictive Value: Identifies selective inhibitors (e.g., D10 with 65 nM IC50 for FKBP51) to de-risk off-target effects and improve target hypothesis confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, homogeneous readouts (Z’ > 0.8, S/B = 13.35) suitable for high-throughput screening campaigns.
- Operational Value: Results obtained within one hour, enabling rapid iteration and timely go/no-go decisions in hit-to-lead progression.
- Reproducibility Value: Standardized bead conjugation and blocking steps ensure assay consistency across runs and laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports screening for compounds that disrupt Hsp90-cochaperone interactions implicated in Alzheimer’s disease, cancer, and autoimmune disorders.
- Predictive Value: Enables early assessment of target selectivity, aiding in the selection of candidates with favorable mechanistic profiles for preclinical advancement.
- Continuity Value: Assay outputs (IC50, dose response) translate directly into downstream efficacy and safety evaluation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation through biochemical confirmation of Hsp90-cochaperone disruption, and enabling lead identification via high-throughput screening of small molecule libraries.
- Discovery Biology: Validates target engagement by measuring disruption of Hsp90-FKBP51 or Hsp90-FKBP52 interactions, clarifying mechanism of action.
- Screening: Provides assay readiness with robust Z’ score and signal-to-background ratio, ensuring reliable compound evaluation in 384-well format.
- Analytics: Generates dose-response data and IC50 values through nonlinear regression, enabling quantitative comparison of inhibitor potency and selectivity.
- Translational Research: Connects to disease-relevant systems by screening inhibitors of interactions linked to human disorders, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Platform can be extended to other Hsp70/Hsp90-TPR cochaperone interactions, increasing ROI across multiple target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective inhibition of Hsp90-FKBP51 over Hsp90-FKBP52, reducing ambiguity in target modulation.
- Operational Value: Low sample consumption (beads, protein, compounds) and fast time-to-result (<1 hour) increase screening efficiency.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions based on target selectivity, improving capital efficiency and reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of chemical series with validated target engagement and selectivity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification (GST-tagged TPR domains) and bead-based assay conjugation chemistry.
- Dependent on access to plate reader capable of luminescence detection and compatible with 384-well formats.
- Necessitates standardization of peptide-bead conjugation ratios (10:1) and blocking conditions (1 M Tris, pH 8.0) for batch-to-batch consistency.
- Adaptation to alternative cochaperones requires re-validation of bead conjugation and interaction kinetics.
- Practical limitation: assay sensitivity may be affected by compound auto-fluorescence or luminescence quenching, requiring orthogonal counterscreening.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:28
Coupling of Hsp90 C-Terminal Peptide to the Acceptor Beads
2:49
Assay for Interaction Between GST-FKBP51 or GST-FKBP52 and Hsp90 C-Terminal Peptide and Inhibition with Small Molecular Mass Compounds
4:14
Dose-Response Curve Generation and IC50 Calculation
4:58
Results: Inhibitory Effect of Small Molecular Weight Test Compound D10
5:59
Conclusion
