Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

1 (elektronik tonlar) Biyolüminesan optogenetik, genetik olarak kodlanmış ışık kaynaklarının hücrelerin içindeki ve arasındaki biyolojik fonksiyonları ve ağları görselleştirebileceği ve kontrol edebileceği bir platform teknolojisidir. Biyolüminesans, lif optikleri ve uzun süreli fiziksel ışığa maruz kalma ile herhangi bir doku ve hücre hasarı olmadan hedef hücre popülasyonunda ifade edilen her ışık algılama alanına ulaşır. Başlamak için, Luciferin stoğunu, beş miligram liyofilize CTZ'yi 250 mikrolitre ilgili çözücüde çözerek hazırlamaya başlayın.

CTZ'nin duvarlar boyunca pipetle çözülmesini sağlayın. Şişeyi doğrudan ışıktan korurken, 0,5 mililitrelik siyah mikrosantrifüj tüplerinde 50 mikrolitre alikot hazırlayın ve alikotları ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Diğer tüm manipülasyonları, kırmızı ışıkla aydınlatılmış laminer bir akış başlığındaki ışığa dar bir odada gerçekleştirin.

Tek bir biyolüminesans ışık stimülasyonu gerçekleştirmek için, hücrelere 100 mikromolar'lık son bir konsantrasyonda eklemeden kısa bir süre önce, bir hücre kültürü ortamında çalışan bir Luciferin çözeltisi hazırlayın. Luciferin içeren ortamı hücrelere ekleyin ve istenen ışık stimülasyonu süresi boyunca inkübe edin. Kırmızı ışığı kapatın.

Gözler tamamen karanlığa ayarlanana kadar birkaç saniye bekledikten sonra, ışık emisyonunu gözle izleyin. Fotoğraf çekerek ışık emisyonunu belgeleyin. Luciferin içeren ortamı kültür ortamı ile değiştirerek ışık stimülasyonunu sonlandırın, ardından deney duyarlılığına bağlı olarak tüm Luciferin'i ortadan kaldırmak için hücreleri bir veya iki kez kültür ortamıyla yıkayın.

Hücre kaybını önlemek için, hücreleri PDL kaplı tabaklara tabaklayın ve hücreleri inkübe edin. Tekrarlanan biyolüminesans ışık stimülasyonu gerçekleştirmek için, bir kutu ve siyah tabakalar kullanarak canlı hücre görüntüleme mikroskobunun etrafında ışık geçirmez bir bölme oluşturarak canlı hücre görüntüleme odasını kurun. Odanın içinde bulunan tüm ışık kaynaklarının kaplandığından emin olun.

Perfüzyon sistemini, giriş için istenen çözelti ve bir atık konteynerine giden oda çıkışı ile kurun. Tekrarlanan stimülasyonların sayısına bağlı olarak, hazırlanan çalışan Luciferin görüntüleme solüsyonunu mikrosantrifüj tüplerine aliquot. Odaya transfekte hücrelere sahip bir kapak kapağı yerleştirin.

Pompayı çalışır durumda tutarken, pompanın giriş borusunu giriş kabından çıkarın. Giriş tüpünü Luciferin çözeltisine hızlı bir şekilde daldırın ve boruda herhangi bir hava boşluğunu önlemek için geçiş süresini kısa tutun. Luciferin çözeltisi alınır alınmaz, giriş tüpünü tekrar giriş kabına yerleştirin.

Giriş tüpünün, hücrelerin maruz kalması gereken fizyolojik modele bağlı olarak birkaç dakika ila saat aralıklarla gerektiği kadar Luciferin'e çıkarılmasını ve daldırılmasını tekrarlayın. Daha sonra hücreleri, transkripsiyon için 16 ila 24 saat boyunca ışık korumalı bir ortamda veya ışık stimülasyonunun etkisi değerlendirilene kadar geçen süre boyunca saklayın. Biyolüminesans aktivasyonunu in vivo olarak gerçekleştirmek için, eksi 80 santigrat dereceden bir CTZ şişesi alarak Luciferin'i hazırlayın, ardından ışık korumalı alanda oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.

500 mikrogram CTZ içeren her şişe için, bir pipet kullanarak 250 mikrolitre steril su ekleyin ve kauçuk tıpayı şişeye geri koyun. Tozu tamamen çözmek için yeniden yapılandırılmış cam şişeyi 55 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosunda birkaç dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiyi siyah bir mikrosantrifüj tüpe aktarın ve tüm CTZ'yi almak için duvarları durulayın.

Gerekli çözelti miktarını çıkardıktan sonra, kalan çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın. Aracı benzer şekilde hazırladıktan sonra, yeniden yapılandırdıktan ve alıntıladıktan sonra, Luciferin veya aracın hacmini hayvanın büyüklüğü ve seçilen uygulama rotası için gerekli olan aracı kaldırarak biyolüminesans ışık stimülasyonunu hazırlayın. Hayvana tasarlandığı gibi Luciferin veya araç enjekte edin.

Belirli bir davranışsal paradigma sırasında istenen rekombinaz aktivasyonu için, davranışsal testten hemen önce hayvana enjekte edin. Fazik transkripsiyon için, hayvana günlerce tekrar tekrar enjekte edin ve biyolüminesans uyarılmış hayvandan tasarlanan verileri toplayın. Hızlı ışık ve aktivite düzenlenmiş ekspresyon sistemi, muhabir geninin hücre içi kalsiyum iyonları ve ışık ile transkripsiyonuna izin verdi.

Mavi LED, sağlam muhabir floresansına yol açtı ve FLuc ifadesi, Luciferin ilavesinden sonra lüminesans ölçümleriyle belirlendi. In vivo görüntüleme sisteminde, hem LED hem de CTZ, FLuc ekspresyonunu sağlam bir şekilde arttırırken, transkripsiyon faktörü bileşeninin varlığı tek başına, muhtemelen spontan proteoliz nedeniyle önemli miktarda arka plan sinyaline neden olmuştur. NanoLuc, CRY / CIB dimerizasyonu ve ışığa duyarlı transkripsiyon faktörü EL222 yoluyla optojenik düzenleme için kullanıldı.

HEK-293 hücrelerine hCTZ eklenmesi ve 15 dakika sonra çıkarılmasıyla indüklenen biyolüminesans, KRI / CIB ve EL222 için 20 dakikalık LED maruziyetinden daha verimliydi. HRITZ ile birlikte transfekte edildiğinde iki sistem arasında transkripsiyon etkinliğinde anlamlı bir fark gözlenmedi, ancak KRI / CIB'nin füzyon proteinleri EL222'den daha verimliydi. CRY / CIB, hCTZ konsantrasyonundan bağımsız olarak EL222'ye kıyasla sürekli olarak daha yüksek arka plan seviyeleri göstermiştir.

VVD LOV proteini iCreV'ye dayanan ışığa duyarlı bölünmüş Cre rekombinazının biyolüminesansı test edildi. CTZ uygulamasından elde edilen sonuçlar, CTZ varlığının arka plan üzerindeki ifadeyi sağlam bir şekilde artırdığını ve LED uygulamasına benzediğini ortaya koymuştur. Sadece demir hareketli fotoreseptörleri aktive etmek için biyolüminesansı kullanmak, aynı zamanda herhangi bir fotosensör alanı, hücre fonksiyonlarının zamansal ve mekansal ölçekler arasında manipülasyonunu genişleten ışık stimülasyonuna başka bir boyut ekler.

Biyolüminesan optogenetik, hücrelerde ve model organizmalarda uygulanmıştır. Bu protokoller, in vitro ve in vivo olarak çok çeşitli yönlendirilmiş hipotezleri test etmek için özelleştirilebilir.