Tekrarlayan Düşükte Dört Endometriyal İmmün Hücre Tipinin Çok Yönlü Floresan İmmünohistokimyasal Boyanması
4 Ağustos 2021
Multipleks immünhistokimya ve multispektral görüntülemedeki gelişmelere rağmen, endometriyumda aynı anda majör immün hücrelerin yoğunluğunu ve kümelenişini karakterize etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu makalede, endometriyumdaki dört immün hücre tipinin eşzamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir multipleks boyama protokolü ve görüntüleme açıklanmaktadır.
Mevcut teknoloji, yedi işaretleyiciye kadar tespit etmek için aynı türlerde yetiştirilen antikorların kullanılmasına izin verir. Prosedürü gösteren loucia Chan, laboratuvardan bir teknisyen. Doku örneğine monte edilmiş formalin sabit parafin gömülü cam slaytları hazırlayarak, slaytları bir fırına düz bir şekilde yerleştirerek, doku yukarı bakacak şekilde 60 santigrat derecede pişirmek için başlayın.
Bir saat sonra, el yazmasında açıklandığı gibi, her biri 10 dakikada bir kimyasallar dizisiyle slaytları cilalayın ve yeniden sulayın. Slaytları tris tamponlu salinlere batırın ve ardından numuneleri düzeltmek için metanol ile seyreltilmiş formaldehit karışımı ile dolu plastik bir slayt kutusuna koyun. Ardından, slaytları iki dakika boyunca deiyonize suda iki kez yıkayın.
Slayt rafını pH 6.0'da sitrik asit tamponu ile dolu bir ısı direnci kutusuna yerleştirerek epitope alımına devam edin. Ve sonra kutuyu mikrodalga fırına yerleştirin, slaytları ilk önce 50 saniye boyunca% 100 güçte ısıtmak için, ardından aynı sıcaklığı korumak için% 20 güçte 20 dakika. Slaytları damıtılmış suda duruladıktan ve TBST ile yıkadıktan sonra, slaytı 10 dakika boyunca peroksidasyon engelleme çözeltisi içeren bir kavanoza daldırin.
Kuluçkadan sonra, slaytları damıtılmış suda durulayın ve TBST ile yıkayın, ardından slayttaki doku bölümünün etrafındaki bir sınırı işaretlemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Daha sonra slaydı TBST'de durulayın, doku bölümlerini blokaj tamponu ile örtün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada 15 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Bloklama reaktiflerini çıkarmak için, önce slaytları birincil ilgi antikoru ile kuluçkaya yatırın ve daha sonra ikincil antikor etiketli polimer yaban turpu peroksidaz etiketli inkübasyondan önce slaytları TBST ile üç kez yıkayarak birincil antikoru çıkarın.
Kuluçkadan sonra, TSA çalışma çözeltisi için Opal florasını uygulamadan önce slaytları yıkayın ve ardından slaydı antijen alma tamponu ile durulayın. Mikrodalga tabanlı sıyırma, mikrodalgada antijen alma tamponundaki slaytları mikrodalgada % 100 güçte, 50 saniye boyunca ısıtarak ve ardından mikrodalga güvenli kaplarda 20 dakika boyunca% 20 güçte ısıtarak mikrodalga bazlı sıyırma gerçekleştirin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika soğutun, slaytları damıtılmış suda ve TBST'de durulayın ve daha sonra dappy çözeltisi ile beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra uygun montaj ortamı ile monte etmeden önce kaydırağı havayla kurulayın. Slaytların görüntülenmesinden önce, iş istasyonundaki uygun filtreleri önceden ayarlar. 200 kat büyütme altında analiz için en az 10 alan yakalayın.
Hücreleri saymak için, nesne sayma ayarları panelini görüntülemek üzere adım çubuğundaki nesneleri say düğmesini tıklatın. Doku parçalanmışsa, nesnelerin bulunacağı doku kategorisini seçin. Ardından otomatik ölçekleme veya sabit ölçekten istediğiniz sinyal ölçeklendirmesini seçin.
Nesne segmentasyonu için, açılan listeden birincil bileşeni seçin. Diğer nesnelere dokunan nesneleri tek tek ve birleşik olmayan nesneler olarak algılamak için, en büyük boyut ve piksel kutusunu işaretleyin ve ardından rafine bölmeyi seçin. Daha sonra, verileri yakalanan her görüntü için toplam stromal hücre sayısına göre bağışıklık hücrelerinin yüzdeleri olarak ifade etmek için bağışıklık hücrelerindeki tüm stromal hücreleri ayrı ayrı sayın.
Daha sonra, son hücre sayısını tüm alanların ortalaması olarak bildirin. Görünüm düzenleyicisini kullanarak, işlem sonrası elde edilen veri tablolarını inceleyin ve sonra sayım veri tablosunu dışarı verin. Temsili analizde, endometrium örneğinde dört bağışıklık hücresi tipi farklılaştırıldı.
İşlenen görüntü doku segmentasyonunu epitel ve stromal bölmeler olarak gösterir. Multiplks immünostaining, doğurgan bir kontrol kadınından endometriyal biyopsiler üzerinde yapıldı ve açıklanamayan tekrarlayan düşük yapan bir kadın, bizim için CD3, CD56, CD68 ve CD20'yi temsil eden tek kat immünostainingde ortaya çıktı. Bağışıklık sesi belirlendikten sonra, sitokin altında daha fazla lekelenme, implantasyon başarısı için etkileşimlerini ve mekanizmalarını ele almaya yardımcı olabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, çoklu immünohistokimya ve multispektral görüntüleme kullanarak endometriyumdaki temel bağışıklık hücrelerinin yoğunluğunun ve kümelenmesinin eş zamanlı olarak karakterize edilmesindeki zorlukları ele almaktadır. Endometriyumdaki dört bağışıklık hücresi tipinin eş zamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir boyama protokolü açıklanmıştır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- İmmünoloji
- Endometrial biyoloji
- Multipleks görüntüleme teknikleri
Arka Plan
- Üreme biyolojisinde bağışıklık hücresi karakterizasyonunun önemi.
- Geleneksel boyama yöntemlerindeki zorluklar.
- Görüntüleme teknolojisindeki gelişmeler.
Kullanılan Yöntemler
- Multiplex immünohistokimya
- Formalinle fikse edilmiş parafine gömülü doku örnekleri
- Multispektral görüntüleme
Ana Sonuçlar
- Endometriyumda dört bağışıklık hücresi tipinin (CD3, CD56, CD68, CD20) başarıyla ayırt edildi.
- Bağışıklık hücresi dağılımı ve kümelenmesi görselleştirildi.
- İleriki çalışmalar için protokol geliştirmeleri sağlandı.
Sonuçlar
- Bu çalışma, endometriyumdaki bağışıklık hücrelerinin analizi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Bunun, üreme sağlığının ve implantasyon başarısının anlaşılması açısından önemli etkileri vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Multipleks floresan immünohistokimyasal boyama, tek bir doku kesiti içindeki birden fazla immün hücre popülasyonunun eş zamanlı kantifikasyonuna olanak tanıyarak reprodüktif immünoloji araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu yaklaşım, doğrudan hasta kaynaklı örneklerden mekansal olarak çözünür, multipleks immün profilleme verileri sağlayarak endometrial mikroçevre hipotezlerinin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Yöntem, fertil ve patolojik durumlar arasında immün hücre yoğunluğunun ve kümelenmesinin doğrudan karşılaştırılmasına imkan tanıyarak, implantasyon başarısızlığı ve tekrarlayan düşüklerle ilgili hedef doğrulama çalışmalarındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: CD3, CD56, CD68 ve CD20 markerlarının eş zamanlı saptanması yoluyla endometriyumdaki immün hücre etkileşimlerini içeren terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Seri kesit alma ve boyama ihtiyacını azaltarak, doku kesiti başına veri yoğunluğunu artırırken değerli klinik örneklerin korunmasını sağlar.
- Öngörü Güveni: İmplantasyon sırasında endometrial-immün etkileşimde rol oynayan hedeflerin biyolojik risk analizini destekleyen, kantitatif ve mekansal olarak çözümlenmiş immün hücre metrikleri sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek içerikli görüntüleme platformları ve otomatik görüntü analiz iş akışları için uygun, standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir floresan okumalar üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Formalinle tespit edilmiş parafin gömülü (FFPE) doku biyobankaları ile uyumludur ve biyobelirteç keşfi için geniş kohortların retrospektif analizine olanak tanır.
- Multipleks Optimizasyonu: Ardışık boyama ve sıyırma döngüleri aracılığıyla florofor girişimini gidererek her bir immün hücre belirteci için sinyal özgüllüğünü sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Sistem: Doğrudan insan endometrial biyopsileri için uygulanabilir olup, tekrarlayan düşüklerdeki immün disregülasyonu incelemek için klinik olarak ilgili bir model sunar.
- Translasyonel Süreklilik: Farklı örnek türleri genelinde tutarlı immün fenotipleme sağlayarak, keşif aşamasındaki immün profilleme ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Başlangıç hücre tipi tanımlamasının ardından sitokin aracılı immün hücre etkileşimlerinin araştırılmasını destekleyerek yolak düzeyinde hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, keşif biyolojisi aşamasına uygundur ve özellikle reprodüktif immünoloji programlarındaki immün hedef doğrulama ve fenotipik tarama çalışmalarını destekler.
- Keşif Biyolojisi: İmplantasyon penceresi sırasında endometriyumdaki bağışıklık hücresi kompozisyonu ve uzaysal organizasyona ilişkin hipotezlerin test edilmesini sağlar.
- Tarama: Farklı deneysel koşullar arasında bağışıklık hücresi yoğunluklarının ve kümelenme modellerinin karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif immünofloresan çıktılar üretir.
- Analitikler: Bağışıklık hücresi fenotiplemesi ve fonksiyonel durum çıkarımı için bilgi sağlayan multipleks floresan yoğunluğu ve ko-lokalizasyon verileri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Alt akış fonksiyonel assayleri için valide edilmiş bağışıklık hücresi markerları sağlayarak, insan örnek analizlerinden mekanistik takip çalışmalarına geçişte sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Endometriyum ve diğer dokulardaki çok sayıda bağışıklık profilleme çalışmasında uygulanabilecek, yeniden kullanılabilir bir immün boyama platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hastalıklı ve kontrol dokularındaki bağışıklık hücresi popülasyonlarının doğrudan, multipleks karşılaştırılmasına olanak tanıyarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tek lam üzerinde optimize edilmiş ardışık boyama ve sıyırma protokolleri aracılığıyla reaktif verimliliğini artırır ve değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: İmplantasyon başarısına veya başarısızlığına bağışıklık mikroçevresinin katkılarını netleştirerek, reprodüktif terapilerdeki devam/dur kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Bağışıklık hücresi yoğunluğu, kümelenmesi ve epitelyal veya stromal bölmelerle olan mekânsal korelasyonuna dayanarak hedeflerin riskle uyumlu şekilde önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Sinyallerin doğru şekilde tespit edilmesi ve miktarının belirlenmesi için immünohistokimya, floresan mikroskopi ve multispektral görüntü analizi konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikrodalga tabanlı antijen geri kazanım sistemlerine, floresan destekli lam tarayıcılara ve multipleks döngüler için onaylanmış Opal florofor kitlerine erişime bağımlıdır.
- Multipleks sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için bloklama, antikor inkübasyonu ve sıyırma (stripping) koşullarının laboratuvarlar arasında standart hale getirilmesi gereklidir.
- Yöntemin CD3, CD56, CD68 ve CD20 dışındaki farklı doku tiplerine veya immün hücre markerlarına uygulanması durumunda, antikor panellerinin adaptasyonu ve validasyon adımlarının uygulanması gerekir.
- Pratik sınırlamalar arasında, potansiyel florofor sızıntısı (bleed-through) ve görüntüleme sırasında dikkatli spektral ayırma gereksinimi yer almakta olup; bu durumlar sıralı sıyırma ve onaylanmış filtre ayarları ile çözülmektedir.
