Name: Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Keşfedin kardiyak iskemi/reperfüzyon hasarını in vitro ko-kültür modeliyle nasıl taklit edilir. Endotelyal hücrelerin kardiyomiyositleri korumadaki rolünü ve hücreler arası mesafenin etkisini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen ABD Gazi İşleri Bakanlığı Biyomedikal Laboratuvar Ar-Ge Servisi (I01 BX003482) ve M.L.R.'ye kurumsal fonlar tarafından desteklenmiştir.

1. Deneysel hazırlama/kaplama
<ol><li>CM'leri ve EC'leri üreticinin talimatlarına göre koruyun.<ol>
<li>Satıcılardan geldiklerinde her iki hücre hattını da çözün. Taze maddelerle yıkandıktan sonra T25 şişelerde plaka. Her hücre kültürü ortamının, hücrelerin satın alındığı aynı satıcılardan satın alınması önerilir. Ertesi gün, hücreleri medya ile yenileyin ve birleştiğinde kullanın.</li>
		<li>Hücre kültürü inkübatörünü %21 O2, %5 CO2, %74N2 ile 37 °C'de tutun ve nemlendirilmiş halde tutun. NOT: Bu protokolde kullanılan Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri, C57BL/6 farelerin koroner arterlerinden izole edilir ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositleri yetişkin C57BL/6J fare kalplerinden izole edilir ve ticari olarak elde edilir (bkz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril koşullar altında plaka CM'leri 24 delikli plakaların dibine (alt tabaka) yerleştirin. 24 saat sonra, plaka EC'leri ko-kültür kuyusunun ekine (veya üst kısmına) sokar. EC kaplamadan 24 saat sonra, EC uçlarını CM plaka tabanlarına yerleştirerek ko-kültür periyoduna başlayın. Kullanmadan önce hücrelerin en az 12-24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin. Bu adımlar aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.<ol>
<li>Bir ışık mikroskobu altında CM hücre hattı akıcılığını tahmin edin. Kültür şişelerinde hücreler% 90 -% 100 oranında akıtılmış gibi göründüğünde, deneysel kaplamaya devam edin.</li>
		<li>Ortamları birleşik hücre kültürleri içeren şişelerden çıkarın ve T25 şişeleri için 3-5 mL Tripsin/Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile tripsinize edin. Şişeyi nazikçe çalkalayın, 2-5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin ve ardından enzimatik ilerlemeyi bir ışık mikroskobu altında değerlendirin. Hücreler yuvarlanmaya başladığında, hücreleri yüzeyden ayırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
		<li>Ayrılmadan sonra, tripsin / hücre çözeltisini T25 şişeleri için 10 mL ortam içeren 50 mL'lik bir tüpe ekleyerek tripsin çözeltisini etkisiz hale getirin. Yumuşak bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu 120 x g'de 2 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti 5 mL ortamda yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücre sayımı yapmak ve hücre canlılığını doğrulamak için, 10 μL yeniden askıya alınmış hücre ve 10 μL tripan mavi boyadan oluşan bir aliquot karıştırın. Bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. İstenilen tohumlama yoğunluklarını elde etmek için hücreleri taze normal ortamlarla seyreltin. Hacimler, istenen tohum yoğunluğuna ve stok çözeltilerinin hücre konsantrasyonuna bağlı olarak hesaplanır. Tüm kaplamalar steril koşullar altında yapılmalıdır.</li>
		<li>Hücre dışı matris ile önceden kaplanmış 24 delikli bir plakanın dibine kuyu başına 300.000 tohumlama yoğunluğunda plaka CM'leri. Hücrelerigece boyunca% 21 O2 ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.</li>
		<li>24 saat sonra, plaka uçlara kesici uç başına 100.000 optimum kaplama yoğunluğunda (kültür alanı 33,6mm2'dir) plakalanır (Şekil 1). 24 saatlik EC kaplamasından sonra, EC uçlarını CM kuyucuklarının içine yerleştirin ve ko-kültürü başlatın. Deneyleri yapmadan önce hücrelerin 12-24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin.</li>
		<li>Deneyler gerçekleştirildiğinde, hem CM'lerin hem de EC'lerin %80-%90 akıcılığa ulaştığından emin olun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. İskemi / reperfüzyon hasarını simüle etmek için hipoksi / reoksijenasyon In Vitro
NOT: Aşağıdaki adımların açıklandığı gibi gerçekleştirilmesi gerekir, arada duraklamayın.
<ol><li>Hipoksik ortamı, 50 mL'lik bir konik tüpe ~ 25 mL ortam dökerek hazırlayın. Üstünü silikon bir membranla hava ile kapatın ve bir delik açmak için sterilize edilmiş bir pipet kullanın. Başka bir delik oluşturun, bu sefer pipeti ortama yaklaşık 2/3 batırılmış halde bırakın.</li>
	<li>Ortamı hipoksik gazla (%0,0125 O2, %5 CO 2, %94,99 N2) 5 dakika boyunca 30 L/dak akış hızında yıkayın. Bu, hipoksi başladığında ortamda çözünenO2'yi en aza indirir (adım 2.5).</li>
	<li>Ekli hücreler içeren 24 delikli plakaların veya kültür eklerinin ortamını atın ve 100 μL/kuyucuk dolusu %10 Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) ile çok nazikçe yıkayın. Daha sonra, taze hazırlanmış hipoksik ortamın 500 μL'sini plakaların veya eklerin her bir oluğuna ekleyin. NOT: Ortamdaki hipoksi, hücreler ve medya için gerçek hipoksi adım 2.5'te başlamadan önce bu adımda mümkün olduğunca kısa bir süre kesintiye uğrar.<ol>
<li>Normoksik kontrol grubunda, orijinal ortamı glikoz ve serum içeren taze normal ortamlarla değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hipoksi odasını, odanın içine steril suyla dolu bir Petri kabı yerleştirerek nemlendirin. Daha sonra, hipoksik grupları içeren plakaları odaya yerleştirin.</li>
	<li>Hipoksi odacığını hipoksik gazla (%0.0125 O 2, %5 CO 2, %94.99 N2) 5 dakika boyunca 30 L/dk'lık bir akışla yıkayın. Odayı 24 saat boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Hipoksiden sonra, normal koşullar altında CM'leri ve EC'leri yetiştirin. Bunu yapmak için, plakaların/kesici uçların eski ortamını atın, normal ortamla değiştirin (glikoz ve serum içeren; her kuyucuk / ekin 500 μL'si) ve reperfüzyonu taklit etmek için 2 saat boyunca normal kültür koşulları altında (%21 O 2,% 5 CO2,% 74 N2, 37 ° C) inkübatörde saklayın.</li>
	<li>Ortam değişiminin herhangi bir etkisini kontrol etmek için, hipoksik ortam değiştirilirken aynı zamanda normoksik hücrelerin ortamını değiştirin. NOT: Şekil 2 , bu protokole şematik bir genel bakış sağlar.</li>
</ol>3. Uç nokta değerlendirmesi
<ol><li>Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakadan 96 delikli bir plakaya aktarın. 24 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 200 μL ortam kullanın ve buna göre 96 delikli plakanın dört kuyucuğuna eşit olarak dağıtın. Normoksiye karşı hipoksiye karşı HR için her biri bir plaka kullanın.</li>
	<li>Hücresel yaralanma derecesini, örneğin, üreticinin talimatlarını izleyerek bir sitotoksisite tahlil kiti kullanarak LDH için absorbansı ölçerek belirleyin. Tahlil protokolünde belirtildiği gibi tahlili 96 kuyucuklu bir plakada gerçekleştirin.</li>
</ol>4. İstatistik
<ol><li>Parametrik verileri ortalama/standart sapma olarak ve parametrik olmayan verileri medyan/çeyrekler arası aralıklı kutu grafikleri olarak görüntüleyin. Tip-1 hata olasılığını azaltmak için kabul edilebilir post-hoc testlerle yeterli parametrik ve parametrik olmayan çoklu karşılaştırma testleri yapılmalıdır. Anlamlılık tipik olarak 0,05 alfaya (iki kuyruklu) ayarlanır.</li>
	<li>Mevcut çalışmada yapılan tüm deneyler için, bir deneyde en az üç iyi replikasyon gerçekleştirin. İstatistiksel analiz için kullanılan her deneyin üç ila altı tekrarı vardı.</li>
</ol>

<ol><li>Hausenloy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+conditioning+and+targeting+reperfusion+injury%3A+a+30+year+voyage+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ischaemic conditioning and targeting reperfusion injury: a 30 year voyage of discovery.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 70(2016).</li>
<li>Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+ischemia-reperfusion+injury%3A+a+neglected+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 92-100 (2013).</li>
<li>Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+pathways+in+acute+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell death pathways in acute ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 16 (3-4), 233-238 (2011).</li>
<li>Colliva, A., Braga, L., Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-cardiomyocyte+crosstalk+in+heart+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-cardiomyocyte crosstalk in heart development and disease.</a> The Journal of Physiology. 598 (14), 2923-2939 (2020).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnology Journal. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Salzman, M. M., Bartos, J. A., Yannopoulos, D., Riess, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poloxamer+188+protects+isolated+adult+mouse+cardiomyocytes+from+reoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Research+%26+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Poloxamer 188 protects isolated adult mouse cardiomyocytes from reoxygenation injury.</a> Pharmacology Research & Perspectives. 8 (6), 00639(2020).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Martindale, J. J., Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+increased+cellular+oxidative+stress+and+myocardial+ischemia+reperfusion+injury+by+directed+sarcolemma+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of increased cellular oxidative stress and myocardial ischemia reperfusion injury by directed sarcolemma stabilization.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 26-37 (2014).</li>
<li>vander Meer, A. D., Orlova, V. V., ten Dijke, P., vanden Berg, A., Mummery, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-cultures+of+human+endothelial+cells+and+embryonic+stem+cell-derived+pericytes+inside+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-cultures of human endothelial cells and embryonic stem cell-derived pericytes inside a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13, 3562-3568 (2013).</li>
<li>Bidarra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+proliferative+modulation+of+human+mesenchymal+stem+cells+via+crosstalk+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and proliferative modulation of human mesenchymal stem cells via crosstalk with endothelial cells.</a> Stem Cell Research. 7, 186-197 (2011).</li>
<li>Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PloS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Mehes, E., Mones, E., Nemeth, V., Vicsek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+motion+of+cells+mediates+segregation+and+pattern+formation+in+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Collective motion of cells mediates segregation and pattern formation in co-cultures.</a> PloS One. 7, 31711(2012).</li>
<li>Miki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+co-culture+over+mono+cell+culture+in+simulating+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The advantages of co-culture over mono cell culture in simulating in vivo environment.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 131 (3-5), 68-75 (2012).</li>
<li>Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Campbell, J., Davidenko, N., Caffarel, M., Cameron, R., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional+3D+co-culture+system+for+studies+of+mammary+tissue+morphogenesis+and+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology.</a> PLoS One. 6, 25661(2011).</li>
<li>Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+cell+culture+systems+for+drug+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic cell culture systems for drug research.</a> Lab on a Chip. 10, 939-956 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Protokoldeki kritik adımlar Kardiyoproteksiyonun hücresel mekanizmalarını incelemek için hücre ko-kültürü modelleri kullanılmıştır. Bu nedenle, aralarında anlamlı bir mesafe olan iki ayrı katmanın nasıl oluşturulacağı, uygun bir ortak kültür modelinin geliştirilmesi için çok önemlidir. Simüle edilmiş IR, yani HR, yaralanma çalışmasındaki bir zorluk, sadece iskeminin (hipoksi) kendisinin değil, aynı zamanda reperfüzyonun (reoksijenasyon) hücresel işlev bozukluğunu şiddetlendirmesidir. Bu nedenle, gerçe...

İskemik kalp hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir 1,2. Bununla birlikte, reperfüzyonun tedavi sürecinin kendisi, miyokard iskemisi / reperfüzyon (IR) hasarı olarak bilinen kardiyomiyosit ölümüne neden olabilir, bunun için hala etkili bir ilaç yoktur3. Endotel hücrelerinin (ECs), kardiyomiyositleri (CM'ler) parakrin sinyallerin salgılanması ve hücreden hücreye etkileşimler yoluyla koruduğu öne sürülmüştür4.
Hücre ko-kültürü modelleri, otokrin ve / veya parakrin hücre-hücre etkileşimlerinin hücre fonksiyonu ve farklılaşması üzerindeki rolünü araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Ko-kültür modelleri arasında, karışık ko-kültür, iki farklı hücre tipinin, istenen hücre oranında tek bir kültür bölmesinde doğrudan temas halinde olduğu en basitolanıdır 5. Bununla birlikte, hücre tipleri arasındaki ayrı tedaviler ve tek bir hücre tipinin aşağı akış analizi, karışık popülasyon göz önüne alındığında kolayca mümkün değildir.
Önceki çalışmalar, hipoksik ve iskemik hakaretlerin, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı ile ölçülen hücre zarının bütünlüğünde önemli hasara neden olduğunu göstermiştir. Bu yaralanma reoksijenasyon üzerine kötüleşirve reperfüzyon hasarı 6,7,8'i taklit eder. Mevcut protokolün amacı, EC'lerin varlığının, hipoksi ve reoksijenasyonun (HR) neden olduğu CM'lerin hücre zarı sızıntısını doza bağımlı olarak azaltabileceği ve EC'lerin koruyucu etkisinin iki hücre hattı arasındaki temas mesafesinin değiştirilmesiyle optimize edilebileceği hipotezlerini test etmekti. Bu nedenle, üç tip hücre kültürü inserti ve Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositleri kullandık. Corning, Merck Millipore ve Greiner Bio-One markalı kesici uçlar, sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 mm'lik hücreler arası hat mesafelerine sahip üç farklı hücre kültürü çapraz konuşma koşulu oluşturmamızı sağladı. Her durumda kesici uç başına 100.000 ECs kaplandı.
Ek olarak, ko-kültürdeki EC'lerin yoğunluğunun bu modelde İK hasarının zayıflamasına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için, CM'ler tarafından EC konsantrasyonu ve LDH salınımı arasındaki doz-yanıt ilişkisini inceledik. ECs, 2.0 mm'lik kesici uçta kesici uç başına sırasıyla 25.000, 50.000 ve 100.000 olarak kaplandı.
Bu rapor, araştırmacıların bu önemli modeli kendi avantajlarına kullanmaları için adım adım bir yaklaşım sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Yetişkin Fare Kardiyomiyositleri (CM'ler)</td><td>Celprogen Inc</td><td>11041-14</td><td>Yetişkin C57BL/6J fare kalp dokusundan izole edilmiştir</td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı Kontes II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td>Hücre sayılarını hesaplamak için hücre sayımı</td></tr><tr><td>Biyo-Güvenlik Kabini</td><td>Nuaire</td><td>NU425400</td><td>Hücre kültürü steril başlık</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Dondurma Ortamı</td><td>Hücre Biyolojikleri Inc</td><td>6916</td><td>Uzun süreli hücre hattı depolaması için hücre dondurma için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü İnkübatörü</td><td>Nuaire</td><td>Nu-5500</td><td>Normal hücre yaşam koşullarını sağlamak için (% 21 O < alt > 2 < / alt >,% 5 CO< alt > 2 < / alt >,% 74 N < alt > 2 < / alt >, 37 derece; C, nemlendirilmiş)</td></tr> <tr><td>Hücre Kültürü İnkübatörü Gaz Tankı</td><td>AL Sıkıştırılmış Gazlar</td><td>UN1013</td><td>Hücre kültürü inkübatörü için gerekli gaz&nbsp;</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Ekleri A (0,5 mm)</td><td>Corning Inc</td><td>353095</td><td>EC-CM ko-kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Ekleri B (1,0 mm)</td><td>Milicell Millipore</td><td>PIHP01250</td><td>EC-CM ko-kültürü için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Ekleri C (2,0 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662640</td><td>EC-CM ko-kültür</td></tr><tr><td>Santrifüjü</td> için kullanılır <td>Anstel Enterprises Inc</td><td>4235</td><td>Hücre kültürü kaplama ve pasajlama için</td></tr><tr><td>CMs Hücre Kültürü Şişeleri T25</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14</td><td>CMs normal kültür için kullanılır, üretici tarafından kaplanmıştır</td></tr><tr><td>CMs Hücre Kültürü Ortamı Komple</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14S</td><td>CMs kültürü komple</td></tr><tr><td>ortam CMs Hücre Kültürü Ortamı Komple Fenol içermeyen</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14PN</td><td>LDH ölçümü sırasında kullanılan fenol kırmızısı içermeyen CMs kültür ortamı</td></tr><tr><td>CMs Hücre Kültürü Plakaları 96 kuyu</td><td>Celprogen Inc</td><td>E11041-14-96well</td><td>LDH ölçümü deneyleri için kullanılır, üretici</td></tr> CMs tarafından kaplanmıştır <tr><td>CMs Hipoksi Hücre Kültürü Ortamı</td><td>Celprogen Inc</td><td>M11041-14GFPN</td><td>CMs hipoksik durumda hücre kültürü (glikoz ve serum içermeyen)</td></tr> <tr><td>Kontes hücre sayma odası slaytları</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Hücre sayacı için kullanılan sayma slaytları</td></tr><tr><td>Cyquant LDH Sitotoksisite Kiti</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>C20301</td><td>LDH ölçüm kiti</td></tr><tr><td>ECS Hücre Kültürü Şişeleri T25</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>FB012935</td><td>EC'ler için kullanılır normal kültür</td></tr><tr><td>EC'ler Hücre Kültürü Ortamı Komple</td><td>Hücre Biyolojikleri A.Ş</td>. <td>M1168</td><td>ECS kültürü tam ortamı</td></tr><tr><td>ECS Hücre Kültürü Ortamı Komple Fenol içermeyen</td><td>Hücre Biyolojileri A.Ş</td><td>. M1168PF</td><td>LDH ölçümü sırasında kullanılan fenol kırmızısı içermeyen ECS kültür ortamı</td></tr><tr><td>ECS Hücre Kültürü Plakaları 96 kuyulu</td><td>Fisher Scientific (Costar)</td><td>3370</td><td>LDH deneyleri için kullanılır ölçüm</td></tr><tr><td>ECS Kültürü Jelatin Bazlı Kaplama Çözeltisi</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>6950</td> ECS Hipoksi Hücre Kültürü Ortamı için <td>şişe ve plakaları kaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>Cell Biologics Inc</td><td>GPF1168</td><td>ECs hücre kültürü hipoksik durumda (glikoz ve serum içermez)</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>MT35011CV</td><td>Hücre kültürü ve bakımı için FBS-HI USDA onaylı</td></tr><tr><td>Hipoksi Odası Kök</td><td>Hücre Teknolojileri</td><td>27310</td><td>%0.01 O2 ortamı ile hipoksik bir durum oluşturmak için</td></tr><tr><td>Hipoksi Odası Akış Ölçer</td><td>StemCell Teknolojileri</td><td>27311</td><td>Tutarlı bir gaz akış hızı için hipoksik gaz tankına bağlanmak için</td></tr><tr><td>Hipoksik Gaz Tankı (%0.01 O2 Silindir)</td><td>AL Sıkıştırılmış Gazlar</td><td>UN1956</td><td>Hipoksik ortamı ve odayı yıkamak için kullanılır (% 0.01 O < alt > 2 < / alt > % 5 CO< alt > 2 < / alt > / 94.99N < alt > 2 < / alt >)</td></tr> <tr><td>Mikroskop ve nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td>Hücre durumunu gözlemlemek için</td></tr><tr><td>Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri (EC'ler)</td><td>Cell Biologics Inc</td><td>C57-6093</td><td>C57BL/6 farelerin koroner arterinden izole</td></tr> edilmiştir <tr><td>NUNC 15ML CONICL Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td>Hücre kültürü işlemi, deneyler, çözelti hazırlama vb. için.</td></tr><tr><td>NUNC 50ML CONICL Tüpleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td>Hücre kültürü işlemi, deneyler, çözelti hazırlama vb. için.</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Kültür veya deneyler sırasında hücre yıkama için kullanılır</td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu</td><td>BioTek Enstrüman</td><td>11120533</td><td>Kolorimetrik veya florometrik plaka okuma</td></tr><tr><td>Reaksiyonu 96 Well Palte (kapağı temizle)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565226</td><td>LDH ölçüm plakası okuması için kullanılır</td></tr><tr><td>CM'ler için Tripsin/EDTA</td><td>Celprogen Inc</td><td>T1509-014</td><td>1 x steril filtreli ve doku kültürü test edilmiş</td></tr><tr>ECS <td>Cell Biologics Inc</td><td>6914/0619</td> için<td>Tripsin/EDTA</td><td>%0,25, hücre kültürü test edilmiştir</td></tr></tbody></table>

kardiyak İskemi / reperfüzyonu in vitro taklit etmek için bir hücre ko-kültür modelinin geliştirilmesi

Development of a Cell Co-Culture Model to Mimic Cardiac Ischemia/Reperfusion In Vitro

İskemik kalp hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm ve sakatlık nedenidir. Reperfüzyon iskeminin ötesinde ek yaralanmalara neden olur. Endotel hücreleri (ECs), kardiyomiyositleri (CM'ler) hücre-hücre etkileşimleri yoluyla reperfüzyon hasarından koruyabilir. Ko-kültürler, hücre-hücre etkileşimlerinin rolünü araştırmaya yardımcı olabilir. Karışık bir ko-kültür en basit yaklaşımdır, ancak izole tedaviler ve tek hücre tiplerinin aşağı akış analizleri mümkün olmadığından sınırlıdır. ECs'nin CM hücre hasarını doza bağımlı olarak zayıflatıp zayıflatamayacağını ve bu korumanın iki hücre hattı arasındaki temas mesafesini değiştirerek daha da optimize edilip edilemeyeceğini araştırmak için, hücreler arası katman mesafelerinde 0.5'te değişen üç tip hücre kültürü ekini test etmek için Fare Primer Koroner Arter Endotel Hücreleri ve Yetişkin Fare Kardiyomiyositlerini kullandık. Sırasıyla 1,0 ve 2,0 mm. Sadece CM'lerde, laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı ile değerlendirilen hücresel hasar, hipoksi sırasında ve mesafe 0.5 ve 1.0 mm'ye kıyasla 2.0 mm olduğunda reoksijenasyon sonrasında önemli ölçüde artmıştır. ECS ve CM'ler neredeyse doğrudan temas halinde olduğunda (0.5 mm), hipoksi sonrası CM'lerin reoksijenasyon hasarında sadece hafif bir zayıflama vardı. 2.0 mm mesafe ile ECs, hem hipoksi hem de hipoksi / reoksijenasyon sırasında CM yaralanmasını zayıflattı, bu da EC'lerin CM'lerle çapraz konuşması için yeterli kültür mesafesinin gerekli olduğunu gösterdi, böylece salgılanan sinyal molekülleri dolaşabilir ve koruyucu yolları tamamen uyarabilir. Bulgularımız, ilk kez, EC / CM ortak kültür mekansal ortamının optimize edilmesinin, EC'lerin simüle iskemi / reperfüzyon hasarına karşı CM korumasındaki rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu raporun amacı, araştırmacıların bu önemli modeli kendi avantajlarına kullanmaları için adım adım bir yaklaşım sağlamaktır.

Bu deneyde kullanılan üç kesici uç türü (A, B, C) 0,4 μm'lik aynı gözenek boyutuna sahiptir. Aralarındaki tek fark, iki ortak kültürlü hücre katmanı arasındaki mesafelerin sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 mm olmasını sağlayan (Şekil 3) ve farklı satıcılardan (ayrıntılar için bkz.
IR hasarını simüle etmek için HR'ye maruz kalan iki hücre hattının ayrı katmanlarıyla in vitro bir ko-kültür modeli oluşturmak için, ECS ile birlikte kültürlenmiş veya ...

Uzamsal mesafe, ayrı endotel ve kardiyomiyosit hücre katmanlarının bir ko-kültür modelinde hipoksi / reoksijenasyon hasarının değerlendirilmesinde anahtar bir parametredir, bu da ilk kez, kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin gerekli olduğunu düşündürmektedir.

Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi

Ischemic heart disease is the leading cause of death and disability worldwide. Reperfusion causes additional injury beyond ischemia. Endothelial cells ...

Bulgumuz, endotel hücreli kardiyomiyosit ko-kültür uzamsal ortamının optimize edilmesinin, simüle iskemi reprofüzyon hasarına karşı kardiyomiyosit korumasında endotel hücrelerinin rolünü test etmek için uygun bir in vitro model sağlamak için gerekli olduğunu göstermektedir. Hücre ko-kültürü modelleri, hücre-hücre etkileşimlerinin hücre fonksiyonu ve farklılaşması üzerindeki rolünü araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, hücre tipleri arasındaki ayrı tedaviler ve tek bir hücre tipinin aşağı akış analizi, karışık ko-kültürde kolayca mümkün değildir.Bu çalışma, hipoksi reprofüzyon hasarını indükleyebilecek ve tek bir hücre tipi üzerindeki sonuç ve etkileri inceleyebilecek, aralarında anlamlı bir mesafe olan iki ayrı hücre katmanı oluşturmayı amaçlamıştır. Her iki hücre hattını da çözerek hazırlığa başlayın. Hücreleri taze maddelerle yıkadıktan sonra T25 şişelerine yerleştirin.Ertesi gün, hücreleri medya ile yenileyin ve birleştiğinde kullanın. Hücre kültürü inkübatörünü% 21 oksijen,% 5 karbondioksit ve% 74 azot ile 37 santigrat derecede tutun. Nemli tutun.Kardiyomiyositlerin hücre hattı akıcılığını bir ışık mikroskobu altında tahmin edin. Ortamları birleşik hücre kültürleri içeren şişelerden çıkarın ve şişe başına üç ila beş mililitre tripsin-EDTA ile tripsinize edin. Şişeyi nazikçe çalkalayın ve iki ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Bundan sonra, enzimatik ilerlemeyi bir ışık mikroskobu altında değerlendirin. Ayrılmadan sonra, trysin veya hücre çözeltisini T25 şişe başına 10 mililitre ortam içeren 50 mililitrelik bir tüpe ekleyerek tripsin çözeltisini etkisiz hale getirin. Yumuşak bir hücre peleti elde etmek için hücre süspansiyonunu iki dakika boyunca 120 x g'de santrifüj yapın.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve peleti bir ortamın beş mililitresinde yeniden askıya alın. Ardından, hücre sayımı yapın ve hücre canlılığını onaylayın. 10 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre ve 10 mikrolitre tripan mavisi boyayı karıştırın ve aliquotlayın, ardından bir hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın.İstenilen tohumlama yoğunluklarını elde etmek için hücreleri taze normal ortamlarla seyreltin. 24 kuyucuklu bir plaka ön kaplamasını hücre dışı matris ve plaka kardiyomiyositleri ile plakanın dibine kuyucuk başına 300.000 tohumlama yoğunluklarında alın. Hücreleri gece boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede tutun.24 saat sonra, endotel hücrelerini kesici uç başına 100.000 optimum kaplama yoğunluğunda kesici uçlara plakalayın. Endotel hücre kaplamasından 24 saat sonra, kardiyomiyosit kuyucuklarının içine endotel hücre ekleri yerleştirin ve ko-kültürü başlatın. Deneyleri gerçekleştirmeden önce hücrelerin 12 ila 24 saat boyunca birlikte kültürlenmesine izin verin.Hipoksik ortamı, 50 mililitrelik konik bir tüpe yaklaşık 25 mililitre ortam dökerek hazırlayın. Üstünü silikon bir membranla hava ile kapatın ve bir delik açmak için sterilize edilmiş bir pipet kullanın. Bundan sonra, başka bir delik oluşturun ve pipetlerin yaklaşık 2 / 3'ünü ortama batırılmış halde bırakın.Ortamı dakikada 30 litre akış hızında beş dakika boyunca hipoksik gazla yıkayın, ardından bağlı hücreler içeren 24 delikli plakaların veya kültür eklerinin ortamını atın. Bunları kuyu başına% 10 PBS'lik 100 mikrolitre ile çok nazikçe yıkayın, plakaların veya eklerin her bir oyuğuna taze hazırlanmış hipoksik ortamın 500 mikrolitresini ekleyin. Orijinal ortamı, normoksik kontrol grubunda glikoz ve serum içeren taze normal ortamla değiştirin.Odayı nemlendirmek için hipoksi odasına steril suyla dolu bir Petri kabı yerleştirin. Daha sonra hipoksik grupları içeren plakaları odaya yerleştirin. Hipoksi odasını dakikada 30 litrelik bir akışta beş dakika boyunca hipoksik gazla yıkayın.Bundan sonra, odayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörün içine yerleştirin. Hipoksiden sonra, plakaların veya eklerin eski ortamını atın ve plakaların her duvarına glikoz ve serum içeren 500 mikrolitre normal ortam ekleyin, ardından reperfüzyonu taklit etmek için plakaları normal kültür koşulları altında iki saat boyunca bir inkübatörün içinde saklayın. Hücre kültürü ortamını 24 delikli plakadan 96 delikli bir plakaya aktarın, ardından 24 delikli plakanın her bir kuyucuğundan 200 mikrolitre ortam alın ve 96 delikli plakanın dört kuyucuğuna eşit olarak dağıtılın.96 delikli bir plakada bir sitotoksisite testi kiti kullanarak LDH için absorbansı ölçün ve hücresel yaralanma derecesini belirlemek için üreticinin talimatlarını izleyin. Bu çalışmada üç tip kesici uç değerlendirilmiştir. Her üç kesici uç da 0,4 mikrometrelik aynı gözenek boyutuna sahipti.Aralarındaki tek fark, iki ortak kültürlü hücre katmanı arasındaki mesafelerin 0,5, 1,0 ve 2,0 milimetre olmasına izin veren taban yüksekliğine kadar olan uçtu. Bu protokol kullanılarak, hücreler normal oksijen koşulları altında kültürlendi ve daha sonra normoksik kontrol grubu ve hipoksi grubu olmak üzere iki gruba ayrıldı. 24 saat sonra, her iki grup da medya ile yenilendi ve son nokta tahlillerini yapmadan önce iki saat daha normal oksijen koşulları altında kültürlendi.Tek başına kardiyomiyosit için laktat dehidrogenaz salınımını, tek başına endotel hücrelerini ve kardiyomiyositin endotel hücreleri ile ko-kültürünü değerlendirmede üç tip kültür ekinin karşılaştırılması burada normoksik, sadece hipoksi ve hipoksi reoksijenasyon koşulları altında gösterilmiştir. Hücre katmanları arasında 0.5 milimetrelik bir mesafe ile hipoksi, kardiyomiyositler tek başına kültürlendiğinde normoksiye kıyasla LDH salınımının önemli ölçüde artmasına neden oldu. Bununla birlikte, LDH, hipoksi reoksijenasyon grubunda, hipoksi sadece gruba kıyasla sadece biraz artmıştır.Endotel hücreleri ve kardiyomiyositler birlikte kültürlendiğinde, sadece hipoksi koşulları altında LDH salınımının artması azalmadı. Bu da endotel hücrelerinin hipoksi sadece hipoksi koşulları altında tek başına kardiyomiyositler grubuna kıyasla herhangi bir koruyucu etkiye sahip olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, endotel hücreleri HR sırasında kardiyomiyositler üzerinde hafif fakat önemli bir koruma uyguladı. Hücre katmanları arasındaki mesafe bir milimetre olduğunda, LDH salınımı da kardiyomiyositlerde sadece hipoksi koşulu altında önemli ölçüde artmıştır.Bununla birlikte, 0.5 milimetrelik ekin aksine, kardiyomiyositlerdeki LDH artışı sadece HR tarafından hipoksi koşullarına göre güçlendirilmiştir. Bu artış, iki milimetrelik kesici uç ile daha da belirgindi. İki milimetrelik eklerle kaplanmış endotel hücrelerinin konsantrasyonu, kesici uç başına sırasıyla 25.000, 50.000 ve 100.000 hücreye titre edildi.ko-kültürde artan endotel hücre yoğunluğunun, HR'nin neden olduğu LDH salınımının doza bağımlı zayıflamasına yol açtığı bulunmuştur. Bununla birlikte, normoksik koşullar altında böyle bir etki görülmemiştir. Bu ko-kültür metodolojisi endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerle sınırlı değildir. Bu yöntemler, ilgilenilen birden fazla organdaki çeşitli hücre hatları arasındaki spesifik hücre-hücre etkileşimlerinin araştırılmasına yardımcı olmalıdır.

development-cell-co-culture-model-to-mimic-cardiac

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bir Kök Hücre Nakli In vitro Simüle İskemi / Reperfüzyon Modeli

Bu protokol, preklinik ilaç testi için insan kardiyak dilimlerinin kesilmesi ve kültüre edilmesi prosedürünü açıklar ve bu dilimlerden aynı anda transmembran voltajı ve hücre içi kalsiyum sinyallerini kaydetmek için optik haritalamanın kullanımını ayrıntılarıyla açıklar.

İnsan Organotipik Kardiyak Dilimlerinin Çift Voltaj ve Kalsiyum Optik Haritalaması ile Preklinik Kardiyak Elektrofizyoloji Değerlendirmesi

İskemiye neden olan doku hasarının kantitatif değerlendirilmesi için bir yöntem le birlikte, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen kardiyomiyositler kullanılarak iskemik kalp hastalığı nın bir modelini saklı atıyoruz. Bu model ilaç tarama ve iskemik kalp hastalığı üzerinde daha fazla araştırma için yararlı bir platform sağlayabilir.

HiPSC Türetilmiş Kardiyomiyosit Kullanarak İskemik Kalp Hastalığı Modeli ve Kardiyomiyosit Kontraksiyonunun Video Tabanlı Karşılaştırılması

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Farklı hipotermi derecelerinin miyokard koruması üzerindeki belirgin etkileri ayrıntılı olarak değerlendirilmemiştir. Bu çalışmanın amacı, insan kardiyomiyosit tabanlı bir modelde farklı hipotermi tedavilerinin ardından hücre ölüm seviyelerini ölçmek ve gelecekteki derinlemesine moleküler araştırmaların temelini atmaktı.

İnsan Kardiyak Miyosit Modelinde Hipotermi-Önkoşullama Sonrası Miyokard Korumasının İn vitro Değerlendirmesi

Bu protokol, 3Boyutlu kardiyak küresel oidleri (CSs) asılı damlalarda hücreleri bir arada oluşturarak imal etmeyi amaçlamaktadır. Kollajen gömülü CSs doksorubisin ile tedavi edilir (DOX, bir kardiyotoksik ajan) kalp yetmezliği modeli fizyolojik konsantrasyonlarda. DOX-treated CSs kullanılarak in vitro test kalp yetmezliği hastaları için yeni tedaviler belirlemek için kullanılabilir.

İn vitro Biyomühendislik Kalp Dokuları Olarak Kardiyak Sferoidler İnsan Kalp Patofizyolojisi Çalışma

Bu protokolün amacı, kardiyak doku mühendisliği, ilaç taraması ve hastalık modelleme uygulamaları için biyomimetik, kollajen bazlı bir hidrojel içinde kardiyak fibroblastlar (KF' ler) ile birlikte kültürlenmiş kök hücre türevi kardiyomiyositlerden oluşan, yüksek hizalanmış insan kardiyak dokusunun üç boyutlu (3D) mikroakışkan modelinin gelişimini açıklamak ve göstermektir.

Mikroakışkan Bir Platformda 3D Organize İnsan Kardiyak Dokusu Geliştirme

Bu makalede, I/R gelişimini ve tedavisini daha iyi anlamak için omurilik iğnesi özelleştirilmiş kanca kullanılarak 3 günlük civciv embriyosunda iskemi-reperfüzyon (I/R) modellemesi açıklanmaktadır. Bu model basit, hızlı ve ucuzdur.

Üç Günlük Gelişmekte Olan Civciv Embriyosu Kullanılarak Hook İskemi-Reperfüzyon Modelinin Üretimi

Kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak biyomühendislik yapılan üç boyutlu kalp dokuları, doğal kardiyak nişin temel yönlerini özetlerken, sağlıklı ve hastalıklı insan miyokardını in vitro incelemek için umut verici modeller olarak ortaya çıkmıştır. Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerden üretilen yüksek içerikli tasarlanmış kardiyak dokuların üretilmesi ve analiz edilmesi için bir protokolü açıklamaktadır.

Tasarlanmış Kardiyak Dokuların Veri Toplamasını ve Model Verimini İyileştirmek için Bir Biyoreaktör Tasarlama

Bu çalışma, sağkalım vakaları için sol mini torakotomi veya sağkalım dışı vakalar için orta hat sternotomi kullanan tavşanlarda akut bölgesel miyokardiyal iskemi ve reperfüzyon hasarının yüksek oranda tekrarlanabilir bir hayvan modelini göstermektedir.

Tavşanlarda İskemi ve Reperfüzyon Hasarı Modeli

Kendi kendine oluşan insan kalp organoidleri (hCO'lar), insan kalp gelişimi ve hastalıklarını modellemek için ortaya çıkan bir sistemdir. Burada, hipoksi-reoksijenlenme ile hCO'ların oluşturulması ve yaralanması için bir metodoloji ve yaralanma sonrası beklenen histolojik ve fonksiyonel sonuçların detayları sunulmaktadır.

Kendi Kendini Oluşturan İnsan Kardioidlerinde Hipoksi-Reoksijenlenme Yaralanma Modeli

Keşfedin kardiyak iskemi/reperfüzyon hasarını in vitro ko-kültür modeliyle nasıl taklit edilir. Endotelyal hücrelerin kardiyomiyositleri korumadaki rolünü ve hücreler arası mesafenin etkisini öğrenin.

Kardiyak İskemi / Reperfüzyonu In Vitro Taklit Etmek için Bir Hücre Ko-Kültür Modelinin Geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet