Name: İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Öğrenin, tümör kaynaklı ekstraselüler veziküllerin immünojenitesini akım sitometrisi ile in vivo değerlendirme yöntemini. Bu protokol, kişiselleştirilmiş kanser tedavileri için immünoterapi potansiyelini keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 ve Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.'ye), DKMS Yaşam Verme Vakfı'ndan (H.P.'ye) bir Mechtild Harf Araştırma Bursu, Melanom Araştırma İttifakı (S.H.'ye) tarafından Genç Araştırmacı Ödülü, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından verilen bir burs (F.S.'ye), Münih Teknik Üniversitesi tarafından bir Tohum Fonu (S.H.'ye) ve Wilhelm Sander Vakfı tarafından bir araştırma hibesi (2021.041.1, S.H.'ye). H. P., EMBO Genç Araştırmacı Programı tarafından desteklenmektedir.
YAZAR KATKILARI:
F.S., H.P. ve S.H. araştırmayı tasarladı, analiz etti ve sonuçları yorumladı. F.S. ve S.H. el yazmasını yazdı. H.P. ve S.H. çalışmaya rehberlik etti.

Deneylerin başlangıcında, fareler en az 6 haftalıktı ve spesifik patojensiz koşullar altında tutuldu. Bu protokol, Kurumsal etik standartlara ve geçerli yerel düzenlemelere uygundur. Hayvan çalışmaları yerel düzenleyici kurum (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalarda cinsiyetle ilgili olası önyargılar araştırılmamıştır.
1. Kemoterapiye maruz kaldıktan sonra tümör hücrelerinden elde edilen EV'lerin üretimi ve izolasyonu
<ol><li>Kültür murin B16 melanom hücreleri DMEM'de (4 mM L-glutamin ve 4.5 g / L D-glikoz içeren) eksprese eden ve FCS (% 10 v / v), penisilin (100 Ünite / mL) ve streptomisin (100 μg / mL) ile desteklenmiş 37 ° C'de, hücreler istikrarlı bir şekilde büyüyene ve yaklaşık% 90 birleşene kadar. NOT: Protokolün bu bölümünü, bir hücre kültürü başlığı kullanarak tamamen steril koşullar altında gerçekleştirin. Diğer kanser varlıklarının analizi için, güçlü bir antijen eksprese eden hücre hatları, spesifik ex vivo antijen restirasyonuna izin verdikleri için antijene özgü T hücresi yanıtlarını değerlendirmek için tercih edilir.</li>
	<li>EV üretimi için gerekli hücre kültürü ortamını hazırlamak için, FCS içindeki sığır EV'lerini, 4 ° C'de 24 saat boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüjleme ile tüketin ve ardından peleti atın. Alternatif olarak, önceden hayvan EV'lerinde düşük bir ticari preparat seçin.</li>
	<li>B16-OVA hücrelerini hasat edin ve PBS'de iki kez yıkayın ve daha sonra EV-tükenmiş ortamda 400.000 hücre / mL konsantrasyonunda tohumlayın. NOT: Hücre konsantrasyonunu, incelenen hücre hattının büyüme dinamiğine uyarlayın, böylece hücreler aşırı büyümez.</li>
	<li>B16-OVA hücrelerini mL başına 30 μg oksaliplatin ekleyerek tedavi edin ve 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Kontrol koşullarını tedavi edilmeden bırakın. Genotoksik bir maddenin ilk kullanımında, tripan mavisi dışlama gibi hücre canlılığı testlerini kullanarak istenen sitotoksik etkinliği titre edin18. NOT: Bu tahlil, kemoterapötiklerin yanı sıra diğer bağışıklık modüle edici maddelerle veya iyonlaştırıcı ışınlamayla tedavi edilen hücre kültürlerinde üretilen EV'leri de değerlendirebilir. DİKKAT: Oksaliplatin cilde ve ciddi göz tahrişine neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna ve solunum tahrişine neden olabilir. Oksaliplatinin kansere neden olduğundan şüphelenilmektedir. Bir önlem olarak, yeterli eldiven, gözlük, maske ve giysiler de dahil olmak üzere yeniden kullanmadan önce temizlenmiş kişisel koruyucu ekipman kullanın. Solumaktan kaçının ve kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın. Çevreye salınımdan kaçının ve oksaliplatini geçerli düzenlemelere göre atın. Güvenlik bilgi formundan ayrıntılı bilgi edinin.</li>
	<li>Hücre kültürü süpernatan toplayın. Önce 4 °C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj, daha sonra 4 °C'de 30 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj, her seferinde peleti atın. Son olarak, 220 nm PVDF membrandan süzün. Herhangi bir hücre kalıntılarını çıkarmak için her adım için taze bir tüp kullanın. NOT: Bu aşamada, EV içeren süpernatant, protokole devam etmeden önce bir gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bununla birlikte, derhal EV saflaştırma ile açıklanan programa uyulması şiddetle tavsiye edilir.</li>
	<li>1 mL süpernatantı 0,5 mL'lik ticari olarak temin edilebilen belirli bir eksozom izolasyon reaktifi ile karıştırın (bakınız Malzeme Tablosu) V şeklinde 1,5 mL'lik bir tüpte. Homojen bir çözelti oluşturmak için yukarı ve aşağı iyice pipet veya vorteks yapın. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>4 °C'de 60 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj. Süper natantı dikkatlice atın. Kalan damlaları, 1,5 mL'lik tüpü bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı dokundurarak ve alttaki EV-peletine dokunmadan ince uçlu bir pipetten aspirasyon yaparak çıkarın.<ol>
<li>EV-peletinin kontrolsüz seyreltilmesini önlemek için tüm sıvıları iyice çıkarın. Ayrıca, peletin kurumasını önlemek için bu görevleri hızlı bir şekilde yerine getirin.</li>
	</ol></li>
	<li>EV'leri soğuk PBS'de, peleti tüpün duvarından ucuyla çizmeden yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Şimdi, EV'leri bir araya getirmek için süspansiyonu ilk tüpten son tüpe adım adım aktarın. NOT: Tüp sayısı ile çarpımına 5 μL'ye eşit bir PBS hacmi kullanın. Son süspansiyonun 5 μL'si, kemoterapi altında veya kararlı bir durumda 400.000 hücreden salınan izole EV'leri içerir.</li>
	<li>Tercihen, EV'leri doğrudan kullanın. Bu mümkün değilse, EV süspansiyonlarını uygulamaya kadar 28 güne kadar silikonize kaplarda -80 ° C'de saklayın. NOT: Burada ve diğer bazı yayınlarda açıklanan EV'ler, bu süre zarfında -80 ° C'de saklandıklarında biyolojik işlevlerini kaybetmezler19.</li>
	<li>EV izolatlarını MISEV2018 yönergelerine göre ölçün ve karakterize edin20. NOT: Niceleme için olası yöntemler arasında nanopartikül izleme analizi (NTA)21 ve EV'nin membrana bağlı proteinlerinin tespiti22 bulunmaktadır. EV'leri daha da karakterize etmek için olası yaklaşımlar arasında elektron mikroskobu23 ve batı blot20 bulunur.</li>
</ol>2. Farelerin EV'lerle bağışıklanması
<ol><li>Sırasıyla tedavi edilen hücrelerden, tedavi edilmemiş hücrelerden ve PBS'den (araç) türetilen EV'leri alan tedavi grupları da dahil olmak üzere C57BL / 6 fareleri (veya tümör hücre hattına karşılık gelen diğer sinjenik fareler) ile in vivo deneyi planlayın. NOT: Tercihen, fizyolojik yaşlanmanın bağışıklık tepkisini azaltmasını önlemek için 6-8 haftalıkken fareler kullanın24.</li>
	<li>4.0 x 105 B16-OVA hücrelerinden izole edilmiş EV'lerle bağışıklamak için ilgili tedavi grubundaki her fare için 5 μL EV-süspansiyonunu 55 μL soğuk PBS ile karıştırın. NOT: Bu miktarda EV, nanopartikül izleme analizi ile ölçülen yaklaşık 2 x 109 parçacığa karşılık gelir (veriler gösterilmemiştir). Bir adjuvan (örneğin, LPS) ile karıştırılmış OVA proteini, güçlü bir aşı pozitif kontrolü olarak uygulanabilir.<ol>
<li>Şırıngaları (iğne boyutu 26-30 G) sırasıyla 60 μL seyreltilmiş EV'ler veya PBS ile doldurun ve hemen buza koyun. NOT: Protokolde, enjekte edilen EV'lerin miktarı, oksaliplatinin tümör hücresi EV biyogenezi üzerindeki hem kalitatif hem de kantitatif etkilerini deneysel olarak değerlendirmek için EV salgılayan tümör hücrelerinin sayısına normalleştirilmiştir. Bazı okuyucular için, üretilen EV'lerin belirli bir konsantrasyonuna normalleşme, bilimsel sorularına bağlı olarak deneysel kurulumlarına daha iyi uyabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EV'leri veya PBS'yi deri altından farelerin uyluğunun medial yönüne aşılayın ve 7 gün sonra bağışıklamayı tekrarlayın. İlk tedaviden on dört gün sonra, bağışıklık tepkisini analiz etmek için fareleri feda edin, örneğin servikal çıkık ile. NOT: Yerel standartlara göre alternatif deri altı enjeksiyon yolları kullanılabilir.</li>
</ol>3. Dalak T hücrelerinin akış sitometri analizi
<ol><li>RPMI-1640'ı FCS (% 10 v / v), penisilin (100 Birim / mL), streptomisin (100 μg / mL), L-glutamin (2 mM) ve β-merkaptoetanol (50 μM) ile tamamlayan tam RPMI (cRPMI) hazırlayın ve soğutun.</li>
	<li>Dalağı açılan karın boşluğundan rezeke edin. Dalağı nemlendirilmiş bir 100 μm hücre süzgeci ve bir şırınganın plastik pistonu ile ezin ve dalak hücrelerini 5-10 mL cRPMI ile 50 mL'lik bir tüpe yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. NOT: Hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun. Dalak immün yanıtından ziyade lokal immün yanıtı analiz etmek için, aynı protokolü izleyerek drenaj popliteal ve inguinal lenf düğümlerini rezeke edin. Bu durumda, eritrositlerin lizisi için bir sonraki adımı atlayın.</li>
	<li>Eritrositleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için, peleti 2 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile yeniden askıya alın ( bakınız Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Ardından, cRPMI ekleyerek tepkiyi durdurun. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Tohumlama için, hücre peletini cRPMI'de yeniden askıya alın ve hücreleri, U şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plaka kullanarak, 200 μL cRPMI ile 200.000 hücrenin üçlüsünü her bir kuyucuğa yerleştirmek için sayın. 37 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. NOT: Aktif T hücrelerinin antijen özgüllüğünü ele almak için, sırasıyla 1 μg / mL çözünür ovalbümin (veya incelenen hücre hattına karşılık gelen başka bir tümör antijeni) ekleyin veya ek uyaran olmadan bırakın. Tam uzunlukta ovalbümin yerine bağışıklık baskın peptid epitopu SIINFEKL'in eklenmesi, daha kısa bir kuluçka süresine izin verir. Akış sitometrisinin yanı sıra, farelerin serumu ve 48 saatlik inkübasyondan sonra hücre kültürü süpernatantı çeşitli sitokinler için analiz edilebilir.</li>
	<li>48 saat sonra, diğerlerinin yanı sıra, proteinlerin Golgi aracılı sekresyonunu bloke ederek hücre içi IFN-γ boyamasını arttırmak için, hücre kültürüne Brefeldin A (5 ng / mL), PMA (20 ng / mL) ve İyonomisin (1 μg / mL) ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin.</li>
	<li>Yüzey biyobelirteçlerini boyamadan önce, V şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakaya aktarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, yüzey biyobelirteçlerine, CD3, CD8 ve CD4'e (bkz. Malzeme Tablosu) yönlendirilmiş, yerel olarak mevcut akış sitometresi ile uyumlu, 1:400 seyreltilmiş floresan antikorları ve PBS'de 1:1.000 seyreltilmiş sabitlenebilir bir canlılık boyası ekleyin. Pelet edilmiş plenositleri boyama çözeltisinde yeniden askıya alın ve ışıktan korunarak 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>fiksasyonu ve geçirgenliği için, FACS-tamponunda (PBS artı% 3 v / v FCS ) iki kez yıkayın ve daha sonra kuyu başına 100 μL fiksasyon/geçirgenlik tamponunda (bkz. Işıktan korunarak 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücre içi IFN-γ boyanması için, plenositleri fiksasyon/permeabilizasyon tamponunda yıkayın ve tamponda 1:200 seyreltilmiş IFN-γ karşı floresan antikorlarla yeniden askıya alın. Işıktan korunarak 4 °C'de en az 1 saat (maksimum 12 saate kadar) inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri akış sitometrisi ile ölçmeden önce, plenositleri fiksasyon/permeabilizasyon tamponunda iki kez yıkayın ve FACS-tamponunda yeniden askıya alın. Sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu Şekil 2'de gösterilen geçit stratejisine göre analiz edin.<ol>
<li>İlk olarak, tek hücreleri tespit etmek için FSC-H'yi FSC-A'ya karşı lekeleyin. Daha sonra, lenfoid hücreleri tespit etmek için, SSC'yi FSC-A'ya karşı lekeleyin. Daha sonra, canlı CD3 +, CD4-, CD8 + hücrelerini seçin ve dalaktaki sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu ölçmek için IFN γ üreten alt kümelerini belirleyin. NOT: Negatif teknik kontrol olarak IFN-γ karşı hedeflenen florokrom hariç tüm florokromlarla birlikte bir Floresan-eksi-bir (FMO) boyası ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+cell+death+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunogenic cell death in cancer therapy.</a> Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).</li>
<li>Kepp, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+detection+of+immunogenic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death.</a> Oncoimmunology. 3 (9), 955691(2014).</li>
<li>Fuertes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+type+I+IFN+signals+are+required+for+antitumor+CD8%2B+T+cell+responses+through+CD8%7Balpha%7D%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).</li>
<li>Sistigu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-autonomous+contribution+of+type+I+interferon+signaling+to+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy.</a> Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Shankaran, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNgamma+and+lymphocytes+prevent+primary+tumour+development+and+shape+tumour+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity.</a> Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).</li>
<li>Tesniere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+death+of+colon+cancer+cells+treated+with+oxaliplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin.</a> Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).</li>
<li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Zomer, A., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+extracellular+vesicle+transfer+on+cellular+heterogeneity+in+cancer%3A+What+are+the+potential+clinical+ramifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications.</a> Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).</li>
<li>Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+tumor-mediated+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Exosomes and tumor-mediated immune suppression.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).</li>
<li>Wolfers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomes+are+a+source+of+shared+tumor+rejection+antigens+for+CTL+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming.</a> Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).</li>
<li>Zeelenberg, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tumor+antigens+to+secreted+membrane+vesicles+in+vivo+induces+efficient+antitumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses.</a> Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).</li>
<li>Diamond, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+Shuttle+TREX1-Sensitive+IFN-Stimulatory+dsDNA+from+Irradiated+Cancer+Cells+to+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs.</a> Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).</li>
<li>Kitai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-containing+exosomes+derived+from+cancer+cells+treated+with+topotecan+activate+a+STING-dependent+pathway+and+reinforce+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity.</a> Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).</li>
<li>Heidegger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIG-I+activation+is+critical+for+responsiveness+to+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade.</a> Science Immunology. 4 (39), 8943(2019).</li>
<li>Schadt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-cell-intrinsic+cGAS+expression+mediates+tumor+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity.</a> Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+immunization+of+a+TLR9+agonist+virus-like+particle+enhances+anti-PD1+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li>
<li>Jeyaram, A., Jay, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+and+storage+stability+of+extracellular+vesicles+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications.</a> The AAPS Journal. 20 (1), 1(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Vestad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+concentration+analyses+of+extracellular+vesicles+by+nanoparticle+tracking+analysis%3A+a+variation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087(2017).</li>
<li>Suarez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-assisted+flow+cytometry+method+for+the+semi-quantitative+analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11271(2017).</li>
<li>Yuana, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+extracellular+vesicles+in+fresh+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+generation+but+normal+maintenance+of+memory+T+cells+in+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).</li>
<li>Bloom, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tyrosinase-related+protein+2+as+a+tumor+rejection+antigen+for+the+B16+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).</li>
<li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield%2C+purity+and+downstream+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Scientific Reports. 9 (1), 5335(2019).</li>
<li>DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+activation+and+associated+primary+adhesion+is+inducible+via+T+cell+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation.</a> The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).</li>
<li>Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shedding+of+CD62L+%28L-selectin%29+regulates+the+acquisition+of+lytic+activity+in+human+tumor+reactive+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes.</a> PLoS One. 6 (7), 22530(2011).</li>
<li>Bek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+intrinsic+RIG-I+signaling+turns+melanoma+cells+into+type+I+interferon-releasing+cellular+antitumor+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines.</a> Oncoimmunology. 8 (4), 1570779(2019).</li>
<li>Nabet, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+RNA+unshielding+couples+stromal+activation+to+pattern+recognition+receptor+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer.</a> Cell. 170 (2), 352-366 (2017).</li>
<li>Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+masters+of+intercellular+communication+and+potential+clinical+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, kemoterapiye bağlı stres altında melanom hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik in vivo bir değerlendirmesini sağlarken, çeşitli tedaviler altında çeşitli kanserlerden yayılan EV'lere uyum sağlar. Örneğin, oksaliplatin ile tedavi edilen B16-OVA hücrelerinden türetilen EV'lerle farelerin bağışıklanması, dalaktaki IFN γ üreten CD8 + T hücrelerini genişletir, bunlar da ovalbümin ile ex vivo inkübasyon ile daha da uyarılır ve tümöre özgü bir bağışıklık tepkisini gösterir. Bu ne...

Bağışıklık sistemi, hem bağışıklık kontrol noktası inhibisyonu tarafından kışkırtıldığında hem de geleneksel kanser tedavilerinin etkinliği için kansere karşı mücadelede çok önemli bir rol oynar. Kemoterapötik ajanlar oksaliplatin ve doksorubisin gibi genotoksik tedavilere yenik düşen tümör hücreleri veya iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi, potansiyel olarak adaptif bir anti-tümör immün yanıtı başlatan antijenleri ve tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri (DAMP'ler) serbest bırakabilir1. İmmünojenik hücre ölümü bağlamında en belirgin DAMP'ler, kemotaktik ATP gibi beni bul sinyallerini, antijen sunan hücreler tarafından tümör hücresi alımını teşvik eden calreticulin maruziyeti gibi yeme-beni sinyalleri ve desen tanıma reseptörlerini aktive eden HMGB1'in salınımını içerir. Ayrıca, tümör kaynaklı immünojenik nükleik asitler veya diğer uyaranlar yoluyla indüklenen tip I interferonlar (IFN-I), dendritik hücreler tarafından algılanır ve tümöre özgü sitotoksik T hücrelerini etkili bir şekilde astarlamalarını sağlar3,4. Klinik olarak, tümöre sızan aktive ve proliferasyon CD8 + T hücreleri, birçok kanser hastasında uzun süreli sağkalım için bağımsız bir prognostik faktör sağlar. Bu tür aktive edilmiş T hücrelerinden salınan IFN-γ, kanser hücreleri üzerinde doğrudan antiproliferatif etkilere aracılık eder ve Th1 polarizasyonunu ve sitotoksik T hücresi farklılaşmasını yönlendirir, böylece kansere karşı etkili immünossürveyana katkıda bulunur5,6. Oksaliplatin, kansere karşı bu tür adaptif immün yanıta aracılık eden iyi niyetli bir immünojenik hücre ölümü indükleyicisidir7. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altında tümör hücreleri tarafından salınan ilk immünojenik sinyallerin bolluğu tam olarak ortaya çıkarılmaya devam etmektedir. Kanser immünoterapisindeki önemli ilerlemelere rağmen, faydalarını hastaların daha büyük bir kısmına genişletmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. T hücresi aktivasyonunu başlatan immünojenik sinyallerin daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, yeni tedavilerin geliştirilmesine rehberlik edebilir.
Hücre dışı veziküller (EV'ler) olarak bilinen membranla çevrili heterojen bir yapı grubu, hücreler arası iletişim cihazları olarak hizmet ediyor gibi görünmektedir. Hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından yayılan EV'ler, fonksiyonel proteinleri, RNA'yı, DNA'yı ve diğer molekülleri bir alıcı hücreye taşır veya sadece hücre yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak bir hücrenin fonksiyonel durumunu değiştirebilir. Biyolojik olarak aktif kargoları, üreten hücrenin türüne ve fonksiyonel durumuna göre önemli ölçüde değişir8. Kanser immünolojisinde, tümör hücrelerinden salınan EV'ler ağırlıklı olarak immünoterapiye düşman olarak kabul edilmiştir, çünkü sonunda invaziv büyümeyi teşvik eder, metastatik nişleri önceden şekillendirir9 ve bağışıklık tepkisini baskılar10. Buna karşılık, bazı çalışmalar EV'lerin etkili çapraz sunum için tümör antijenlerini dendritik hücrelere aktarabildiğini göstermiştir11,12. EV'ler, tedaviye bağlı stres altında ortaya çıktıkları takdirde immünostimülatör nükleik asitler sağlayabilir ve anti-tümör immün yanıtını kolaylaştırır13,14. Tümör mikroortamında bu tür RNA ve DNA'dan gelen immün ligandların algılanmasının son zamanlarda kontrol noktası blokajına duyarlılığı önemli ölçüde modüle ettiği gösterilmiştir15,16,17. Bu nedenle, farklı tedaviye bağlı stres altında tümör hücreleri tarafından salınan EV'lerin immünojenik rolünün daha da açıklığa kavuşturulması gerekmektedir. EV'ler genç ama büyüyen bir araştırma alanı oluşturduğundan, yöntemlerin standardizasyonu hala devam etmektedir. Bu nedenle, EV'ler ve kanser immünolojisi arasındaki etkileşimler üzerine araştırma tekrarlanabilirliğini geliştirmek için bilgi paylaşımı esastır. Bunu akılda tutarak, bu makale tümör kaynaklı EV'lerin immünojenik etkisini in vivo olarak değerlendirmek için basit bir protokolü açıklamaktadır.
Bu değerlendirme, tümör kaynaklı EV'ler üreterek, alıcı fareleri bu EV'lerle bağışıklayarak ve dalak T hücrelerini akış sitometrisi ile analiz ederek gerçekleştirilir. EV üretimi, murin tümör hücrelerinin EV'siz bir hücre kültürü ortamında yüksek derecede saflık için tohumlanmasıyla ideal olarak gerçekleştirilir. Hücreler, tedaviye bağlı EV'lerin etkisini, ilgili tümör kaynaklı EV'lerin temel immünojenisitesine karşı karşılaştırmak için kemoterapi gibi spesifik bir hücre stres uyaranı ile tedavi edilir. EV'lerin izolasyonu, in vivo uygulanabilirliğe ve yerel mevcudiyete göre seçilmesi gereken çeşitli tekniklerle iyi bir şekilde gerçekleştirilebilir. Aşağıdaki protokol, EV saflaştırması için ticari bir kit ile çökeltme bazlı bir tahlili açıklamaktadır. Fareler bu EV'lerle iki kez aşılanır. İlk enjeksiyondan on dört gün sonra, T hücreleri dalaktan çıkarılır ve sistemik bir bağışıklık tepkisini değerlendirmek için akış sitometrisi yoluyla IFN-γ üretimi için analiz edilir. Bununla birlikte, farklı terapötik rejimler altında ortaya çıkan tümör kaynaklı EV'lerin anti-tümör T hücresi yanıtlarını indükleme potansiyeli nispeten kolay, hızlı ve yüksek geçerlilikle değerlendirilir13. Bu nedenle, bu yöntem çeşitli koşullar altında kanser hücrelerinden türetilen EV'lerin immünolojik taraması için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD3 FITC</td><td>Biolegend</td><td>100204</td><td>Klonu 17A2</td></tr><tr><td>Anti-CD4 PacBlue Biolegend</td><td></td><td>100428</td><td>Klonu GK1.5</td></tr><tr><td>Anti-CD8 APC</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td>Klonu 53-6.7</td></tr><tr><td>Anti-IFN ve gama; PE</td><td>eBioscience</td><td>RM90022</td><td>Klonu XMG1.2</td></tr><tr><td>Brefeldin A Biolegend</td><td></td><td>420601</td><td>Brefeldin A Çözeltisi (1.000x)</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci, 100 & m</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>EASYstrainer 100 & m</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>Dulbecco'nun D-glikoz (4.5 g / L) ve L-glutamin (4 mM) ile Modifiye Eagle's MediumFBS</td></tr> <tr><td>Good Forte</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P40-47500</td><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td></tr> <tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 506 eBioscience</td><td>, Thermo Fischer Scientific</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Bölümü Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi</td><td>eBioscience</td><td>00-5123-43</td><td>Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi (10x)</td></tr> <tr><td>Fiksasyon / Geçirgenleştirme Seyreltici</td><td>eBioscience</td><td>00-5223-56</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Streptomyces conglobatus'tan İyonomisin Sigma-Aldrich 407952 - CAS 56092-82-1, & ge; % 97 (HPLC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-032</td><td>L-Glutamin (200 mM)</td></tr> <tr><td>Ovalbumin</td><td>InvivoGen</td><td>vac-pova</td><td>< 1 EU/mg endotoksin içeren ovalbümin - CAS 9006-59-1</td></tr><tr><td>MRI</td><td>hastanesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür içermeyen Fosfat Tamponlu Salin</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>1514-122</td><td>Penisilin (10.000 U/mL) ve streptomisin (10.000 ug/mL) karışımı</td></tr> <tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat, & ge; % 99 (HPLC)</td></tr> <tr><td>PVDF filtresi, 0,22 & mikro; m, şırıngalar için</td><td>Merck Millipore SLGV033RS</td><td></td><td>Millex-GV Filtre Ünitesi 0.22 & mikro; m Durapore PVDF Membran</td></tr><tr><td>Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu</td><td>Invitrogen</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11875</td><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 D-glikoz (2.00 g / L) ve L-glutamin (300 mg / L) içeren ortam, HEPES</td></tr><tr><td>Şırıngası olmadan, 26 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305501</td><td>1 mL İğneli Sub-Q Şırıngaları (0,45 mm x 12,7 mm)</td></tr><tr><td>Toplam Eksozom İzolasyon Reaktifi</td><td>İnvitrojen</td><td>4478359</td><td>Hücre kültürü ortamından izolasyon için</td></tr><tr><td> beta; -Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31350</td><td> beta; -Merkaptoetanol (50 mM)</td></tr></tbody></table>

İn vivo dalak t hücrelerinin akım sitometrisi ile tümör kaynaklı hücre dışı veziküllerin İmmünojenite taraması

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Kemoterapi veya ışınlamanın neden olduğu tümörlerin immünojenik hücre ölümü, tehlikeyle ilişkili moleküler paternleri serbest bırakarak ve tip I interferon üretimini indükleyerek tümöre özgü T hücresi yanıtlarını tetikleyebilir. Kontrol noktası inhibisyonu da dahil olmak üzere immünoterapiler, terapötik bir etki ortaya çıkarmak için öncelikle önceden var olan tümöre özgü T hücrelerine dayanır. Bu nedenle, immünojenik hücre ölümünü içsel bir anti-kanser aşısı olarak kullanan sinerjik terapötik yaklaşımlar yanıtlarını artırabilir. Bununla birlikte, tedaviye bağlı stres altındaki hücreler tarafından salınan immünojenik faktörlerin spektrumu, özellikle hücre dışı veziküller (EV'ler) ile ilgili olarak eksik karakterize olmaya devam etmektedir. EV'lerin, hemen hemen tüm hücrelerden yayılan nano ölçekli membranöz parçacıkların, hücreler arası iletişimi kolaylaştırdığı düşünülmektedir ve kanserde, tümör antijenlerine karşı çapraz astarlamaya aracılık ettiği gösterilmiştir. Çeşitli koşullar altında tümörlerden türetilen EV'lerin immünojenik etkisini değerlendirmek için uyarlanabilir, ölçeklenebilir ve geçerli yöntemler aranmaktadır. Bu nedenle, burada EV'lerin in vivo immünojenisitesini değerlendirmek için nispeten kolay ve sağlam bir yaklaşım sunulmaktadır. Protokol, farelerin EV'lerle in vivo immünizasyonundan sonra, tedavi veya kararlı durum koşulları altında tümör hücre kültürlerinden çökeltme bazlı tahlillerle izole edilen dalak T hücrelerinin akış sitometrisi analizine dayanmaktadır. Örneğin, bu çalışma, B16-OVA murin melanom hücrelerinin oksaliplatin maruziyetinin, tümör-reaktif sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonuna aracılık edebilecek immünojenik EV'lerin salınımıyla sonuçlandığını göstermektedir. Bu nedenle, EV'lerin in vivo immünizasyon ve akış sitometrisi yoluyla taranması, immünojenik EV'lerin ortaya çıkabileceği koşulları tanımlar. İmmünojenik EV salınımının koşullarını belirlemek, EV'lerin kansere karşı terapötik etkinliğini test etmek ve sonuçta EV'lerin kanser immünolojisindeki rolüne dair yeni bilgiler ortaya çıkarmak için altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için önemli bir ön koşul sağlar.

Bu protokol, tümör kaynaklı EV'lerin immünojenisitesinin basit ve kolay tekrarlanabilir değerlendirmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu sayede fareler, model antijen tavuk ovalbümini (OVA) eksprese eden tümör hücrelerinin in vitro kültürlerinden türetilen EV'lerle aşılanır. Sonraki immün yanıt, dalak T hücrelerinde akış sitometrisi ile analiz edilir.
Şekil 1 , tüm protokolün pratik adımlarına genel bir bakış sunmaktadır. Çalışma immünojenik ...

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

Bu video, tümör kaynaklı hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin in vivo immünojenisitesinin akış sitometrisi kullanılarak nasıl değerlendirileceğini göstermektedir. Burada açıklanan tarama yönteminin gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır ve çeşitli ayarlara uyarlanabilir. Kanserde, immünojenik hücre dışı vezikül koşullarının belirlenmesi, belirli translasyonel alaka düzeyine sahiptir.Bu nedenle, otolog EV'ler kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavileri olarak kullanılabilir. Prosedürün ilk bölümünü gösteren, laboratuvarımdan teknik asistan Tatiana Nedelko olacak. Hücre dışı vezikül veya EV'ler için gerekli hücre kültürü ortamının hazırlanmasına başlamak için, FCS ortamındaki sığır EV'lerini, 4 santigrat derecede 24 saat boyunca 100.000 kez g'de ultrasantrifüjleme yoluyla tüketin.Santrifüjlemeden sonra peleti atın. Ovalbümin eksprese eden murin B16 melanom hücrelerini veya B16-OVA hücrelerini kültürden toplayın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri EV-tükenmiş ortamda mililitre başına 400.000 hücre konsantrasyonunda tohumlayın.Daha sonra, B16-OVA hücrelerine mililitre başına 30 mikrogram oksaliplatin uygulayın ve işlenmemiş kontrol numuneleriyle 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. 24 saat sonra, süpernatantı 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 400 kez g'de santrifüje toplayın. Pelet, 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 2.000 kez g'de tekrar santrifüjlemeden önce atın.Peleti attıktan sonra, süpernatantı 220 nanometre PVDF membran filtresinden taze bir tüpe süzün. Daha sonra, 1 mililitre süpernatantı 0.5 mililitre ticari olarak temin edilebilen belirli bir eksozom izolasyon reaktifi ile karıştırın. Vorteks yapın ve karışımı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın, ardından 4 santigrat derecede gece boyunca inkübasyon.Ertesi gün, karışımı 4 santigrat derecede 60 dakika boyunca 10.000 kez g'de santrifüj edin. Süper natantı dikkatlice attıktan sonra, 1,5 mililitrelik tüpü bir kağıt havlu üzerinde baş aşağı vurarak ve alttaki EV peletine dokunmadan ince bir pipet ucundan aspirasyon yaparak kalan damlaları çıkarın. Peletin ucu ile çizilmeden yukarı ve aşağı pipetle pipetlenerek soğuk PBS'de peleti yeniden askıya alın.Ardından, EV'leri tüm tüplerden toplayın. Hemen kullanmıyorsanız, EV süspansiyonlarını uygulamaya kadar 28 güne kadar silikonize kaplarda 80 santigrat derecede saklayın. Tedavi grubundaki her fareyi 4.0 x 10'dan beşinci B16-OVA hücrelerine izole edilmiş EV'lerle aşılamak için, 5 mikrolitre EV süspansiyonunu 55 mikrolitre soğuk PBS ile karıştırın.Daha sonra, 26 ila 30 gauge iğne ile monte edilmiş şırıngaları 60 mikrolitre seyreltilmiş EV veya PBS ile doldurun ve ardından şırıngayı hemen buza koyun. EV'leri veya PBS'yi deri altından farelerin uyluğunun medial yönüne aşılayın. Yedi gün sonra bağışıklamayı tekrarlayın.İlk tedaviden 14 gün sonra, dalağı rezeke etmek için fareleri feda edin. Daha sonra, rezeke edilmiş dalağı nemlendirilmiş 100 mikrometre hücre süzgeci ve bir şırınganın plastik pistonu ile ezin. Dalak hücrelerini, 5 ila 10 mililitre serin tam RPMI ile 50 mililitrelik bir tüpe yıkayın.Daha sonra, süpernatanı atmadan önce hücreleri 400 kez g'de 4 santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin. Eritrositleri hücre süspansiyonundan çıkarmak için, hücre peletini oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile yeniden askıya alın ve inkübe edin. Ardından, beş ila 10 mililitre tam RPMI ekleyerek reaksiyonu durdurun, ardından daha önce açıklandığı gibi santrifüjleme yapın.Hücre peletini tam RPMI'da yeniden askıya aldıktan sonra, her fareden hücreleri sayın ve 200 mikrolitre cRPMI ile 200.000 splenositin üçlüsünü, U şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirin. Ardından, plakaları 37 santigrat derecede 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, hücre kültürünü mililitre Brefeldin A başına 5 nanogram, mililitre PMA başına 20 nanogram ve mililitre İyonomisin başına 1 mikrogram ile 4 saat boyunca 37 santigrat derecede tedavi edin.Kuluçka sonrası, plenositleri V şeklinde bir tabana sahip 96 delikli bir plakaya aktarın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Pelet edilmiş plenositleri taze hazırlanmış boyama çözeltisinde yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu ışıktan korunan 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Fiksasyon ve geçirgenlik için, FACS-tamponunda iki kez yıkayın ve daha sonra plenositleri, fiksasyon ve geçirgenlik çözeltisinin kuyucuğu başına 100 mikrolitre içinde yeniden askıya alın, ardından daha önce açıklandığı gibi karanlıkta inkübasyon.Hücre içi interferon gamayı boyamak için, hücreleri tamponda 1:200 seyreltilmiş interferon gamaya karşı floresan antikorlarla tekrar göndermeden önce plenositleri fiksasyon veya permeabilizasyon tamponunda yıkayın. Splenositleri karanlıkta 4 santigrat derecede 1 ila 12 saat boyunca inkübe edin. FACS-tamponunda kapsamlı yıkama ve resüsitasyondan sonra, makalede açıklanan geçit stratejisine göre sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu analiz edin.Temsili görüntüde, sitotoksik T hücrelerinin aktivasyonunu analiz etmek için geçit stratejisi gösterilmektedir. Hücreler tek hücreler, lenfosit alt kümesi, canlı CD3-pozitif T hücreleri ve CD4-negatif CD8-pozitif sitotoksik T hücreleri olarak kapılıydı. İnterferon gamanın hücre içi birikimi, aktivasyon için vekil bir belirteç olarak değerlendirildi.Tümör hücrelerinden türetilen EV'lerle bağışıklamadan sonra, alıcı farelerde antijene özgü T hücresi yanıtlarının indüksiyonu incelenmiştir. Oksaliplatin tedavisi gibi genotoksik stres koşulları altında kültürlenen tümör kaynaklı EV'ler, tedavi edilmemiş EV'lerin aksine, dalak sitotoksik T hücrelerinin güçlü aktivasyonunu indükledi. Araçla tedavi edilen hayvan grubu en düşük yanıtı gösterdi.Dalak T hücrelerinin aktivasyonu, ovalbümin varlığında veya yokluğunda ex vivo restimüle edildikten sonra belirlendi. İnterferon gama üretimi, tümör EV ile tedavi edilen hayvanların plenositleri, analizden önce model tümör antijeni ovalbümin ile yeniden uyarıldığında artmıştır. Tekrarlanabilir sonuçların EV'lerin sürekli izolasyon etkinliğine dayandığını lütfen unutmayın.Bu nedenle, kurumayı önlemek için EV peletlerinin tamamen ve derhal yeniden askıya alındığından emin olun. Bu protokolle, tümör hücresi kaynaklı EV'lerin immünojenisitesini belirleyen tümör hücreleri içindeki spesifik yolları analiz edebildik. Bu, kanser tedavisinde bu tür immünojenik EV'lerden yararlanmanın yolunu açabilir.

in-vivo-immunogenicity-screening-tumor-derived-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Bu video, floresan işaretli yakalama antikoru-manyetik nanopartikül konjugatları kullanılarak hücre dışı veziküllerin immüno-yakalanmasını göstermektedir. İşlem, karmaşık oluşum, floresan etiketli tespit antikorları ile boyama, manyetik ayırma ve antijenik karakterizasyon için akış sitometrik analizini içerir.

Antijenik Karakterizasyon için Hücre Dışı Veziküllerin İmmünoyakalama ve Akış Sitometrisi

Bir murin aşılama modelinde nanopartiküllerle bağışıklamaya yanıt olarak antijene özgü CD8+ T hücrelerinin genişlemesini izlemek için tüm hayvan görüntüleme ve akış sitometrisi tabanlı teknikleri açıklıyoruz.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

Protokol hücre kültür supernatants ile kullanılmak üzere tasarlanmış küçük hücre dışı veziküller (EV) üzerinde yüzey epitopları algılamak için tekrarlanabilir yöntemi açıklanır. Yüzey antijeni CD9, tanıyan antikorlar ile CD63 ve CD81 birleştiğinde boncuk kullanarak belirli EV immunoprecipitation kullanır. Yöntem aşağı akım akış sitometresi analizi için optimize edilmiştir.

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Bu protokol ortotopik pankreas tümörlerinin cerrahi nesil ve taze izole mürin pankreas tümörlerinin hızlı sindirim açıklar. Sindirimden sonra, canlı bağışıklık hücresi popülasyonları daha fazla downstream analizi için kullanılabilir, akış sitometri ile hücre içi sitokin tespiti için T hücrelerinin ex vivo stimülasyon dahil.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Evlat edinen hücre transferi için farelerden alınan tümör infiltre lenfositleri (TIL'ler) akış sitometrisi yoluyla kullanmak için bir yöntem tanımladık. Bu protokol, sinjeneik pankreas kanseri fare modelinde tümörlere karşı TIL'lerin spesifik sitotoksisitesini doğrulamayı ve pankreas kanseri için evlat edinen hücre tedavilerinin geliştirilmesine ilişkin içgörüler sağlamayı amaçlamaktadır.

Pankreas Kanserinin Bir Fare Modelinde Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerin Flow Sitometri Tabanlı İzolasyonu ve Terapötik Değerlendirmesi

Öğrenin, tümör kaynaklı ekstraselüler veziküllerin immünojenitesini akım sitometrisi ile in vivo değerlendirme yöntemini. Bu protokol, kişiselleştirilmiş kanser tedavileri için immünoterapi potansiyelini keşfetmeye yardımcı olur.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Daha fazla video keşfet