Name: Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43ün Optogenetik Faz Geçişi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Keşfedin, optogenetik yöntemle zebra balığı spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişini inceleyerek ALS hastalığının hücresel mekanizmalarını canlı modelde görselleştirme tekniğini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant numaraları JP19K06933 (KA) ve JP20H05345 (KA) tarafından desteklendi.

Tüm balık çalışmaları, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvan Refahı Ofisi'nde (NIH, A5561-01 güvence numarası) bulunan Ulusal Genetik Enstitüsü'nün (Japonya) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (onay kimlik numarası 24-2) uyarınca gerçekleştirildi. ABD).
1. mnr2b promotöründen optogenetik TDP-43 geninin ekspresyasyonu için BAC'lerin yapımı
<ol><li>BAC hazırlığı<ol>
<li>Zebra balığı mnr2b locus (CH211-172N16, BACPAC Genomik) içeren bir zebra balığı BAC klonu satın alın. BAC DNA'sını, Isınma ve ark.18'de açıklandığı gibi CH211-172N16'yı barındıran DH10B Escherichia coli (E. coli) 5 mL gecelik LB kültüründen arındırın.</li>
		<li>CH211-172N16'yı, Warming ve ark.18'de açıklandığı gibi elektroporasyonla SW102 E. coli hücrelerine dönüştürün. NOT: Bac DNA'sının aynı elektroporasyon gününde E. coli'den arındırılması genellikle BAC dönüşümünün daha yüksek bir başarı oranı sağlar18. Aksi takdirde, saflaştırılmış BAC DNA'sı kullanıma kadar -20 °C'de tutulur.</li>
		<li>Tol2 transpozon aracılı BAC transgenesis19 için iTol2-amp kasetini, Asakawa ve ark.20'de açıklandığı gibi elektroporasyonla CH211-172N16'nın omurgasına sokun.<ol>
<li>E'nin gliserol stoğunu yap. polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (Ex Taq) ile homolog rekombinasyon aracılı entegrasyonu onayladıktan sonra iTol2-amp kaset entegrasyonu (CH211-172N16-iTol2A) ile CH211-172N16 taşıyan coli hücre klonları astar çifti Tol2-L-out (5'-AAA GTA TCT GGC TAG AAT CTT ACT TGA-3') ve pTARBAC-13371r (5'-TAG CGG CCG CAA ATT TAT TA-3') ve aşağıdaki koşulları kullanarak: 1 dakika boyunca 98 °C'de bir denatürasyon adımı, ardından 10 s için 95 °C'de 25 denatürasyon döngüsü, 15 s için 55 °C'de astar tavlama ve 1 dakika için 72 °C'de astar uzatma, 354 baz çift (bp) PCR ürününü güçlendirin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:opTDP-43h yapı<ol>
<li>Sırasıyla N ve C-termini'de mRFP1 ve CRY2olig ile etiketlenmiş insan vahşi tipi TDP-43/TARDBP (TDP-43h) için ifade kasetini taşıyan bir plazmid oluşturun (bundan sonra opTDP-43h)14. NOT: opTDP-43h parçası zebra balığı hsp70l gen promotör dizisi (650 bp) ve poliadenilasyon (polyA) sinyal dizisi ile kuşatılmalı ve ardından kanamycin direnç geni (hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan)14.</li>
		<li>Hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini hsp70l ve Kan'ı tavlayan astarlarla güçlendirin ve mnr2b geninin başlatıcı kodonlarının yukarı ve aşağı akışlarının 45 bp dizilerini astar çifti mnr2 kullanarak PCR (GXL DNA Polymerase) ile güçlendirinb-hspGFF-Forward (5'-tat cag cgc aat tac ctg caa ctc taa aca caa aag tgt tgc aGA ATT CAC TGG AGG CTT CCA GAA C-3') ve Km-r (5'-ggt tct tca tca tca aaa agg gcg tcg atc ctg aag ttc ttt gac ttt tcc atC AAT TCA GAA GAA CTC GTC AAG AA-3') aşağıdaki koşullarla: 1 dakika boyunca 98 °C'de bir denatürasyon adımı, ardından 10 s için 95 °C'de 30 denatürasyon döngüsü, 15 s için 55 °C'de astar tavlama ve 30 sn için 68 °C'de astar uzatma, ~5.7 bp'lik bir PCR ürününün yükseltülme.</li>
		<li>PCR ürünlerini agarose jel elektroforezi (100 V) ile ayırın ve hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan DNA bandını bir DNA sütunu ile arındırın. Saflaştırılmış hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetinin konsantrasyonu, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM EDTA içeren Tris-EDTA tamponunda (TE) 50 ng/μL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini, Isınma ve ark.18'de açıklandığı gibi elektroporasyonla CH211-172N16-iTol2A'ya sokun ve LB agar plakalarında ampisiline ve kanamsin dirençli transformantları seçin. Hsp70lp-opTDP-43h-polyA-Kan kasetini taşıyan CH211-172N16-iTol2A, mnr2b-hs:opTDP-43h olarak belirlenmiştir.</li>
		<li>Mnr2b-hs:opTDP-43h'yi bir BAC arıtma kiti kullanarak arındırın ve fenol/kloroform ekstraksiyonu sonrası TE'de 250 ng/μL'de çözün.</li>
	</ol></li>
	<li>mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z yapı<ol>
<li>OpTDP yerine N-terminusunda (EGFP-TDP-43z) gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ile etiketlenmiş zebra balığı vahşi tip tardbp taşıyan başka bir plazmid inşa edin -43h ancak aksi takdirde hsp70l-opTDP-43h-polyA-Kan yapısı (hsp70l-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan)14 ile aynıdır. OPTDP-43h'nin ışık stimülasyonu için iç kontrol olarak EGFP-TDP-43z kullanın.</li>
		<li>1.2.1-1.2.5'te açıklandığı gibi mnr2b lokustaki hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kasetini barındıran CH211-172N16-iTol2A oluşturun. Hsp70lp-EGFP-TDP-43z-polyA-Kan kasetini taşıyan CH211-172N16-iTol2A, mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z olarak belirlenmiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zebra balıklarında Tol2 transpoz aracılı BAC transgenez
<ol><li>40 mM KCl, fenol kırmızısı (%10 v/v), mnr2b-hs:opTDP-43h DNA'nın 25 ng/μL'si ve 25 ng/μL Tol2 transposase mRNA19 içeren enjeksiyon solüsyonunu hazırlayın.</li>
	<li>Enjeksiyon çözeltisinin 1 nL'sini (mineral yağda kalibre edilmiş yaklaşık 123 μm çapında bir damlacık) tek hücreli aşamada vahşi tip zebra balığı embriyolarının sitosoluna enjekte edin. Enjekte edilen balıkları, omurilik motor nöronları da dahil olmak üzere çeşitli embriyonik dokularda kırmızı floresan protein (RFP) pozitif agregaların oluşumu için 2-3 gün sonra floresan stereomikroskop altında tarayın (dpf). RFP pozitif balığı yetişkinliğe yükseltin.</li>
	<li>2.1 ve 2.2'de açıklandığı gibi mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z DNA'sını enjekte edin. EGFP pozitif balıkları yetişkinliğe yükseltin.</li>
	<li>Birkaç ay sonra, F1 yavrularını elde etmek için standart 2 L çiftleşme kafeslerine cinsel olarak olgunlaşmış enjekte edilmiş balık ve yabani tip balıkları çiftler halinde koyun. Plan-Neofluar 5x/0.15 objektif lens ile donatılmış bir epifluoresans mikroskobu kullanarak omurilik motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresan için 3 dpf'de F1 balıklarını tarayın. Tipik olarak, bir kurucu balık 10−20 enjekte edilen balıktan tanımlanır (germline bulaşma oranı% 5−10'dur).</li>
	<li>OpTDP-43h veya EGFP-TDP-43z ekspresyonunun yoğunluğu, kromozomal konum etkileri nedeniyle kurucu balıklar arasında değişebileceğinden, farklı kurucu balıklardan gelen birden fazla Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ve Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] kesici uçlarını izole edin ve karşılaştırın.</li>
	<li>Tg içeren yavrular elde etmek için Çapraz Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] ve Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] balık hatları [mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] Mendelian oranında çift transgenik balık.</li>
	<li>Balığı 30 mL E3 tamponu (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, %10-5 Metilen Mavisi) ve melanogenez inhibe etmek için 8-10 saat döllenme sonrası (hpf) 0.003% (w/v) N-feniltiyiourea ekleyin.</li>
	<li>Plastik kabı 30 hpf'den sonra alüminyum folyo ile örtün.</li>
</ol>3. Mavi ışık aydınlatması için LED hazırlanması
<ol><li>Tablette/telefonda yüklü olan ilişkili uygulamayı kullanarak LED paneli açın. Bir spektrometrenin probunu 6 kuyu kabının boş bir kuyusuna koyun ve LED ışığını uygulama aracılığıyla ~456 nm'de zirve yapmak üzere dalga boyuna ayarlayın. Optik güç ölçerin optik sensörlerini boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın (~0,61 mW/cm2). LED ışık ayarı kaydedilebilir ve uygulamada alınabilir.</li>
	<li>Çanak/LED panel ayarını 28 °C'de inkübatöre tanıtın. Balıkların görüntülenmesi 48 hpf'den başlamadan önce bu adımı tamamla.</li>
</ol>4. Optogenetik TDP-43'i ifade eden zebra balığı larvalarının görüntülenmesi
<ol><li>Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı en az 47 hpf'den önce seçin, yukarıda açıklanan epifluoresans mikroskobu kurulumunu kullanarak spinal motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresansına dayanmaktadır.</li>
	<li>Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı deforionat.</li>
	<li>42 °C'de 250 μg/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu içeren % 1 düşük erime sıcaklığında agarose önceden ısıtın.</li>
	<li>Kısaca Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43] çift transgenik balık kısaca anestezi E3 tamponda 48 hpf Tricane konsantrasyonu içeren.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış% 1 düşük erime sıcaklığında agarose'dan bir damla oda sıcaklığında cam taban kabına koyun. Cam tabaktaki kubbe şeklindeki agarose damlasının çapı 8-10 mm'dir.</li>
	<li>Pasteur pipet kullanarak, uyuşturulmuş balıkları cam taban kabındaki düşük erime sıcaklığındaki agarose ekleyin ve ardından birkaç kez pipetleyarak karıştırın. Balıkla birlikte agarose'a eklenen E3 tampon miktarını en aza indirin.</li>
	<li>Omuriliğin uygun bir yatay konumda olduğundan emin olmak için agarose katılaşması sırasında bir şırınga iğnesi kullanarak (tipik olarak ~ 1 dk) balığı yan tarafta tutun. Katılaşmadan sonra, kubbe şeklindeki agarose monteli balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu koyun.</li>
	<li>Piksel başına 4,0 μs (piksel başına 12 bit), amaç için dilim başına 1,0 μm adım boyutu ve uyarılma/emisyon dalga boylarının bir kombinasyonunu kullanarak, sayısal diyafram açıklığı 1,00 olan 20x su daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskopla tarayarak omuriliğin seri konfokal z bölümlerini elde edin: Kanal 1) EGFP için 473/510 nm ve Kanal 2) mRFP1 için 559/583 nm. NOT: Balığın ventral tarafındaki kloaka, zaman noktalarında omurga segmentlerinin (seviye 16-17) tanımlanmasına ve karşılaştırılmaya yardımcı olan referans olarak ilgi alanlarına (ROI) dahil edilir.</li>
	<li>Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz agarose'u bir şırınga iğnesi ile dikkatlice kırarak balıkları agarosedan çıkarın. Balığın agaroseya gömdülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarose <30 dakika boyunca gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.</li>
</ol>5. OpTDP-43h-ekspresyon balıklarının mavi ışık yayan diyot (LED) ışığının alan aydınlatması ile ışık stimülasyonu
<ol><li>Kuyuya 7,5 mL E3 tamponu ekleyin ve görüntülenmiş Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı kuyuya yerleştirin. Çanağı ve LED paneli bir ara parçayla (örneğin, beş slayt gözlüğü istiflenmiş olarak) 5 mm aralıklarla tutarak altı kuyulu tabağı LED panele yerleştirin.</li>
	<li>Mavi LED ışığını açın. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balıklardan bazılarını, unilluminated kontrol balıkları gerektiğinde alüminyum folyo ile kaplı ayrı bir altı kuyulu tabakta tutun (yani karanlık koşullarda)14.</li>
	<li>Aydınlatmadan sonra (örneğin, Şekil 3'te 72 hpf'de 24 saat boyunca), 4.3 - 4.9 adımlarını tekrarlayarak aydınlatılmış balığın omuriliğini görüntüleyin.</li>
</ol>6. Spinal motor nöronlarda optogenetik TDP-43'ün sitoplazmik yer değiştirmesinin görselleştirilmesi
<ol><li>Görüntü dosyasını, nih image tarafından geliştirilen ve https://imagej.net/Fiji/Downloads indirilebilen açık kaynaklı bir Java görüntü işleme programı olan ImageJ/Fiji21'de (Sürüm: 2.1.0/1.53c) açın.</li>
	<li>Odak düzlemleri arasında hareket etmek için Z kaydırma çubuğunu kullanın. Görüntü |'i tıklatarak birden çok dilimin maksimum yoğunluk projeksiyonu oluşturma Yığınlar | Z proje | Maksimum Yoğunluk ve ayar Omurilik motor kolonunun hemisegmentlerini kaplayan Başlangıç dilimi ve Durdurma dilimi.</li>
	<li>Görüntü |'na tıklayarak çok kanallı görüntüyü iki tek kanallı görüntüye bölün Renk | Kanalları Böl.</li>
	<li>Görüntü | tıklayarak sitoplazmik EGFP-TDP-43z'nin net bir şekilde görülebilmesini sağlamak için EGFP-TDP-43z sinyalini geliştirin | ayarlama Parlaklık/Kontrast ve Minimum ayarlama
</li>
	<li>Analiz |'ni tıklatarak yatırım getirisi yöneticisini açın Araçlar | Yatırım getirisi yöneticisi. Hücre gövdelerinin göreli konumlarına göre, her iki görüntüde de tanımlanabilen hücreleri 48 hpf ve 72 hpf olarak bulun. Freehand seçimlerini kullanarak EGFP-TDP-43z sinyali tarafından görselleştirilen tek spinal motor nöronlarının hücre gövdelerinin hatlarını özetleyerek ve ardından yatırım getirisi yöneticisinde Ekle[t] öğesini tıklatarak ROI'leri ayarlayın.</li>
	<li>Düz'ü kullanarak düz bir çizgi çizerek ve Analiz |'nı tıklatarak somanın ana eksenini ayarlayın EGFP-TDP-43z (C1) ve opTDP-43h (C2) görüntüleri için 48 ve 72 hpf'de Çizim Profili.</li>
	<li>Değerleri her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h sinyali için en büyük değere bölerek Çizim Profilini normalleştirin. X ve y'nin istatistiksel bir yazılımda XY grafiğini kullanarak sırasıyla soma ve göreli floresan yoğunluklarının ana eksenini temsil ettiği x-y koordinatlarıyla normalleştirilmiş değerleri çizin.</li>
</ol>7. ImageJ/Fiji kullanarak opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyalleri arasında oranmetrik karşılaştırma
<ol><li>ImageJ/Fiji'de görüntü dosyasını açın ve EGFP-TDP-43z'nin 6.1-6.5'teki gibi maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünü kullanarak tek mnr2b pozitif hücreler için ROI'leri ayarlayın. Arka plan sinyalini (arka plan yatırım getirisi) temsil etmek için ventral omuriliğin (örneğin, notochord) dışına bir yatırım getirisi ekleyin.</li>
	<li>Her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43 görüntüsü için Görüntü | Yığınlar | Z proje | Dilimleri Topla ve Hemispinal motor sütununu kaplayan Başlangıç dilimini ve Durdur dilimini ayarlayın.</li>
	<li>Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsüyle oluşturulan yatırım getirisi yöneticisini açın. EGFP-TDP-43z için görüntü penceresini seçip yatırım getirisi yöneticisinde Tümü Göster'i tıklatarak RoI'leri Toplam Dilimler görüntüsünde görüntüleyin. Her yatırım getirisi için ortalama değerler elde etmek üzere yatırım getirisi yöneticisinde Ölçül'ü tıklatın.</li>
	<li>7.3'te sağlanan aynı yordamı izleyerek opTDP-43h için ortalama değerler elde edin.</li>
	<li>Her yatırım getirisi için, arka plan yatırım getirisi için ortalamayı çıkardıktan sonra, opTDP-43h için çıkarılan ortalamayı, ORANSAL DEĞERI ELDE ETMEK İçİn EGFP-TDP-43z için çıkarılan ortalamaya bölün. Oranmetrik değerler farklı zaman noktaları arasında karşılaştırılabilir ve Prizma yazılımında Sütun grafiği kullanılarak sunulabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+and+size+scaling+of+membrane-less+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles.</a> Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).</li>
<li>Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-liquid+phase+separation+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Liquid-liquid phase separation in biology.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 39-58 (2014).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+rna+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair rna metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106 (3), 404-420 (2020).</li>
<li>Nedelsky, N. B., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+biophysics+and+neurology%3A+aberrant+phase+transitions+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Bridging biophysics and neurology: aberrant phase transitions in neurodegenerative disease.</a> Nature Reviews Neurology. 15 (5), 272-286 (2019).</li>
<li>Ramaswami, M., Taylor, J. P., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+ribostasis%3A+RNA-protein+granules+in+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Altered ribostasis: RNA-protein granules in degenerative disorders.</a> Cell. 154 (4), 727-736 (2013).</li>
<li>Nguyen, H. P., Van Broeckhoven, C., vander Zee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+genes+in+the+genomic+era+and+their+implications+for+FTD%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">ALS genes in the genomic era and their implications for FTD.</a> Trends in Genetics. 34 (6), 404-423 (2018).</li>
<li>Pakravan, D., Orlando, G., Bercier, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+therapeutic+potential+of+liquid-liquid+phase+separation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role and therapeutic potential of liquid-liquid phase separation in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 13 (1), 15-28 (2021).</li>
<li>Santamaria, N., Alhothali, M., Alfonso, M. H., Breydo, L., Uversky, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+disorder+in+proteins+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intrinsic disorder in proteins involved in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (7), 1297-1318 (2017).</li>
<li>Lagier-Tourenne, C., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+ALS%3A+the+FUS+about+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rethinking ALS: the FUS about TDP-43.</a> Cell. 136 (6), 1001-1004 (2009).</li>
<li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-phaseted+problems+of+TDP-43+in+selective+neuronal+vulnerability+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multi-phaseted problems of TDP-43 in selective neuronal vulnerability in ALS.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (10), 4453-4465 (2021).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+intracellular+phase+transitions+using+light-activated+optodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of intracellular phase transitions using light-activated optodroplets.</a> Cell. 168 (1-2), 159-171 (2017).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optogenetic+induction+of+stress+granules+is+cytotoxic+and+reveals+the+evolution+of+ALS-FTD+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Chronic optogenetic induction of stress granules is cytotoxic and reveals the evolution of ALS-FTD pathology.</a> Elife. 8, 39578(2019).</li>
<li>Mann, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Binding+Antagonizes+Neurotoxic+Phase+Transitions+of+TDP-43%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RNA Binding Antagonizes Neurotoxic Phase Transitions of TDP-43.</a> Neuron. 102 (2), 321-338 (2019).</li>
<li>Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+modulation+of+TDP-43+oligomerization+accelerates+ALS-related+pathologies+in+the+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic modulation of TDP-43 oligomerization accelerates ALS-related pathologies in the spinal motor neurons.</a> Nature Communications. 11 (1), 1004(2020).</li>
<li>Otte, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+TDP-43+nucleation+induces+persistent+insoluble+species+and+progressive+motor+dysfunction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Optogenetic TDP-43 nucleation induces persistent insoluble species and progressive motor dysfunction in vivo.</a> Neurobiology of Disease. 146, 105078(2020).</li>
<li>Wendik, B., Maier, E., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mnx+genes+in+endocrine+and+exocrine+pancreas+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mnx genes in endocrine and exocrine pancreas formation.</a> Developmental Biology. 268 (2), 372-383 (2004).</li>
<li>Seredick, S. D., Van Ryswyk, L., Hutchinson, S. A., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Mnx+proteins+specify+one+motoneuron+subtype+and+suppress+acquisition+of+interneuron+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Mnx proteins specify one motoneuron subtype and suppress acquisition of interneuron characteristics.</a> Neural Development. 7, 35(2012).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Research. 33 (4), 36(2005).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nature Protocols. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Asakawa, K., Abe, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dissection+of+the+spinal+cord+motor+column+by+BAC+transgenesis+and+gene+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Cellular dissection of the spinal cord motor column by BAC transgenesis and gene trapping in zebrafish.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 100(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nature Communications. 5, 4925(2014).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-mediated+cell+repulsion+controls+the+central+topography+and+efferent+projections+of+the+abducens+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-mediated cell repulsion controls the central topography and efferent projections of the abducens nucleus.</a> Cell Reports. 24 (6), 1562-1572 (2018).</li>
<li>Redchuk, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+regulation+of+endogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optogenetic regulation of endogenous proteins.</a> Nature Communications. 11 (1), 605(2020).</li>
</ol>

KA ve KK, bu yazıda açıklanan fikri mülkiyetin mucitleridir ve Geçici patentler Ulusal Genetik Enstitüsü tarafından sunulmuştur.

Zebra balıklarında opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z'nin mnr2b-BAC aracılı ifadesi, spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişinin canlı görüntülenmesi için eşsiz bir fırsat sağlar. Zebra balığı larvalarının vücut dokularının optik şeffaflığı, opTDP-43h'nin basit ve noninvaziv optogenetik stimülasyonuna izin verir. Zaman içinde tek spinal motor nöronlar arasındaki karşılaştırmalar, opTDP-43h'nin ışığa bağımlı oligomerizasyonunun ALS patolojisini andıran sitoplazmik kümelenmesine neden olduğunu göstermiştir.
<p class...

Ribonikleoprotein (RNP) granülleri, homojen bir sıvının iki ayrı sıvı fazına dönüştüğü bir fenomen olan sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) yoluyla membransız bölümleri birleştirerek çekirdek ve sitoplazmadaki sayısız hücresel aktiviteyi kontrol eder1,2. Normalde RNP granül bileşenleri olarak işlev görür rna bağlayıcı proteinlerin düzensiz LLPS'si anormal faz geçişini teşvik eder ve protein toplanmasına yol ederim. Bu süreç nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara bulaşmıştır3,4,5. RNA bağlayıcı proteinlerin sapkın LLPS'si ile hastalık patogenezinin nedensel ilişkisinin kesin olarak değerlendirilmesi, LLPS'nin etkili bir terapötik hedef olarak kullanılıp kullanılmayacağını ve nasıl kullanılabileceğini belirlemek için çok önemlidir. RNA bağlayıcı proteinlerin LLPS'lerinin in vitro ve tek hücreli modellerde çalışması nispeten kolaydır, ancak özellikle omurgalılarda çok hücreli organizmalarda zordur. Bu tür LLPS'leri doku ortamındaki bireysel hücrelerde analiz etmek için kritik bir gereklilik, hastalık açısından savunmasız bir hücre türünde LLPS'nin görüntülenmesi ve manipülasyonu için bir probun kesin olarak ifade etmesidir.
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), beyin ve omuriliğin motor nöronlarının dejenerasyon nedeniyle seçici ve aşamalı olarak kaybolduğu sonuçta ölümcül bir nörolojik bozukluktur. Bugüne kadar, 25'ten fazla gendeki mutasyonlar, toplam ALS vakalarının% 5-10'unu oluşturan ALS'nin kalıtsal (veya ailesel) formu ile ilişkilendirilmiştir ve bu ALS nedenli genlerden bazıları hnRNPA1, TDP-43 ve FUS6,7 gibi RNP'lerden oluşan RNA bağlayıcı proteinleri kodlamaktadır. Ayrıca, toplam ALS vakalarının% 90-95'ini oluşturan ALS'nin sporadik formu, dejenere motor nöronlarda biriken TDP-43'ün sitoplazmik toplanması ile karakterizedir. Bu ALS ilişkili RNA bağlayıcı proteinlerin önemli bir özelliği, sıralı üç boyutlu yapılardan yoksun ve LLPS7,8'i yönlendiren birçok farklı proteinle zayıf protein-protein etkileşimlerine aracılık eden özünde düzensiz bölgeleri (IDR'ler) veya düşük karmaşıklık alan adlarıdır. ALS'ye neden olan mutasyonların genellikle IDR'lerde meydana gelmesi, ALS ile ilişkili bu proteinlerin anormal LLPS ve faz geçişinin ALS patogenezinin altında yatan olabileceği fikrine yol açmıştır9,10.
Son zamanlarda, protein-protein etkileşimlerinin ışıkla modülasyonunu sağlayan Cryptochrome 2 tabanlı bir optogenetik teknik olan optoDroplet yöntemi, proteinlerin IDRs11 ile faz geçişini teşvik etmek için geliştirilmiştir. Bu teknik başarıyla TDP-43'e genişletildikçe, TDP-43'ün patolojik faz geçişinin altında kalan mekanizmaları ve buna bağlı sitotoksikliğini ortaya çıkarmaya başlamıştır12,13,14,15. Bu protokolde, ALS'ye karşı savunmasız hücre tiplerine optogenetik bir TDP-43, yani motor nöron spesifikasyonu için bir homeodomain proteinini kodlayan mnr2b/mnx2b gen kodlaması için BAC kullanan zebra balıklarındaki spinal motor nöronları sunmak için genetik bir yöntem özetliyoruz16,17. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, omurilik motoru nöronlarında faz geçişini tetikleyen optogenetik TDP-43'ün basit, noninvaziv ışık stimülasyonuna izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık stimülasyonuna verdiği tepkileri karakterize etmek için serbestçe kullanılabilen Fiji/ImageJ yazılımını kullanarak zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntülenmesi ve görüntü analizi için temel bir iş akışı sunuyoruz. Bu yöntemler, ALS'ye açık hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin araştırılmasına izin verir ve patolojik sonuçlarını hücresel ve davranışsal düzeyde keşfetmeye yardımcı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Epifloresan mikroskobu</td><td>ZEISS</td><td>Axioimager Z1</td><td></td></tr><tr><td>Floresan stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Cam taban kabı</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>MEE</td><td>CN-25C</td><td></td></tr><tr><td>LED panel</td><td>Nanoleaf Limited</td><td>Nanoleaf AURORA akıllı kiti</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus</td><td>TAKARA</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond BAC100</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>LONZA</td><td>50181</td><td></td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFL N 20&times;/1.00</td><td></td></tr><tr><td>Objektif lens</td><td>ZEISS</td><td>Plan-Neofluar 5x/0.15</td><td></td></tr><tr><td>Optik güç ölçer</td><td>HIOKI</td><td>3664</td><td></td></tr><tr><td>Optik sensör</td><td>HIOKI</td><td>9742-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı çözeltisi %0,5</td> <td>Merck</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polimeraz</td><td>TAKARA</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Altı kuyulu çanak</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometre probu MAVİ-Dalga</td><td>StellerNet Inc.</td><td>VIS-50</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi</td><td>TERUMO</td><td>NN-2725R</td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>TAKARA</td><td>RR001A</td><td></td></tr><tr><td>Tricane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Zebra balığı BAC klonu CH211-172N16</td><td>BACPAC Genomik</td><td>CH211-172N16</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı larvalarının spinal motor nöronlarında tdp-43'ün optogenetik faz geçişi

Optogenetic Phase Transition of TDP-43 in Spinal Motor Neurons of Zebrafish Larvae

Anormal protein toplama ve seçici nöronal kırılganlık nörodejeneratif hastalıkların iki önemli özelliğidir. Bu deneysel yaklaşım şimdiye kadar sınırlı olmasına rağmen, bu özellikler arasındaki nedensel ilişkiler, hastalıkla ilişkili bir proteinin savunmasız bir hücre tipinde faz geçişini kontrol ederek sorgulanabilir. Burada, amyotrofik lateral sklerozda (ALS) dejenere motor nöronlarda meydana gelen TDP-43'ün sitoplazmik toplamasının modellenmesi için zebra balığı larvalarının spinal motor nöronlarında RNA/DNA bağlayıcı protein TDP-43'ün faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz. Zebra balıklarının spinal motor nöronlarına seçici olarak optogenetik bir TDP-43 varyantı sunmak için bakteriyel yapay kromozom (BAC) tabanlı bir genetik yöntem tarif ediyoruz. Zebra balığı larvalarının yüksek yarı saydamlığı, spinal motor nöronlarındaki optogenetik TDP-43'ün, sınırsız balıklara karşı ışık yayan bir diyot (LED) kullanarak basit bir dış aydınlatma ile faz geçişine izin verir. Ayrıca, optogenetik TDP-43'ün ışık aydınlatmasına verdiği tepkileri karakterize etmek için zebra balığı spinal motor nöronlarının canlı görüntüleme ve görüntü analizinin temel bir iş akışını serbestçe kullanılabilen Fiji /ImageJ yazılımı ile sunuyoruz. Bu protokol, ALS'ye karşı savunmasız bir hücresel ortamda TDP-43 faz geçişinin ve agrega oluşumunun karakterize edilmesine olanak tanır ve bu da hücresel ve davranışsal sonuçlarının araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.

Zebra balığı larvalarının mnr2b+ spinal motor nöronlarında optogenetik ve optogenetik olmayan TDP-43 proteinlerinin canlı görüntülenmesi Zebra balıklarındaki spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişini teşvik etmek için, sırasıyla N ve C-termini'nde mRFP1 ve CRY2olig22 ile etiketlenmiş bir insan TDP-43h inşa edildi ve opTDP-43h14 olarak belirlendi (Şekil 1A). opTDP-43h gen parças...

TAR DNA bağlayıcı protein 43'ün (TDP-43) zebra balıklarını model olarak kullanarak spinal motor nöronlarda ışıkla faz geçişini teşvik eden bir protokol açıklıyoruz.

Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Abnormal protein aggregation and selective neuronal vulnerability are two major hallmarks of neurodegenerative diseases. Causal relationships between ...

Bu protokol, TDP-43'ün patolojik faz geçişlerini teşvik etmemizi ve motor nöronların ALS'de neden dejenere olduğunu anlamakla ilgili olan spinal motor nöronlarda hücresel sonuçları ele almamızı sağlar. Zebra balığı larvalarının yüksek şeffaflığı nedeniyle, omurilikteki motor nöronlar doğrudan görülebilir. Böylece tek spinal motor nöronlarda faz geçişleri geçiren TDP-43'ün dinamik davranışını görselleştirebilirsiniz.Bu yöntem ALS'nin yeni bir hayvan modelini sunar. Bu ALS modelinde ışık kaynaklı TDP-43 faz geçişini ve toplamayı önleyebilecek herhangi bir yöntemin ALS tedavisi için potansiyel bir aday olabileceğine inanıyoruz. Özünde düzensiz bölgelere sahip diğer ALS ile ilgili proteinler, anormal faz geçişleriyle ilişkili nörotoksiyi araştırmak için ifade edilebilir.Bu yaklaşımda başarının anahtarı, spinal motor nöronlardaki optogenetik TDP-43'ün toksik olmayan düzeyde ifade etmesidir. BAC transgenez zaman alıcı bir adımdır, ancak uygun bir transgenik balık oluşturduğunuzda, aşağıdaki adımlar nispeten daha kolay ve basittir. Başlamak için, bir tablette veya telefonda yüklü olan ilişkili uygulamayı kullanarak ışık yayan diyot veya LED panelini açın.Ardından, spektrometre probunu 6 kuyulu bir kabın boş bir kuyusuna yerleştirin. Ardından uygulamayı kullanarak LED ışığını 456 nm'de zirve yaparak dalga boylarına ayarlayın. Optik güç ölçerin optik sensörlerini boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın.Daha sonra LED panel ayarına sahip yemeği 28 C'de bir inkübatöre yerleştirin.Optogenetik TDP-43'ü ifade eden zebra balık larvalarının görüntülenmesi için, çift transgenik balığı kaynatın ve 250 g/mL Tricane içeren E3 tamponunda uyuşturun. Daha sonra, 42 C'de 250 g/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat içeren% 1 düşük erime sıcaklığı agarose önceden ısıtın.Daha sonra cam taban kabına bir damla agarose koyun. Cam tabaktaki kubbe şeklindeki agarose damlasının çapı 8 ila 10 mm olmalıdır.Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak, uyuşturuldu balığı cam bazlı tabakta agarose ekleyin. Balıkla birlikte agarose'a eklenen E3 tampon miktarını en aza indirin. Ardından, birkaç kez pipetleme ile karıştırın.Agarose katılaşması sırasında, omuriliğin uygun bir yatay konumda olması için bir şırınga iğnesi kullanarak balığı yan tarafında tut. Agarose katılaştıktan sonra, kubbe şeklindeki agarose monteli balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu ekleyin. 20 kat suya daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak, omuriliğin seri konfokal z bölümlerini elde edin.Zaman noktalarındaki omurga segmentlerini tanımlamak ve karşılaştırmak için bir referans olarak, balıkların ventral tarafındaki kloakayı ilgi çekici bölgelere ekleyin. Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz, agarose'u dikkatlice kırmak ve balıkları agarose'dan çıkarmak için bir şırınga iğnesi kullanın. Balığın agarose'a gömdülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarose 30 dakikadan daha az bir süre boyunca gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.6 kuyulu bir yemeğin bir kuyusuna 7,5 mL E3 tampon ekleyin ve görüntülenmiş çift transgenik balığı bu kuyuya yerleştirin. Ardından, çanağı LED panele yerleştirin, çanağı ve LED panelini bir ara parça ile 5 mm ayrı tutun ve mavi LED ışığını açın. Bazı çift transgenik balıkları, unilluminated kontrol balıkları için alüminyum folyo ile kaplı ayrı bir 6 kuyulu tabakta saklayın.İstenilen aydınlatma süresinden sonra, daha önce gösterildiği gibi aydınlatılmış balığın omuriliğini görüntüledi. OpTDP-43h'nin tek spinal motor nöronlarda sitoplazmik yer değiştirmesi, 48 yaşında elde edilen z serisi görüntüler ayrılarak görselleştirildi. ve her EGFP-TDP-43z ve opTDP-43h kanalına döllenmeden 72 saat sonra.EGFP-TDP-43z'nin maksimum yoğunluk projeksiyon görüntülerinden, her ikisinde de tanımlanabilen tek bir izole spinal nöron. ve döllenme sonrası 72 saat seçildi. Motor nöronların somalarını kapsayan ilgi alanları, EGFP sinyalinin kenarı 48'de izlenerek belirlendi.ve döllenmeden 72 saat sonra. Somanın ana ekseni boyunca normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizildi. Döllenmeden 48 saat sonra, her iki sinyalin de desenleri büyük ölçüde birbiriyle örtüştü.Buna karşılık, 72 saatte, EGFP-TDP-43z sinyalinin düşük olduğu bölgede opTDP-43h sinyalinin zirvesi bulundu ve bu da opTDP-43h'nin sitoplazmik yer değiştirmesini gösterdi. Mavi ışık stimülasyonundan önce ve sonra opTDP-43h ve EGFP-TDP-43z sinyallerini ölçmek için, aynı z serisi görüntülerin her kanalı için bazı dilim projeksiyon görüntüleri 48'de üretildi. ve döllenmeden 72 saat sonra.Araştırılan dört mnr2b+hücreden 1 hücresi, özellikle doymuş bir EGFP-TDP-43z sinyali gösterdi. OPTDP-43h ile EGFP-TDP-43z arasındaki göreli miktarlar, RFP değerinin GFP değerine bölünmesiyle hesaplanmıştır. 2 ila 4 arası hücreler, mavi ışık aydınlatmadan sonra azalan opTDP-43h seviyelerini görüntüledi.Balıkların sağlıklı kalmalarını sağlamak için agarose'a gömülme süresini en aza indirmek önemlidir. LED aydınlatmanın yoğunluğunu ve süresini ayarlayarak, TDP-43 faz geçişini geçici olarak düzenlenmiş bir şekilde kontrol ediyoruz, bu da motor nörondaki patolojik TDP-43 faz geçişinin ilerlemesinin parçalanmasına yardımcı olabilir.

optogenetic-phase-transition-tdp-43-spinal-motor-neurons-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, genetik olarak modifiye edilmiş somatosensoriyel nöronları aktive ederek ve ortaya çıkan davranışsal yanıtı yüksek hızlı bir video kamera ile kaydederek optogenetik teknikler açıklanmaktadır.

Zebra Balığı Optogenetiği: Larva Davranışsal Tepkilerini İncelemek için Genetik Olarak Değiştirilmiş Somatosensoriyel Nöronun Aktive Edilmesi

Bu videoda, ışığa duyarlı bir oligomerizasyon alanına kaynaşmış içsel olarak düzensiz bölgeleri içeren hücre içi proteinlerin, zarsız sıvı benzeri kondensatlara kendi kendine birleşmek için mavi ışığa maruz kalma yoluyla indüklendiği bir faz ayırma testini açıklıyoruz.

Protein Faz Ayırma Deneyi: Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında Mutant RNA Bağlayıcı Protein Faz Ayrımı İçin Optogenetik Bir Yöntem

Bu video, zebra balığı embriyolarında motor nöronların elektrofizyolojisini incelemek için invaziv olmayan bir testi göstermektedir. Omurilik motor nöronlarının spontan depolarizasyonu sonucu embriyolarda kuyruk koilinin ölçümü yapıldıktan sonra, koilleme frekansını azaltmak için bir sodyum kanal blokeri uygulanır. Daha sonra, embriyolar agaroz içinde hareketsiz hale getirilir ve bir floresan mikroskobu altına yerleştirilir. Genetik olarak tasarlanmış motor nöronlar, bir donör ve bir alıcı...

Zebra Balığı Embriyolarında Motor Nöronların Elektrofizyolojisini İncelemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yaklaşım

Optogenetic teknikleri mümkün davranışına özgü nöronların katkısı çalışma yaptık. Biz bir diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer ile channelrhodopsin varyant (şef) ifade ve yüksek hızlı video kamera ile ortaya çıkardı davranışların kaydedilmesi tek somatosensoriyel nöronlar aktive larva zebrafish bir yöntem açıklanmaktadır.

Chef-tdTomato kullanarak Zebrafish Somatosensoriyel Nöron Optogenetic Etkinleştirme

Burada açıklanan protokoller, zebra balığı embriyolarını in vivo bir sistemde kullanarak, ilgilenilen hücre tipinde seçici olarak ifade edilen bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesi (GEVI) ile birlikte uyarılabilir hücrelerin elektriksel özelliklerinin incelenmesine izin verir.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.

Optogenetik TAEL/C120 Sistemini Kullanan Zebra Balığı Embriyolarında Işık Kaynaklı GFP İfadesi

Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Bu protokol, MPTP ile tedavi edilen zebrafish larvalarında Parkinson hastalığına benzeyen motor ve motor dışı eksiklikleri değerlendirmek için davranışsal fenotipleme paradigması oluşturur.

Davranışsal Deneye Dayalı Zebrafish Larvalarında MPTP Kaynaklı Parkinson Benzeri Davranışsal Fenotiplerin Fenotipik Profillenmesi

Keşfedin, optogenetik yöntemle zebra balığı spinal motor nöronlarında TDP-43 faz geçişini inceleyerek ALS hastalığının hücresel mekanizmalarını canlı modelde görselleştirme tekniğini.

Zebra Balığı Larvalarının Spinal Motor Nöronlarında TDP-43'ün Optogenetik Faz Geçişi

Daha fazla video keşfet