Name: Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Keşfedin fare vagal afferent nöronlarında G protein bağlantılı reseptör ekspresyonunu çoklu in situ hibridizasyon ile. Bu hassas yöntem transkripsiyonel profilleri haritalandırarak nörobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH grant #5P01DK119130-02 tarafından finanse edilen Nöroanatomi/Histoloji/Beyin Enjeksiyon Çekirdeği tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, kısmen NCI Kanser Merkezi Destek Hibesi tarafından desteklenen Harold C. Simmons Kanser Merkezi'nin Ortak Kaynağı olan NIH Grant #1S10OD021684-01 tarafından desteklenen UT Southwestern Canlı Hücre Görüntüleme Tesisi (Dr. Phelps başkanlığındaki) ve personelinin (Abhijit Bugde ve Marcel Mettlen) yardımını kabul etmek istiyor. P30 CA142543.

NOT: Bu çalışmada kullanılan fareler saf C57BL/6J arka plan üzerinde vahşi tip erkeklerdi. Multipleks ISH için toplam 4 fare kullanıldı. Tüm fareler kurban sırasında yaklaşık 8 haftalıktı. Yaşlanma ile ilişkili endojen floresan göstermek için bir erkek fare (yaklaşık bir yaşında) da kullanılmıştır. Hayvanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan bir bariyer tesisi içinde havalandırmalı kafeslerde barındırıldı. UT Southwestern Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi aşağıda açıklanan prosedürleri gözden geçirdi ve onayladı. Reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosu 'ndabulunabilir.
1. Örnek toplama
<ol><li>Kurban gününde, farelere aşırı dozda kloral hidrat (500 mg / kg, yani) sürün. Derin uyuşturulmuş fareleri, 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından oda sıcaklığında% 10 formalin 50 mL ile peristaltik bir pompa kullanarak transkardiyöz olarak perfüzyona maruz kalın. NOT: Bu, formalinin solunmasını önlemek için duman kaputunda yapılır.</li>
	<li>Nodose, petrosal ve juguler gangliyonlar farede tek bir gangliyonik kütle oluşturmak için kaynaştıkça15, tüm vagal gangliyonik kütleyi bir diseksiyon kapsamı ve ince yay makası ve forseps yardımıyla her iki taraftan (sol ve sağ) dikkatlice toplayın (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Farenin kafasını bir çift büyük makasla kıtırken (Malzeme Tablosunabakın), beyin sapının ezilmemesi gerekir.</li>
	<li>Sıçanda daha önce açıklanan bir diseksiyon yaklaşımını takiben40, oksipital kemiği ortaya çıkarmak için sternohyoid ve omohyoid kasları küçük önpslerle(Malzeme Masası)nefes borusuna yanal olarak çıkarın. Şahdamar, vagus siniri, hipoglossal sinir ve foramen magnum görünene kadar tüm bölgeyi kas, yağ dokusu ve konjonktif dokudan temizleyin. Tüm hipoglossal siniri küçük yay makası(Malzeme Masası)ile kesin.</li>
	<li>Nodose ganglion'un foramen magnum15'eyakın yarı saydam bir kütle olarak arayın. Küçük makas kullanarak (Malzeme Masası), juguler ganglionu daha fazla ortaya çıkarmak için oksipital kemiği dikkatlice kırın. Görsel bir dönüm noktası olarak şahdamarının yüzeyinde siyah melanositler arayın.</li>
	<li>Vagal gangliyonik kütle arasındaki sinir bağlantılarını kesin ve küçük yay makası(Malzeme Masası)ile beyin sapına doğru şahdamarını keserken vagus sinirinin periferik ucunun üzerine hafifçe çekerek tüm gangliyonik kütleyi çıkarın.</li>
	<li>Vagus sinirine ve gangliyonik kütleye yapışan konjonktürel dokuyu ve yağı mümkün olduğunca çıkarın.</li>
	<li>Bir tüpten diğerine transfer sırasında bir ganglionu kaybetmek kolay olduğundan, numunelerin işlenmesini ve lokalizasyonunu kolaylaştırmak için vagus sinirinin ~ 0,5 cm'ini saklayın.</li>
	<li>Gangliyonları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ince forseps yardımıyla yerleştirin ve formalin içinde 4 °C'de 24 saat ve 24 saat boyunca% 30 sakkarozla kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Gangliyumu bir parça alüminyum folyo üzerine optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamının küçük bir damlasının (~4 mm Ø) içine yerleştirin. Ardından, numuneyi kuru buz yatağında dondurun.</li>
	<li>Örnekleri -20 °C'de kriyostatla 14 μm kalınlığında bölümlere kesin ve cam mikroskop slaytlarında 3 seri 42 μm aralıklarla toplayın. NOT: Bölümleri slaydın kenarlarına yakın yerleştirmekten kaçının. Reaktifleri kaydetmek için, doku bölümlerini mümkün olduğunca sıkı bir şekilde paketlenin, ancak üst üste binmeden tutun.</li>
	<li>Numuneleri -80 °C dondurucuda en az 6 ay boyunca ISH için gerekli olana kadar saklayın. NOT: Endojen floresan sorunlarını gidermek için Şekil 1'e bakın.</li>
</ol>2. Ön işlem ve ISH
<ol><li>Deneyler gününden önce, bulaşıkları boyamak ve tampon kavanozları yıkamak da dahil olmak üzere ISH için kullanılacak laboratuvar camlarını otoklavlayın. NOT: RNase içermeyen koşullar altında çalışmak kritik olmasa da, her zaman eldiven giyin. Kontaminasyondan şüphelenilme durumunda RNase dekontaminasyon çözelti şişelerini(Malzeme Masası)ulaşılabilecek bir yerde tutun.</li>
	<li>İlk gün, slaytları özellikle ISH'ye adanmış bir bankta oda sıcaklığına getirin. Slaytları 1x PBS'de durulayın ve bir fırın fırınında(Malzeme Masası)60 °C'de 30 dakika pişirin.</li>
	<li>Slaytları 4 °C'de 15 dakika boyunca % 4 formalin olarak sabitleyin.</li>
	<li>Multipleks kitteki reaktifleri(Malzeme Masası)oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>Slaytları her biri 5 dakika boyunca% 50, % 70 ve% 100 etanolde susuz bırakır. Numunelere10dakika boyunca H 2 O2 çözeltisi uygulayın ve ardından çift damıtılmış suda durulayın (ddH2O).</li>
	<li>Numuneleri hedef alma reaktifi ile 5 dakika boyunca tedavi edin, ddH2O'da durulayın ve ardından% 100 etanol ve hava kuru. Hidrofobik bir kalem kullanarak, numunelerin etrafında bir bariyer oluşturun. NOT: Hidrofobik bariyeri doku bölümlerine çok yakın uygulamayın.</li>
	<li>Bir hibridizasyon fırınına(Malzeme Masası)40 °C'de 30 dakika proteaz uygulayın.</li>
	<li>Bu arada, probları 40 °C'de önceden ısıtın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Bir hibridizasyon fırınında 40 °C'de 2 saat boyunca hedef probların (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; veya Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) istenen kombinasyonuyla slaytları kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hibridizasyon fırınında 40 °C'de 2 saat boyunca dihidrodipikolinat redüktaz (DapB) hedef C1 probu ile negatif kontrol dokusunu kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Slaytları yıkama tamponunda durulayın ve oda sıcaklığında 5x salin sodyum sitrat (SSC) içinde gece boyunca saklayın. Kolaylık sağlamak için deneyi iki güne bölün. Ertesi gün, slaytları yıkama tamponu ile durulayın ve aşağıda listelenen amplifikasyon reaktifleriyle kuluçkaya yatırın (Malzeme Tablosu'ndakikullanım kılavuzuna bakın).</li>
	<li>AMP1 (40 °C'de 30 dk), AMP2 (40 °C'de 30 dk) ve AMP 3 (40 °C'de 15 dk) uygulayın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.</li>
	<li>Her Opalboyasını( Malzeme Masası ) dimetil süloksit içinde çözün ve çözeltileri ihtiyaç duyulana kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Kanal 1 için, slaytları HRP-C1 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 520 (yeşil renk; seyreltme 1/1.500; 40°C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.</li>
	<li>Kanal 2 için, slaytları HRP-C2 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 570 (sarı renk; seyreltme 1/1.500; 40 °C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.</li>
	<li>Kanal 3 için, slaytları HRP-C3 (40 °C'de 15 dk) ve Opal 690 (uzak kırmızı renk; seyreltme 1/1.500; 40 °C'de 30 dakika) ile kuluçkaya yatırın. Her adım arasında yıkama tamponunda durulayın.</li>
	<li>Slaytları yıkayın ve 30 s için 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) maruz.</li>
	<li>Her kaydırağa hemen montaj ortamı uygulayın ve doku bölümünün üzerine bir kapak kılıfı yerleştirin.</li>
	<li>Görüntülemeye kadar dokuları 4 °C'de bir slayt tutucuda yatay tutun.</li>
</ol>3. Mikroskopi ve veri analizi
NOT: Multipleks ISH verileri, uygun filtrelere sahip çok çeşitli araçlarla görüntülenebilir. Bununla birlikte, tercih edilen bir görüntüleme yöntemi 20x ve 63x (yağ) hedeflerine sahip konfokal mikroskopidir; nedenlerle tartışmaya bakın. En uygun sinyal-gürültü oranının belirlenmesi için Şekil 2'ye bakın.
<ol><li>488, 561 ve 633 nm lazer hatları ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın. Aşağıdaki alma parametrelerini kullanın (bkz: Tablo 1):Opal 690 (HeNe 633 nm, algılama aralığı 668-696 nm, güç 2.0, kazanç 724); Opal 570 (DPSS lazer 561 nm, algılama aralığı 579-627 nm, < güç 15.0, <gain 450); Opal 520 (argon lazer 488 nm, algılama aralığı 499-535 nm , < güç 6.0, <gain 830); DAPI (diyot lazer 405, algılama aralığı 415-502 nm, < güç 12.0, <gain 532).</li>
	<li>Görüntülerin kalitesini artırmak için, ortalama 4 çizgi ve en az 1024 x 1024 piksel boyutu elde edin. NOT: Yukarıdaki parametreler sadece örnek olarak sağlanmıştır ve değişiklikler bir alete, büyütmeye (20x veya 63x), ifade seviyelerine ve herhangi bir doku için endojen floresan seviyelerine bağlı olarak önerilir.</li>
	<li>Edinme parametrelerinden memnun olduktan sonra, aynı ayarları kullanarak görüntüleri toplayın. Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için her kanala yanlış renkler atfin. NOT: Örneğin, kırmızı (Phox2b veya Prdm12), siyan (Cck1r), sarı (Ghsr) ve gri (DAPI).</li>
	<li>Dapi ile hafifçe boyanmış bir çekirdekle RNAscope pozitif profillerin ana hatlarını tanımlayarak dijital görüntüleri kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. Her transkripti ifade eden RNAscope pozitif profillerin yüzdesini hesaplayın [Şekil 3A-C].</li>
	<li>Tahminlerin titizliğini ve doğruluğunu artırmak için, en az 4 farklı hayvandan en az 2.000 nöronal profil sayın. Sayım işlemi soldan ve sağdan gangliyonlardan ayrı ayrı gerçekleştirin.</li>
	<li>Verileri, toplam sayılan profil sayısıyla bir pasta grafiğe girin.</li>
	<li>Görüntüleri elde etmek ve 20x görüntüleri bir araya getirmek için görüntüleme yazılımını kullanın. Son plakaları oluşturmak için ImageJ-Fiji ve başka bir fotoğraf ve tasarım yazılımı kullanın. Kontrast ve hafiflik ayarlamalarını tüm görüntülere eşit şekilde uygulayın.</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar beyan etmemektedir.

ISH tekniği 1960'ların sonunda icat edildi42. Ancak, 1980'lerin ortalarına kadar merkezi ve periferik sinir sistemlerinde mRNA'ların tespiti için uygulanmadı43,44. Sinir sisteminin heterojenliği ve antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında, belirli bir transkriptin hücresel düzeyde lokalize edilmesi paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, geleneksel ISH yöntemleri zahmetli ve değişken derecede...

Vagal afferentlerin hücre gövdeleri juguler, petrosal ve nodose gangliyon1,2,3'te bulunur. Aksonları vagus sinirinin birkaç dalı aracılığıyla kraniyoserikal, torasik ve abdominal bölgelere birlikte seyahat eder4,5,6,7. İçsel uçlarından, vagal afferentler çok çeşitli fizyolojik ve zararlı uyaranlara yanıt verebilir8,9,10. Bununla birlikte, vagal algılamada yer alan sinyal moleküllerinin ve reseptörlerin dağılımı kötü karakterize olmaya devam etmektedir. Bunun nedeni kısmen vagal gangliyonların, küçük boyutlarına rağmen, çok sayıda GPCR 8 , 11 , 12,13dahil olmak üzere geniş bir reseptör spektrumunu ifade etmeleridir. Ayrıca, vagal afferent nöronlar doğası gereği heterojendir ve farklı moleküler profiller görüntüler14. Konuyu karmaşıklaştırmak için, juguler, petrosal ve nodose gangliyonları fareye bağlanır ve böylece tek bir gangliyonik kütle oluşturur. Son olarak, hayvanların bir alt kümesinde, nodose ganglionu sempatik üstün servikal ganglion15'e bağlanır.
Geçmişte, araştırmacılar vagal afferent nöronların nörokimyasal makyajını incelemek için immünhistokimyaya başvurdular16,17,18. Doğrulanmış antikorların kullanılması immünostokimya yararlı olmakla birlikte, immünohistokimyasal çalışmaların sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Örneğin, GPCR'lere karşı spesifik antikorları tanımlamaya yönelik çok sayıda çaba başarısız oldu19,20,21 , 22,23,24,25, araştırmacıların GPCR'lere karşı antikorların çoğunluğunun güvenilmez olduğu sonucuna varmasına yol açtı. Bu sorunları atlatmak için, kemirgen vagal gangliyonik kütle26 , 27 , 28,29gen ekspresyonini değerlendirmek için nicel PCR (qPCR) yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, qPCR kullanılarak gen ekspresyonunun incelenmesi, mekansal bilgi kaybı pahasına gerçekleşir. Özellikle, kaç hücrenin veya hangi hücre tiplerinin belirli bir ilgi genini (örneğin, nodose ve juguler hücreler) ifade ettiği tahmin edilemez. Tekrarlayan sorunlar ayrıca bitişik dokularla kontaminasyon ve diseksiyon sırasında vagus sinirinin değişken uzunluklarının, üstün servikal ve juguler gangliyonların dahil edilmesini içerir15. Yukarıdaki zorlukların bir sonucu olarak, tartışmalar vagal afferent nöronlarda birkaç GPCR'nin ekspresyon ve dağılımını çevreler. Özellikle şaşırtıcı bir örnek ghrelin reseptörü (Ghsr) ile ilgilidir. Bazı çalışmalar vagal afferent nöronlarda bu reseptörün yaygın ekspresyonunun30,31,32, diğerleri Ghsr mRNA'nın nodose ganglion 11,14'teneredeyse tespit edilemediğini bulmuşlardır. Bu nedenle vagal gangliyonik kütlede Ghsr mRNA'nın ayrıntılı haritalandırılması garanti edilir.
In situ hibridizasyon (ISH) vagal gangliyonik kütle7, 11 ,12,33,34,35gen ekspresyon kalıplarını değerlendirmek için de kullanılmıştır. RNA tabanlı teknikler çoğu durumda antikor bazlı tekniklerden daha güvenilir ve spesifik kaldığından36,37, ISH çalışmaları vagal afferent nöronların nörokimyasal kodlamasının daha iyi anlaşılması için değerli olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, geleneksel ISH tekniklerinin kendileri uyarı olmadan değildir. Radyoaktif ISH hassastır, ancak arka plan oluşturur ve hantalkalır 38. Radyoaktif olmayan ISH daha az karmaşık ama aynı zamanda daha az hassas38. Buna karşılık, son zamanlarda geliştirilen RNAscope ISH yöntemi son derece hassastır ve en az arka planoluşturur 39. Mevcut çalışma, farenin vagal afferent nöronlarında GPCR'lerin tespitine multipleks floresan RNAscope uyguladı. Ghsr'nin dağılımını haritalamaya odaklandık ve dağıtımını nodose ganglion34'teifade edildiği bilinen başka bir GPCR olan kolesistokinin reseptörü (Cck1r) ile karşılaştırdık. Son olarak, eşleştirilmiş homeobox 2b (Phox2b) ve PR etki alanı çinko parmak proteini 12 (Prdm12) olmak üzere iki transkripsiyon faktörü, nodose ve juguler afferent nöronlar için seçici belirteçler olarak kullanılmıştır, sırasıyla14. Phox2b veya Prdm12'yi görselleştirmeden, jugular vs. nodose afferentlerini kesin olarak tanımlamak zor olacaktır. Makale boyunca potansiyel teknik tuzaklar da tartışılmaktadır.

<table><tbody><tr><td>10x</td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C dondurucu</td><td>PHCBI</td><td>MDF-DU901VHA-PA</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td></td><td>fotoğraf ve tasarım yazılımı</td></tr><tr><td>Pişirme fırını</td><td>Termo Bilimsel</td><td>Model:658</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM880 Airyscan</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>Beyin Araştırma Laboratuvarları</td><td>2460-1.5D</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Ecomount</td><td>Biocare Medical</td><td>EM 897L</td><td>montaj ortamı</td></tr><tr><td>HybEZ fırın</td><td></td><td></td><td>hibridizasyon fırını</td></tr><tr><td>Hidrofobik kalem</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ-Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Büyük makas</td><td>Henry Schein</td><td>100-7561</td><td></td></tr><tr><td>Mikro santrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>Minipump değişken akışlı</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td></td></tr><tr><td>Opal 520</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1487001KT</td><td>Floresan biyobelirteç</td></tr><tr><td>Opal 570</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1488001KT</td><td>Floresan biyobelirteç</td></tr><tr><td>Opal 690</td><td>Akoya biosciences</td><td>FP1 1497001KT</td><td>Floresan biyobelirteç</td></tr><tr><td>ProLong Gold </td><td>Floresan etiketli hücreler için</td>Antifade Mountant <td></td><td></td> montaj ortamı</tr><tr><td>RNAscope Multipleks Floresan Reaktif Kiti v2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>323100</td><td>multipleks kiti</td></tr><tr><td>RNAscope probu Fare Cck1r-C3</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>313751-C3</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope probu Fare DapB</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>310043</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope probu Fare Ghsr</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td></td><td></td>426141</tr><tr><td>RNAscope probu Fare Phox2b-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>407861-C2</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope probu Fare Prdm12-C2</td><td>ACD /Bio-Techne</td><td>524371-C2</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Rnase dekontamine edici solüsyon</td></tr><tr><td>Küçük diseksiyon makası</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z265977</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slaytları</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td></td></tr><tr><td>Doku Tek OCT orta</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kullanım kılavuzu</td><td>ACD</td><td>323100 USM</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Yaylı Makas</td><td>Roboz</td><td>RS 5620</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Görüntüleme Yazılımı</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multipleks in situ hibridizasyonu kullanan fare vagal afferent nöronlarında g protein bağlantılı reseptör ekspresyonunun tespiti

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Bu çalışmada, fare juguler-nodose gangliyonunun multipleks in situ hibridizasyonu (ISH) için bir protokol açıklanmaktadır ve özellikle G protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) ekspresyonunu tespit etmeye vurgulanmaktadır. Formalin-sabit juguler-nodose gangliyonları, iki temsili GPCR'nin (kolesistokin ve ghrelin reseptörleri) ifadesini nodose (eşleştirilmiş homeobox 2b, Phox2b) veya juguler afferent nöronların (PR etki alanı çinko parmak proteini 12, Prdm12) bir işaret geni ile birlikte aynı anda tespit etmek için RNAscope teknolojisi ile işlendi. Etiketli gangliyonlar, yukarıda belirtilen transkriptlerin dağılım ve ifade kalıplarını belirlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Kısaca, Phox2b afferent nöronların kolesistokinin reseptörü (Cck1r) bolca ifade edildiği, ancak ghrelin reseptörü (Ghsr) ifade etmediği bulunmuştur. Prdm12 afferent nöronlarının küçük bir alt kümesinin de Ghsr ve/veya Cck1r'i ifade ettiği bulunmuştur. Bu makalede açıklanan yaklaşım, bilim adamlarının vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmalarına yardımcı olabilir.

RNAScope herhangi bir yaştan, cinsiyette veya genetik kökenden hayvanlara uygulanabilirken, genç yetişkinlerle (&lt;3 aylık) çalışmanız önerilir. Bunun nedeni, floresan eserlerin (örneğin lipofuscin) yaşlı hayvanların nöronlarında yaygın bulgular olmasıdır41. Yaşlı farelerden formalin-sabit gangliyon genellikle kolayca gerçek boyama ile karıştırılabilecek şaşırtıcı derecede yoğun endojen floresan içerir (Şekil 1A,B). Her durumda, işlemden önce dokudak...

Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

Bu prosedür son derece hassastır ve minimum arka plana sahip birkaç transkriptin görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntem, yüksek heterojen hücre tiplerinin transkripsiyon profilinin doğru haritalarını oluşturabilir. Prosedürü ben ve laboratuvarda araştırma teknisyeni olan Johnson Bob-manuel gösterecek.Diseksiyon kapsamı ve cerrahi aletler yardımıyla, her iki taraftan sekiz haftalık fareden tüm vagal gangliyonik kütleyi toplayarak başlayın. Farenin kafasını kestikten sonra, oksipital kemiği ortaya çıkarmak için sternohyoid ve omohyoid kaslarını nefes borusuna yanal çıkarmak için küçük önkseçimler kullanın. Şahdamarı, vagus ve hipoglossal sinir ve foramen magnum görünene kadar tüm bölgeyi kas ve dokulardan temizleyin.Sonra tüm hipoglossal siniri küçük yay makası ile kesin. Nodose ganglionu için foramen magnum'a yakın yarı saydam bir kütle olarak bulun. Küçük makas kullanarak oksipital kemiği dikkatlice kırın.Şahdamar ganglionunun daha fazla açığa çıkması için, şahdamarının yüzeyindeki siyah melanositleri görsel bir dönüm noktası olarak bulun. Gangliyonlar bulunduğunda, vagal gangliyonik kütle arasındaki sinir bağlantılarını kesin ve tüm gangliyonik kütlenin çıkarılması için küçük yay makası ile beyin sapına doğru şahdamarını keserken vagus sinirinin periferik ucunun hafifçe çekilmesini sağlar. Vagus sinirine yapışan konjonktürel dokuyu, gangliyonik kütleyi ve yağı çıkarın.Numunelerin işlenmesini ve lokalizasyonunu kolaylaştırmak için vagus sinirinin yaklaşık yarım santimetresini tutmak. 1,5 milimetre mikro santrifüj tüplerinde ince tokmaklar yardımıyla çıkarın gangliyona yerleştirin. Formalin'de 24 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatır.Ve sonra 24 saat boyunca %30 sakkarozla. Kuluçkadan sonra, gangliyonu bir alüminyum folyo parçası üzerinde dört milimetre çapında optimum kesme sıcaklığı ortamının içine yerleştirin. Ve örneği kuru buz yatağında ifade edin.Kriyostatlı dondurulmuş numuneleri eksi 20 santigrat derecede 14 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın ve cam mikroskop slaytlarındaki kesim bölümlerini üç seri 42 mikrometre olarak toplayın. Slaytları PBS'de doku bölümleriyle durulayın. Ve bir fırın fırınında 60 santigrat derecede 30 dakika pişirin.Ardından, slaytları dört santigrat derecede 15 dakika boyunca %4 formalin olarak postalayın. Slaytları her biri beş dakika boyunca %50%70 ve %100 etanol olarak seri olarak susuz bırakın. Ve çift damıtılmış suda durulamadan önce numunelere 10 dakika hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın.In situ hibridizasyon veya ISH için, örnekleri hedef alma reaktifi ile beş dakika boyunca tedavi edin. Daha sonra numuneleri çift damıtılmış suda ve% 100 etanolde ve ardından hava kurutmada sırayla durulayın. Hidrofobik bir kalem kullanarak, numunelerin etrafında bir bariyer oluşturun.Numuneler 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca proteaz ve hibridizasyon fırını ile tedavi edilirken, probları 40 santigrat derecede önceden ısıtın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Fırından hareket ettikten sonra, bir hibridizasyon fırınında 40 santigrat derecede iki saat boyunca hedef probların istenen kombinasyonu ile slaytları kuluçkaya yatırın. Dihidrodipikolinat redüktaz veya DapB ile negatif kontrol dokusunu kuluçkaya yatırın, hedef C1 probu 40 santigrat derecede iki saat boyunca.Slaytları yıkama tamponunda durulayın ve bir gecede oda sıcaklığında beş kez tuzlu sodyum sitratında saklayın. Ertesi gün, kireçlenme reaktifleri ile inkübasyondan önce slaytları yıkama tamponu ile durulayın. Ve yazıda açıklandığı gibi kanala özgü reaktiflerle tedavi edin.Slaytları yıkayın ve ardından DapB ile 30 saniye boyunca tedavi edin. Ardından montaj ortamını hemen her kaydıraktan uygulayın ve doku bölümünün üzerine bir kapak kayması yerleştirin. Görüntülemeye kadar dokuları bir slayt tutucusunda dört santigrat derecede yatay tutun.Gerekli parametreleri ayarlayarak görüntüleme için bir konfokal mikroskop hazırlayın. Görüntülerin kalitesini artırmak için 1024'e kadar dört satır ortalaması ve en az 1024 piksel boyutuna sahip görüntüleri elde edin. Edinme parametrelerinden memnun olduktan sonra, aynı ayarları kullanarak görüntüleri almaya başlayın.Görselleştirmeyi kolaylaştırmak için her kanala yanlış renkler atfin. Dijital görüntüleri kullanarak, DapB ile hafifçe boyanmış bir çekirdekle RNA kapsamı pozitif profillerinin ana hatlarını tanımlayarak hücre sayımı gerçekleştirin. Her dökümü ifade eden RNA kapsamı pozitif profillerinin yüzdesini hesaplayın.Negatif kontrol dokusunda elde edilen spesifik olmayan floresan baz alınarak her lazer için en uygun alma parametreleri seçildi. Genç bir yetişkin farenin nodose ganglionunda endojen floresan minimaldir. Ve bir DapB probu ile inkübasyon, sinyallerle sonuçlanmamıştır.488 nanometre lazer ile artan güç lazer ve kazançta, istenmeyen arka plan ve rastgele floresan noktalar ortaya çıkar. Vagal gangliyonik kütlenin doku bölümlerindeki üç geni tespit etmek için RNA dürbün tekniği uygulandı. Doku profili GHSR ve CCK1R için pozitifti.Profil, nodose ganglionunun rostral kısmında hem Phox2b hem de CCK1R transkriptlerini içeriyordu. Nodose afferent nöronlarda multipleks ISH'nin bir sonucu olarak, Phox2b sinyalleri özellikle nodose ganglionunda bulunan afferent nöronlarda birikir. CCK1R sinyalleri nodose ganglionunda birçok nöronun yoğun olarak etiketlendiğini işaret eder.Düşük büyütmede, düşük CCK1R veya GSHR sinyallerini ifade eden hücreler kolayca gözlemlenemedi. DapB, dokuyu görselleştirmeye ve büyük ve hafif lekeli bir çekirdeğe sahip vagal afferent nöronları tanımlamaya yardımcı oldu. Yüksek büyütmede, Phox2b pozitif profilleri belirgindir.profiller iki ve üç, yüksek ve orta derecede CCK1R sinyallerine sahip Phox2b hücreleridir. Profil 4 hem GHSR hem de CCK1R'yi ifade etti. Juguler afferent nöronların multipleks ISH'si sonucunda, PRDM12 transkript özellikle juguler ganglion içinde bulunan afferent nöronlarda birikmiş olarak görülebilir.Yüksek büyütmede, bir ve ikinci profillerde CCK1R için orta derecede sinyaller tespit edildi. Profil üç, CCK1R veya GHSR için negatif prdm12 hücrelerinin bir temsilcisidir. Diseksiyonun tutarlılığı önemli bir faktördür.Görüntüleme alma parametrelerinin istenmeyen arka plan sinyalleri oluşturmadığını doğrulamak da aynı derecede önemlidir. Multipleks In situ hibridizasyon, özellikle nöroanatomi alanında moleküler olarak kurulan altın standart haline gelmiştir. Bu yöntem immünostokimya ile kolayca birleştirilebilir.

detection-g-protein-coupled-receptor-expression-mouse-vagal-afferent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Vomeronazal organ (VNO), sosyal ve üreme bilgilerini ileten tür içi kimyasal sinyalleri tespit eder. VNO dokusunda G-CaMP2 eksprese eden transgenik fareler kullanarak Ca2+ görüntüleme deneyleri gerçekleştirdik. Bu yaklaşım, vomeronazal nöronların çok sayıda feromon uyarısına verdiği karmaşık yanıt modellerini analiz etmemize olanak tanır.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

Kaynak: Baleriola, J., et. al., Yüksek Çözünürlüklü In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Beyin Bölümlerinde Aksonal Lokalize mRNA'ların Tespiti.  J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, floresan in situ hibridizasyon ve antikor boyama kullanılarak sabit fare hipokampal dilimlerinde kolinerjik aksonlar içinde mRNA'nın tespitini göstermektedir. Floresan mikroskobu, kolinerjik nöronlarda prob etiketli mRNA'ların ve kolin asetiltransferazın mekansal lokalizasyonunu ortaya çıkarır.

Floresan In Situ Hibridizasyonun Ardından Fare Beyin Dilimlerinde Nöronların İmmün Boyanması

Gen ekspresyonunu spesifik hücre tiplerine lokalize etmek, spesifik antikorların eksikliği nedeniyle zor olabilir. Burada, çift floresan RNA'nın yerinde hibridizasyonunun immün boyama ile birleştirilmesiyle gen ekspresyonunun eşzamanlı üçlü tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Çift Floresan birleştiren<em&gt; In Situ</em&gt; Fare Beyin Bölüm Üç Genlerin İfade tespiti için immünoişaretleme ile Hibridizasyon

Burada, tüm hücre yama-klemp kayıtlarını kullanarak fare vomeronazal organının akut koronal doku dilimlerinde tanımlanmış bir duyusal nöron popülasyonunun tanımlanmasına ve derinlemesine analizine izin veren fizyolojik bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fare Vomeronazal Organ Akut Doku Dilimleri Tanımlı hücre popülasyonlarının derinlemesine Fizyolojik Analizi

Bu protokol, memeli hücrelerinde G-protein kenetli reseptör (GPCR) içselleştirmenin konfokal mikroskopi bağlanmasını anlatır. Temel hücre kültürü, transfeksiyon, ve konfokal mikroskopi prosedürü içeren füzyon ifade GPCR hücre içi lokalizasyonu ve içselleşmesini tespit etmek için etkin ve kolay yorumlanabilir bir yöntem sağlar.

Aynı odaklı mikroskopi ile ligand-aktif G protein-eşli reseptör özümseme tespiti

Bu iletişim kuralı kritik adımlar ve yama-kelepçe sonra tek hücre multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için gereken önlemleri açıklar. Bu teknik ifade profil genler tarafından yama-kelepçe kayıtları ile karakterize bir tek hücreden önceden belirlenmiş bir dizi analiz etmek için basit ve etkili bir yöntemdir.

Tek hücre Multiplex Ters transkripsiyon polimeraz zincir tepkimesi sonra yama-kelepçe

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Keşfedin fare vagal afferent nöronlarında G protein bağlantılı reseptör ekspresyonunu çoklu in situ hibridizasyon ile. Bu hassas yöntem transkripsiyonel profilleri haritalandırarak nörobiyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti (Video) | JoVE Journal

Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

Daha fazla video keşfet