Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım
1 Mart 2022
Melanosit fonksiyonlarının düzenleyicileri, pigmentasyon sonucundaki gözle görülür farklılıkları yönetir. Aday pigmentasyon geninin moleküler fonksiyonunu deşifre etmek bir zorluk teşkil eder. Burada, adayları tanımlamak ve bunları melanin içeriği ve melanosit sayısının düzenleyicileri olarak sınıflandırmak için bir zebra balığı model sisteminin kullanımını gösteriyoruz.
Bu protokol, araştırmacıların melanosit biyolojisinde aday genin rolünü tanımlamalarını sağlayacak çeşitli tekniklerin bir birleşimidir. Mantıksal bir çıkarım elde etmeye yönelik bütüncül bir yaklaşımdır. Çeşitli yöntemleri birleştirerek, kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınılabilir ve araştırmacıların önemli bir sonuç elde etmelerine yardımcı olabilir.
Analize başlamak için, 48 HPF embriyosunu% 0.016 trikain ile hareketsiz hale getirin. Embriyoları bir Petri kabında birkaç mililitre% 1.5 ila% 2 metil selüloz kullanarak monte edin. Embriyoları bir Pasteur pipeti ile seçin ve görüntüleme sırasında hareketi kısıtlamak için metil selüloza yerleştirin.
Optimum lateral veya dorsal görüntüleme için, konumlarını 5X'ten fazla büyütme ile ayarlayın. Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir manipülatör kullanarak, balıkları beş melanosit embriyonik çizginin tümü aynı anda görülecek şekilde ayarlayın.
Edinme yazılımını kullanarak görüntüleri yakalayın. Balık uyanırsa, stabilize olana kadar trikain suyuna koyun. ImageJ yazılımındaki açık aracı kullanarak, ölçülecek görüntüyü açın.
Analiz edilecek alanın ana hatlarını çizmek için serbest şekil aracını seçin. Ölçümleri ayarla seçeneğini belirleyin, ortalama gri değere ve ardından alana tıklayın. Seçilen alanın ortalama gri değerini hesaplamak için M'ye tıklayın veya analiz edip ölçüyü seçin.
İlgilenilen aşamaya bağlı olarak, embriyoları mililitre Pronaz başına 0.6 miligram içeren bir Petri kabına aktarın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, dekoryonlanmış embriyoları beş ila 10 dakika sonra düz embriyo suyu içeren bir Petri kabına aktarın. Bir cam Pasteur pipet ile yaklaşık 100 embriyo toplayın ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Ortamı atın ve 200 mikrolitre buz gibi soğuk deyolking Ringers çözeltisi ekleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve boyunduruğu çözmek için içeriği bir pipetle yaklaşık 20 kez karıştırın. Tüpleri 100 G'de bir dakika boyunca dört santigrat derecede iki kez santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları, 10 mililitre tripsin çözeltisi içeren bir Petri kabında bir mililitrelik bir pipet kullanarak aktarın. Toplamayı azaltmak için bir mililitrelik pipet kullanarak çözeltiyi bir veya iki kez karıştırın. Tek bir hücre süspansiyonu toplamak için tripnize edilmiş süspansiyonu 50 mililitrelik bir konik tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin.
Yapışmış hücreleri yüzeyden çıkarmak için Petri bulaşıklarını tripsinized süspansiyonla yıkayın. Bir akış sitometresi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücreleri saymak için, yeni bir deney klasörü oluşturduktan sonra, ileri ve yan saçılma grafiği çizin. Floresein izotiyosiyanatın yoğunluğu için bir histogram yapın.
İleri ve yan saçılma kapılarını ve FITC eşiğini ayarlamak için önce vahşi tip hücreleri yükleyin. Daha sonra, melanositleri saymak için transgenik FTYRP GFP hattı embriyolarından izole edilen hücreleri yükleyin. Embriyoları bir petri kabında% 1.5 ila% 2 metil selüloza monte edin.
Mikroskop altına yerleştirin ve bir pipet ucu kullanarak istediğiniz yönde ayarlayın. Satın alma yazılımını kullanarak görüntüleri edinin. 24 HPF'den küçük embriyolar için, 10X büyütme kullanarak, tüm görüntüyü yakalayın, 24 HPF'den fazla embriyolar için ise birden fazla tarama alanı elde edin ve daha sonra bunları birleştirin.
Tahlil yapıldıktan sonra, 48 saat sonra Brightfield görüntülemesi, beş pigmentli melanofor çizgisinin hepsinin varlığını ortaya çıkardı. 48 HPF evresinde, lateral melanofor sayısı hesaplandı ve histon varyantı h2afv morfantlarının kontrole kıyasla melanofor sayısında azalma gösterdiği bulundu. Ortalama gri değer CA14 ve h2afv morfantları için ölçüldü, bu da varyantlar için değerlerin kontrol morfantlarından daha yüksek olduğunu ortaya koydu.
Sodyum hidroksit bazlı spektrofotometrik absorpsiyon yöntemi kullanılarak, CA14 morfantlarının kontrol morfantlarından daha az içerik gösterdiği melanin içeriği ölçüldü. Zebra balığı melanofor gelişiminin farklı aşamalarında morfolino bazlı değişiklikleri değerlendirmek için floresan görüntüleme yapıldı. CA14 ve h2afv morfantlarındaki melanofor sayısı FACS kullanılarak analiz edildi.
CA14'teki melanofor sayısının değişmeden kaldığı, h2afv'de ise kontrol morfantına kıyasla anlamlı derecede azaldığı gözlendi. Alan başına ortalama floresan yoğunluğu da hesaplandı ve h2afv morfantlarının kontrol morfantlarına göre değerde önemli bir düşüş gösterdiği gösterildi. Görüntülemeden önce balıkları ayarlarken, beş melanofor çizgisini de görselleştirebildiğinizden emin olun.
İki yanal çizgiyi ayırt etmek için balıkları biraz eğmeniz gerekir. Melanosit gelişiminde aday genin rolünü belirledikten sonra, CRISPR teknolojisini kullanarak geni dokuya özgü bir şekilde ortadan kaldırabiliriz. Bu daha hedefli bir yaklaşım olacaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir zebrafish model sistemi kullanarak aday pigmentasyon genlerinin melanosit biyolojisindeki rolunu araştırmaktadır. Çeşitli görüntüleme teknikleri ve analizler uygulanarak, melanin içeriğinin ve melanosit sayısının temel düzenleyicileri belirlenmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Melanosit gelişimi
- Pigmentasyon genetiği
- Model organizma olarak zebra balığı
Arka Plan
- Pigmentasyon genlerinin moleküler fonksiyonunu anlamak, cilt rengi varyasyonlarını çözmek için temel teşkil eder.
- Araştırmalardaki karıştırıcı faktörler, gen fonksiyonlarının doğru değerlendirilmesini engelleyebilir.
- Zebrafish embriyoları, pigmentasyondaki erken gelişim süreçlerini incelemek için etkili bir model sunar.
Kullanılan Yöntemler
- Embriyoların immobilizasyonu ve görüntüleme teknikleri
- Biyolojik model olarak zebra balığı
- Melanosit sayımı için akış sitometrisi ve melanin içeriği için spektrofotometrik analizler
Temel Sonuçlar
- Kontrollere kıyasla h2afv morfantlarında azalmış melanofor sayıları gözlemlendi.
- CA14 morfantları, kontrol morfantlarına göre daha az melanin içeriği sergiledi.
- Floresan görüntüleme, melanoforlardaki gelişimsel farklılıkları doğruladı.
Sonuçlar
- Bulgular, melanosit gelişimi sırasında belirli pigmentasyon genlerinin önemini göstermektedir.
- Bu araştırma, pigmentasyon üzerindeki genetik etkilerin anlaşılması açısından daha geniş kapsamlı çıkarımlar sunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Bu protokol, melanosit gelişimindeki genetik düzenleyicilerin sistematik olarak sorgulanmasını sağlayarak, pigmentle ilişkili bozukluklarda hedef doğrulamasına destek olur. Fenotipik görüntüleme, akış sitometrisi ve biyokimyasal analizleri birleştirerek, keşif sürecinin erken aşamalarında mekanistik hipotezlerdeki riskleri azaltmak için kantitatif veriler sunar. Bu yaklaşım, melanosit sayısını etkileyen genler ile hücre başına melanin içeriğini etkileyen genleri ayırt etmede öngörülebilir güveni artırarak, topikal veya sistemik modülatörler için portföy önceliklendirmesine bilgi sağlar.
Biyofarmasötik Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hücre sayısı ile pigment sentezi üzerindeki etkilerine dayanarak, aday genlerin melanosit belirleyicileri ve farklılaştırıcıları şeklinde fonksiyonel olarak ayrıştırılmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Pigmentasyon yolları üzerindeki fenotipik sonuçları hızla değerlendirmek için zebrafish larvalarında morfolino nakavt yöntemini kullanır.
- Bilimsel Değer: Gen pertürbasyonunu, melanofor sayısı ve melanin içeriğindeki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek hipotez testlerini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Parlak alan görüntülemesinden ortalama gri değer ve spektrofotometre yoluyla melanin konsantrasyonu dahil olmak üzere standartlaştırılmış, kantitatif çıktılar üretir.
- Operasyonel Değer: Genetik modülatörlerin yüksek içerikli fenotipik taramasını mümkün kılmak için FACS tabanlı melanosit sayımını görüntüleme ile entegre eder.
- Bilimsel Değer: Boylamsal karşılaştırma için tanımlanmış evreleme (48 HPF), immobilizasyon ve görüntüleme parametreleri aracılığıyla assay tekrarlanabilirliğini kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnsan pigmentasyon biyolojisi ile ilgili melanosit spesifikasyonu ve diferansiyasyon aşamalarını takip etmek için transgenik GFP raporlayıcıları (mitfa, tyrp1) kullanır.
- Operasyonel Değer: Memeli modellerindeki aşağı yönlü doğrulamalara yol göstermek amacıyla, sonuçların mekanistik sınıflara (spesifikatörler ile diferansiyatörler) ayrıştırılmasını sağlar.
- Bilimsel Değer: Piebaldizm, albinizm veya vitiligo yolaklarında rol oynayan genlerin değerlendirilmesi için hastalıkla ilişkili bir sistem sunar.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, bileşik taraması veya mekanistik takip öncesinde genetik vuruşların melanosit biyolojisi üzerindeki etkilerinin doğrulandığı erken keşiften lead belirleme aşamasına kadar olan sürece uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Morfolino fenokopyası ve kantitatif görüntüleme yoluyla melanosit gelişimi üzerindeki gene özgü etkileri izole ederek hedef doğrulamayı destekler.
- Tarama: Genetik veya küçük moleküllü modülatörlerin ölçeklenebilir değerlendirmesi için floresan raporlayıcılara sahip, analize hazır zebra balığı modelleri sağlar.
- Analitikler: Veri odaklı hit triyajını desteklemek için multiparametrik okumalar —melanofor sayısı (FACS), melanin içeriği (spektrofotometri) ve uzaysal dağılım (görüntüleme)— sunar.
- Translasyonel Araştırma: Zebra balığı bulgularını insan pigmentasyon mekanizmalarıyla ilişkilendirmek için korunmuş melanosit markerlarını (mitfa, tyrp1) kullanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Hedef aileler ve terapötik alanlar genelinde uygulanabilir, pigment genetiği taraması için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Melanosit belirlemesini değiştiren genleri, hücre başına pigment üretimini etkileyenlerden ayırarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar ve tarama kampanyaları arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için embriyo taşıma, görüntüleme ve ayrıştırma protokollerini standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Medisinal kimyaya yatırım yapmadan önce hedef mekanizmada erken fenotipik güven sağlayarak git/gitme kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Melanosit spesifik fenotiplerin genetik doğrulamasına dayanarak hedeflerin riskle uyarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Doğru fenotipik değerlendirme için zebrafish embriyolojisi, mikroenjeksiyon ve morfolino tasarımı konularında uzmanlık gereklidir.
- Enstrümantasyon, çok parametreli okuma için floresan mikroskopları, akış sitometreleri ve spektrofotometreleri içerir.
- Ekipler arası standardizasyon, değişkenliği minimize etmek için senkronize evreleme (HPF), immobilizasyon protokolleri ve görüntüleme ayarları gerektirir.
- Diğer modellere adaptasyon, korunumlu promotör güdümlü raporların ve fenotipik uç noktaların doğrulanmasını gerektirebilir.
- Kısıtlamalar arasında morfolino hedef dışı etkileri ve geçici nakavt (knockdown) yer alır; bu durum, hedef onayı için CRISPR veya mutant hatlarla takip edilmesini gerektirir.
