Name: Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Keşfedin melanosit gelişiminde pigmentasyon genlerinin rolünü Danio rerio embriyoları kullanarak. Bu ters genetik yaklaşım, melanin içeriği ve melanosit sayısını nicelendirmek için görüntüleme ve akış sitometrisi tekniklerini birleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makalede sunulan çalışmayı desteklemek için Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi vide projesi MLP2008 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü'nün GAP165 projesi için finansman desteğini kabul ediyoruz. Jeyashri Rengaraju ve Chetan Mishra'ya deneylerdeki yardımları için teşekkür ederiz.

Zebra balığı deneyleri, Hindistan'daki CSIR-Genomik ve Bütünleştirici Biyoloji Enstitüsü'nün (IGIB) kurumsal hayvan etiği onayına (IAEC) sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi (Öneri No 45a). Hayvanların çektiği acıları en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
1. Zebra balığı embriyolarına morfolino enjekte edilmesi
<ol><li>Standart bir iğne çektirici kullanarak, çok keskin ve kapalı uçlu pipetler çizin.</li>
	<li>Morfolino içeren çözeltiyi bir mikroyükleyici ucu kullanarak mikropipetlere yükleyin ve mikroenjektör aparatına yerleştirin. Mikropipeti kilitlemek için vidayı düzgün bir şekilde sıkın. NOT: Morfolinoların dozaj standardizasyonu gereklidir. Uygun dozaj% >70 sağkalım oranına ve 24 hpf'de spesifik bir fenotipe sahiptir.</li>
	<li>İnce forseps kullanarak mikropipetin ucunu kesin ve kalibre edin11.</li>
	<li>Kalibre etmek için, mikropipetten kılcal tüpe 1 hacim morfolino çözeltisi enjekte edin ve enjeksiyon süresini 1 sn'de tutun. Bunu beş kez tekrarlayın. 1 mm = 30 nL hacim standardını kullanarak, kılcal boruyu bir ölçüm ölçeğine karşı tutarak 5 saniyede enjekte edilen hacmi bulun. Yukarıdaki bilgileri kullanarak, enjeksiyon12 başına 1-3 nL enjekte etmek için gereken süreyi (saniye cinsinden) hesaplayın. NOT: Standart, 1 mm = 30 nL, mikroenjektör basınç ayarlarına ve kalibrasyon için kullanılan kılcal damarın çapına özgüdür. İdeal olarak, enjeksiyon, döllenmeden sonra 15-20 dakika içinde oluşan yumurta sarısı hücresi arayüzüne yapılmalıdır. Çoklu enjeksiyonları kolaylaştırmak için, embriyoları daha düşük bir sıcaklıkta (18 ° C) tutarak gelişim biraz geciktirilebilir. Bununla birlikte, bu minimumda tutulmalı ve düşük sıcaklığın gen ekspresyon değişiklikleri üzerindeki bileşik etkisi nedeniyle 30 dakikadan fazla uzatılmamalıdır.</li>
	<li>Embriyoları agaroz dökümlü bir Petri kabına (60 mm) monte edin. Embriyoları sırtların içine sıkıca istifleyin. Ateşle cilalanmış cam pipetler kullanarak, enjeksiyon için doğru yönde hizalayın.</li>
	<li>Bir mikroskop altında, mikropipeti embriyoya yaklaştırmak için manipülatörler kullanın ve ayak pedalına basarak yumurta sarısı hücresi arayüzünün içine enjekte edin.</li>
	<li>Tüm embriyoları benzer şekilde enjekte edin; Onları taze embriyo su ortamı içeren bir Petri kabında toplayın ve 28 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Enjekte edilen embriyoları 6-8 saat sonra kontrol edin. Yüksek opaklıkları nedeniyle tanımlanabilen tüm ölü embriyoları çıkarın ve enfeksiyonu önlemek için embriyo suyunu günde en az bir kez değiştirmeye devam edin.</li>
</ol>2. Pigmentasyon analizi
<ol><li>3 dpf zebra balığı embriyolarında lateral orta hat melanoforlarını saymak için hazırlık<ol><li>Embriyoları hareketsiz hale getirmek için% 0.016 nöro-müsküler anestezi ile tedavi edin.</li>
		<li>Embriyoları görüntüleme için monte etmek için, Petri kabına (60 mm) birkaç mililitre% 1.5-2 metilselüloz ekleyin, böylece ince bir tabaka oluşturur. Bir Pasteur pipet kullanarak, görüntüleme sırasında daha fazla hareketi kısıtlamak için embriyoları seçin ve yavaşça metilselüloz içine yerleştirin.</li>
		<li>Optimal lateral (dorsal şerit, ventral şerit, yumurta sarısı şeridi ve orta hat melanoforları) veya dorsal (başın dorsal kısmındaki melanoforlar) görüntüleme için konumlarını ayarlayın. Bitişik melanoforların daha iyi çözünürlüğü için, daha yüksek büyütmede görüntü (>5x)</li>
	</ol></li>
	<li>Parlak alan görüntüleme NOT: Parlak alan görüntüleme, 8-10x büyütmeli bir stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilir.<ol><li>Zebra balığı embriyolarını içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir manipülatör kullanarak, balığı bu yönde ayarlayın, böylece beş melanosit embriyonik çizgisinin tümü aynı anda görünür (dorsal, ventral, iki lateral, yumurta sarısı) (Şekil 1C). Alma yazılımını kullanarak görüntüleri hızla yakalayın. Hayvanın görüntülenmeden önce hareketi yeniden kazanması durumunda, tekrar anesteziye daldırın ve yeterince hareketsiz hale getirildikten sonra görüntülemeye devam edin.</li>
		<li>Bunu tüm balıklarla tekrarlayın ve büyütmenin her görüntü için aynı kalmasını sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>ImageJ yazılımını kullanarak ortalama gri değeri hesaplama<ol><li>2 dpf zebra balığı embriyosunun dorsal ve lateral görüntülerini alın.</li>
		<li>Aç aracını kullanarak ImageJ'de ölçülecek görüntüyü açın. Analiz edilecek alanın ana hatlarını çizmek için serbest şekil aracını kullanın. Ölçümleri ayarla seçeneğine gidin ve Ortalama gri değer | alanı'nı seçin. M'ye basın (veya Analiz Et | Ölçüm) kullanarak seçilen alanın ortalama gri değerini hesaplar.</li>
		<li>Analiz edilecek alanı sabit tutarak, her hayvan için ortalama gri alanı ayrı ayrı hesaplayın.</li>
		<li>Elde edilen verilerle bir çubuk grafik çizin (Şekil 2F).</li>
	</ol></li>
	<li>Melanin içeriği analizi<ol><li>2 dpf'de, ~ 25 zebra balığı embriyosu toplamak için bir cam Pasteur pipet kullanın.</li>
		<li>1 mL insülin iğneleri kullanarak manuel dekoryonasyon yapın ve bunları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.</li>
		<li>Embriyo ortamını dikkatlice atın ve proteaz inhibitörü kokteyli ile 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu (20 mM sodyum fosfat (pH 6.8),% 1 Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) ekleyin ve sonikasyon ile protein lizatları hazırlayın.</li>
		<li>Lizatları 1 mL 1 N NaOH içinde çözün ve numuneleri bir su banyosunda 50 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin. Lizatları tamamen homojenize etmek için aralıklı olarak vorteks.</li>
		<li>Bir spektrofotometre kullanarak numunelerin 490 nm'de absorbans okumalarını alın.</li>
		<li>Numune absorbansını bilinen sentetik melanin konsantrasyonlarının standart bir eğrisiyle karşılaştırarak melanin içeriğini hesaplayın (Şekil 2G).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Melanofor sayısı
NOT: Transgenik Zebra balığı embriyolarında floresan analizi iki yöntemle yapılabilir: 1) GFP-pozitif hücrelerin sayılması; 2) floresan yoğunluğunun ölçülmesi.
<ol><li>Erken zebra balığı embriyolarında GFP-pozitif hücrelerin FACS tabanlı sayımı için hazırlık<ol><li>200-250 ftyrp:GFP embriyo toplayın ve düz embriyo suyu kullanarak bir süzgeçte yıkayın. Negatif bir kontrol olarak, GFP-negatif, aşama uyumlu vahşi tip (Assam Wildtype) embriyolarıişleyin 12.</li>
		<li>İlgilenilen aşamaya bağlı olarak, embriyoları 0.6 mg / mL pronaz içeren bir Petri kabına aktarın. 5-10 dakika sonra, bir Pasteur pipet kullanarak, dekoryonlanmış embriyoları sade embriyo suyu içeren taze bir Petri kabına aktarın. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, ~ 100 embriyo toplayın ve bunları 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>Ortamı dikkatlice atın ve 200 μL buz gibi soğuk Ringer çözeltisi (yumurta açma tamponu) ekleyin. Tüpü buz üzerinde tutarak, yumurta sarısı çözülene kadar içeriği ~ 20 kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyin. Tüpleri 100 × g'da 4 °C'de bir masa üstü santrifüjde 1 dakika boyunca santrifüj edin. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.</li>
		<li>1 mL'lik bir pipet kullanarak, yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları 10 mL tripsin çözeltisi (hücre ayrışma tamponu) içeren bir Petri kabına aktarın. Embriyoların aşırı kalabalıklaşmasını ve verimsiz tripsinizasyonu önlemek için birden fazla Petri kabında uygulayın. 1 mL'lik bir pipet kullanın, agregasyonu azaltmak için embriyo gövdelerini içeren çözeltiyi bir veya iki kez karıştırın.</li>
		<li>Petri kaplarını oda sıcaklığında 15 dakika (<24 hpf embriyo) veya 30 dakika (24-30 hpf embriyo) inkübe edin. Hücrelerin parçalanmasına yardımcı olmak için ara sıra 1 mL'lik bir pipet kullanarak süspansiyonu aspire edin ve dağıtın.</li>
		<li>Kuluçka döneminde, hücre sayımı için akış sitometre makinesini başlatın.</li>
		<li>50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için tripnize edilmiş süspansiyonu süzgeçten geçirin. Petri bulaşıklarını yüzeye yapışmış hücreleri çıkarmak için aynı süspansiyonla birkaç kez yıkayın.</li>
		<li>Numuneleri 450 × g, 4 °C'de sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca döndürün.</li>
		<li>Süpernatantı atın ve peleti 1mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.</li>
		<li>450 × g, 4 ° C'de 5 dakika boyunca tekrar döndürün ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Son olarak, pelet PBS +% 5 fetal sığır serumunda tekrar askıya alın ve FACS çalışana kadar buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometresinin hazırlanması<ol><li>Akış sitometresini açın ve başlatmayı başlatın. NOT: Makineyi açmadan önce, atık kutusunu boşaltın ve kılıf sıvısı tankını doldurun.</li>
		<li>70 μm (veya 85 μm) nozul için akışın akışını normalleştirin. Kararsızsa 10-15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir akış sitometresi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücreleri sayma<ol><li>Yeni bir deneme klasörü başlatın ve yan saçılmaya karşı ileri saçılmanın ve floresein izotiyosiyanat (FITC) yoğunluğunun histogramının bir dağılım grafiğini oluşturun.</li>
		<li>İleri ve yan saçılma kapılarını (çiftleri ve kalıntıları dışlamak için) ve FITC eşiğini ayarlamak için önce vahşi tip hücreleri yükleyin.</li>
		<li>Kapılar ayarlandıktan sonra, numuneyi çıkarın ve melanositleri saymak için Tg (ftyrp1: GFP) embriyolarından izole edilen hücreleri yükleyin. NOT: Burada, ftyrp1: GFP özellikle olgun melanositleri etiketlediğinden, FITC kapısı altındaki GFP-pozitif hücrelerin sayısı melanosit sayısına karşılık gelecektir.</li>
		<li>Melanosit sayısını kontrol ile tahmin etmek ve karşılaştırmak için yukarıdaki adımı morfolino enjekte edilmiş örneklerle tekrarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Zebra balığı embriyolarında floresan yoğunluğunun ölçülmesi<ol><li>Bir cam Pasteur pipet kullanarak, 100-120 embriyo toplayın ve bunları düz embriyo suyu içeren bir Petri kabına aktarın.</li>
		<li>~ 10-12 hpf'de, pigmentasyonu inhibe etmek için embriyoları% 0.003 1-fenil-2-tiyoüreye aktarın.</li>
		<li><48 hpf embriyoları görüntülemek için insülin iğneleri kullanarak manuel dekoryonasyon gerçekleştirin.</li>
		<li>Embriyoları hareketsiz hale getirmek için,% 0.016 trikain ile tedavi edin.</li>
		<li>Görüntüleme için embriyoları monte etmek için, Petri kabına (60 mm) birkaç mL% 1.5-2 metilselüloz koyun, böylece ince bir tabaka oluşturur. Görüntüleme sırasında daha fazla hareketi kısıtlamak için embriyoları metilselüloza ekleyin. Örnekleri içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir pipet ucu kullanarak, hayvanı istediğiniz yönde ayarlayın.</li>
		<li>Alma yazılımını kullanarak görüntüleri alın. <24 hpf embriyolar için, tüm embriyoyu bir kerede 10x büyütme altında yakalayın. >24 hpf aşamaları için, birden fazla tarama alanı elde edin ve daha sonra bunları bir araya getirin (dikin).</li>
		<li>Bunu tüm balıklarla tekrarlayın ve edinme ayarının deney boyunca sabit kaldığından emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Miktar<ol><li>ImageJ yazılımını kullanarak görüntüyü daha fazla analiz edin.</li>
		<li>Aç aracını kullanarak ImageJ'de ölçülecek görüntüyü açın.</li>
		<li>Analiz için alanın ana hatlarını çizmek üzere serbest şekil aracını kullanın (Şekil 3E).</li>
		<li>M'ye basın (veya Analiz Et | Ölçüm) seçili bir alan yoğunluğu ölçümü elde etmek için.</li>
		<li>Analiz edilecek alanı sabit tutarak, her hayvan için alan başına ortalama yoğunluğu ayrı ayrı hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kelsh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+evolution+of+pigment+patterns+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics and evolution of pigment patterns in fish.</a> Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).</li>
<li>Jablonski, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+human+skin+and+skin+color%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Anthropology%22%5BJournal%5D)">The evolution of human skin and skin color.</a> Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).</li>
<li>Hoekstra, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+development+and+evolution+of+adaptive+pigmentation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates.</a> Heredity. 97 (3), 222-234 (2006).</li>
<li>Quigley, I. K., Parichy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+pattern+formation+in+zebrafish%3A+a+model+for+developmental+genetics+and+the+evolution+of+form%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Pigment pattern formation in zebrafish: a model for developmental genetics and the evolution of form.</a> Microscopy Research and Technique. 58 (6), 442-455 (2002).</li>
<li>Meyers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+development+of+a+vertebrate+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: development of a vertebrate model organism.</a> Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Kelsh, R. N., Schmid, B., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+melanophore+development+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of melanophore development in zebrafish embryos.</a> Developmental Biology. 225 (2), 277-293 (2000).</li>
<li>Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development%3A+insights+from+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Neural crest development: insights from the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).</li>
<li>Carney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+role+for+Sox10+in+specification+of+neural+crest-derived+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons.</a> Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).</li>
<li>Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxd3+controls+melanophore+specification+in+the+zebrafish+neural+crest+by+regulation+of+Mitf%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neural crest by regulation of Mitf.</a> Developmental Biology. 332 (2), 408-417 (2009).</li>
<li>Zou, J., Beermann, F., Wang, J., Kawakami, K., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fugu+tyrp1+promoter+directs+specific+GFP+expression+in+zebrafish%3A+tools+to+study+the+RPE+and+the+neural+crest-derived+melanophores%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The Fugu tyrp1 promoter directs specific GFP expression in zebrafish: tools to study the RPE and the neural crest-derived melanophores.</a> Pigment Cell Research. 19 (6), 615-627 (2006).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li>
<li>Hermanson, S., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Balciunas, D., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon+for+efficient+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon for efficient gene delivery.</a> Methods in Cell Biology. 77, 349-362 (2004).</li>
<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for morpholino use in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+progress+of+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+generating+mouse%2Fzebrafish+models+of+human+skeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">The progress of CRISPR/Cas9-mediated gene editing in generating mouse/zebrafish models of human skeletal diseases.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 954-962 (2019).</li>
<li>Affenzeller, S., Frauendorf, H., Licha, T., Jackson, D. J., Wolkenstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+eumelanin+and+pheomelanin+markers+in+diverse+biological+samples+by+HPLC-UV-MS+following+solid-phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitation of eumelanin and pheomelanin markers in diverse biological samples by HPLC-UV-MS following solid-phase extraction.</a> PLoS One. 14 (10), 0223552(2019).</li>
<li>Fernandes, B., Matamá, T., Guimarães, D., Gomes, A., Cavaco-Paulo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+quantification+of+melanin%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent quantification of melanin.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. 29 (6), 707-712 (2016).</li>
<li>Hultman, K. A., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+direct-developing+and+stem+cell-derived+melanocytes+to+the+zebrafish+larval+pigment+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of direct-developing and stem cell-derived melanocytes to the zebrafish larval pigment pattern.</a> Developmental Biology. 337 (2), 425-431 (2010).</li>
<li>Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+melanocyte+lineage+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The melanocyte lineage in development and disease.</a> Development. 142 (4), 620-632 (2015).</li>
</ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Pigmentasyon fenotipi genellikle melanin içeriğindeki değişiklikler veya pigment taşıyan melanositlerin sayısındaki değişiklikler olarak kendini gösterir. Burada açıklanan yöntem, bu dikotominin diseksiyonuna izin verir ve melanin içeriğinden bağımsız olarak, melanin içeriğinin ve embriyo başına melanofor sayısının kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirilmesine izin verir. Zebra balıklarının yüksek doğurganlığı, pigmentli melanositlerin görünür doğası ve melanozom transferinin olmaması, orta verimli taramaya uygun bu...

Fotokoruma için melanin kullanımı hayvan krallığında birkaç kez evrimleşmiş olsa da, omurgalılar süreci mükemmelleştirmiş gibi görünmektedir. Melanini sentezlemek ve içermek için ayrıntılı bir makineye sahip özel pigment üreten hücreler balıklardan insanlara korunur1. Bununla birlikte, pigmentasyonun sonucu, renkten resme kadar değişen ve bütünlükler, cilt ve saç2 üzerinde canlı desenler olarak ortaya çıkan çarpıcı bir şekilde çeşitlidir. Çeşitliliğe rağmen, pigmentasyon yanıtında rol oynayan genlerin repertuarı çarpıcı bir şekilde korunmuştur. Melanin sentezleyen makinenin temel bileşenleri, örneğin anahtar melanin sentezleyici enzimler, melanozomların bileşenleri ve sinyal yoluna yukarı akış bağlantısı, organizmalar arasında temelde aynı kalır. İnce genetik farklılıklar, tür3'te gözlenen pigmentasyon modellerinde dramatik değişiklikler meydana getirir. Bu nedenle, daha düşük omurgalı bir organizma olan zebra balığında (Danio rerio) ters genetik bir yaklaşım, genlerin pigmentlidurumun 4 oluşturulmasındaki katılımını deşifre etmek için mükemmel bir fırsat sunar.
Zebra balığı embriyoları, tek hücreli döllenmiş bir zigottan larvaya döllenme sonrası ~24 saatlik bir süre içinde gelişir (hpf)5. Çarpıcı bir şekilde, melanosit eşdeğeri hücreler - melanoforlar - dermiste bulunan ve koyu melanin içeriği6 nedeniyle göze çarpan büyük hücrelerdir. Bu nöral tepe türevli hücreler ~11 hpf yayar ve ~24 hpf 6,7 pigmente başlar. Korunmuş gen ekspresyon modülleri, melanosit fonksiyonlarını düzenleyen anahtar faktörlerin tanımlanmasını sağlamış ve melanosit gelişiminin seçici aşamalarını etiketleyen transgenik floresan muhabir hatları Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) ve Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10'un geliştirilmesine yol açmıştır. Bu transgenik balık çizgilerinin kullanılması, melanositlerin hücre biyolojisinin doku bağlamında organizma düzeyinde gelişimsel zaman çizelgelerine göre uygun ipuçlarıyla sorgulanmasını sağlar. Bu muhabirler, melanositlerin pigment bazlı kantitasyonunu tamamlar ve melanin içeriğinden bağımsız olarak melanosit sayılarının farklı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Bu makale, melanin içeriği ve melanosit sayıları olmak üzere iki kritik parametreyi değerlendirerek melanositlerin biyolojisini deşifre etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Birincisi, bir hipopigmentasyon yanıtından kaynaklanan yaygın bir fonksiyonel okuma iken, ikincisi melanositlerin spesifikasyonunda veya hayatta kalmasında bir azalma ile ilişkilidir ve genellikle genetik veya edinilmiş depigmentasyon koşullarıyla ilişkilidir. Bu ters genetik taramanın genel stratejisi, bir morfolino kullanarak seçilmiş genleri susturmak ve melanosit spesifik sonuçları araştırmaktır. Melanin içeriği, ortalama gri değerlerin görüntüye dayalı nicelleştirilmesi kullanılarak analiz edilir ve ardından bir melanin içeriği testi kullanılarak doğrulanır. Olgunlaşmanın çeşitli aşamalarındaki melanositlerin sayısı, görüntü tabanlı kantitasyon kullanılarak analiz edilir ve FACS analizi kullanılarak daha da doğrulanır. Burada, tarama protokolü, melanogenezde rol oynayan karbonik anhidraz 14 olmak üzere iki aday gen ve nöral krest öncü popülasyonundan melanositlerin spesifikasyonunda yer alan bir histon varyantı H2AFZ.2 kullanılarak gösterilmiştir. Birincisi melanosit sayılarını değil melanin içeriğini değiştirirken, ikincisi belirtilen melanositlerin sayısını ve sonuç olarak embriyodaki melanin içeriğini değiştirir. Sonuçta, bu yöntem, bir aday genin pigmentasyondaki rolünü tanımlamak ve melanosit sayılarını melanin içeriğine karşı kontrol etmedeki rolünü ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Mikrotüpler</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td>MO çözeltisi hazırlamak için</td></tr><tr><td>2 mL Mikrotüpler</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td>FACS protokolündeki yıkama adımları için</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9539-500G</td><td>Mikroenjeksiyon için</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td>Hücre sıralama için</td></tr><tr><td>Kılcal boru</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Corning hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td>Tek hücreli süspansiyon yapmak için</td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikoz</td><td>Ortamı Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td>FACS protokolü</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Trikain)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td>, <td>görüntüleme için ZF'yi hareketsiz hale getirmek için</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA) Sigma-Aldrich</td><td></td><td>E5134</td><td>Soğuk lizis tamponu</td></tr><tr><td>için FACS tüpleri</td><td>BD-Biosciences</td><td>342065</td><td>FACS protokolü</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10270</td><td>FACS protokolü</td></tr><tr><td>Graphpad prizma Yazılımı</td><td>Graphstats Technologies</td><td>NA</td><td>Veri gösterimi için</td></tr><tr><td>ImageJ Yazılımı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü</td><td>NA</td><td>Görüntü analizi için</td></tr><tr><td>İnsülin Şırıngaları (1 mL)</td><td>DispoVan</td><td>NA</td><td>Manuel dekoryonasyon için</td></tr><tr><td>Melanin, Sentetik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8631</td><td>Melanin içeriği deneyi için</td></tr><tr><td>Metilselüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7027-250G</td><td>görüntüleme için ZF'yi hareketsiz hale getirmek için</td></tr><tr><td>Mikro yükleyici uçları</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Mikroenjeksiyon için</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gen araçları</td><td>NA</td><td>Yıkma deneyleri için</td></tr><tr><td>N-Feniltiüre (PTU)</td> <td>Melanin oluşumunu engellemek</td>için <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td></tr><tr><td>İğne çektirme Sutter</td><td>Aleti</td><td>P-97</td><td>Mikroenjeksiyon için</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td>FACS protokolü</td></tr><tr><td>Petridish (60 mm)</td> <td>Tarsons</td><td>460090</td><td>için embriyo plakaları</td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>Soğuk lizis tamponu için</td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin (PBS)</td><td>HiMedia</td><td>TL1099-500mL</td><td>Hücreleri yıkamak için</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53702</td><td>Dekoryonasyon için</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Soğuk lizis tamponu</td></tr><tr><td>için Kılıf sıvı</td><td>BD FACSFlowTM</td><td>342003</td><td>FACS protokolü</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat</td><td>Merck</td><td>7558-79-4</td><td>Soğuk lizis tamponu</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML</td><td>Soğuk lizis tamponu için</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>1677119</td><td>Tripsinizasyon için</td></tr></tbody></table>

zebra balığı kullanarak pigmentasyon düzenleyicilerini tanımlamak için ters genetik yaklaşım

Reverse Genetic Approach to Identify Regulators of Pigmentation using Zebrafish

Melanositler, epidermal deride bulunan özelleşmiş nöral tepe türevli hücrelerdir. Bu hücreler, genomu zararlı ultraviyole radyasyonlardan koruyan melanin pigmentini sentezler. Melanosit fonksiyonlarındaki bozulmalar piebaldizm, albinizm, vitiligo, melazma ve melanom gibi pigmenter bozukluklara yol açar. Zebrafish, melanosit fonksiyonlarını anlamak için mükemmel bir model sistemdir. Göze çarpan pigmentli melanositlerin varlığı, genetik manipülasyon kolaylığı ve transgenik floresan hatlarının mevcudiyeti pigmentasyon çalışmasını kolaylaştırır. Bu çalışma, melanositlerin çeşitli aşamalarını işaretleyen mitfa ve tyrp1 promotörleri altında yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendiren vahşi tip ve transgenik zebra balığı çizgilerinin kullanımını kullanmaktadır. 
Larva pigmentasyonu üzerindeki fenotipik sonucu değerlendirmek için aday genlerin morfolino bazlı susturulması sağlanır ve pigmentasyon düzenleyicileri için tarama için uygulanabilir. Bu protokol, pigmentasyon sonucunu kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için mikroenjeksiyondan görüntülemeye ve floresanla aktive hücre sıralama (FACS) bazlı fenotiplerin iki aday gen, karbonik anhidraz 14 (Ca14) ve bir histon varyantı (H2afv) kullanılarak diseksiyonuna kadar olan yöntemi göstermektedir. Ayrıca, bu protokol, aday genlerin, sırasıyla hücre başına melanosit sayılarını ve melanin içeriğini seçici olarak değiştiren melanosit belirteçlerine ve farklılaştırıcılarına ayrıldığını göstermektedir.

Şekil 1'de açıklanan iş akışı, zebra balığı tek hücreli aşamasında morfolino bazlı genetik pertürbasyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Pigmentasyon analizi aşağıda belirtildiği gibi çeşitli yöntemler kullanılarak yapılmıştır. Temsili sonuçları göstermek için, zebra balığı embriyosunun sarısına veya tek hücreli aşamasına h2afv ve ca14 genlerini hedef alan standartlaştırılmış antisens morfolino hacimleri enjekte edildi. Parlak alan görüntülemesine dayanan ilk fenotiplem...

Melanosit fonksiyonlarının düzenleyicileri, pigmentasyon sonucundaki gözle görülür farklılıkları yönetir. Aday pigmentasyon geninin moleküler fonksiyonunu deşifre etmek bir zorluk teşkil eder. Burada, adayları tanımlamak ve bunları melanin içeriği ve melanosit sayısının düzenleyicileri olarak sınıflandırmak için bir zebra balığı model sisteminin kullanımını gösteriyoruz.

Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım

Melanocytes are specialized neural crest-derived cells present in the epidermal skin. These cells synthesize melanin pigment that protects the genome from ...

Bu protokol, araştırmacıların melanosit biyolojisinde aday genin rolünü tanımlamalarını sağlayacak çeşitli tekniklerin bir birleşimidir. Mantıksal bir çıkarım elde etmeye yönelik bütüncül bir yaklaşımdır. Çeşitli yöntemleri birleştirerek, kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınılabilir ve araştırmacıların önemli bir sonuç elde etmelerine yardımcı olabilir.Analize başlamak için, 48 HPF embriyosunu% 0.016 trikain ile hareketsiz hale getirin. Embriyoları bir Petri kabında birkaç mililitre% 1.5 ila% 2 metil selüloz kullanarak monte edin. Embriyoları bir Pasteur pipeti ile seçin ve görüntüleme sırasında hareketi kısıtlamak için metil selüloza yerleştirin.Optimum lateral veya dorsal görüntüleme için, konumlarını 5X'ten fazla büyütme ile ayarlayın. Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir manipülatör kullanarak, balıkları beş melanosit embriyonik çizginin tümü aynı anda görülecek şekilde ayarlayın.Edinme yazılımını kullanarak görüntüleri yakalayın. Balık uyanırsa, stabilize olana kadar trikain suyuna koyun. ImageJ yazılımındaki açık aracı kullanarak, ölçülecek görüntüyü açın.Analiz edilecek alanın ana hatlarını çizmek için serbest şekil aracını seçin. Ölçümleri ayarla seçeneğini belirleyin, ortalama gri değere ve ardından alana tıklayın. Seçilen alanın ortalama gri değerini hesaplamak için M'ye tıklayın veya analiz edip ölçüyü seçin.İlgilenilen aşamaya bağlı olarak, embriyoları mililitre Pronaz başına 0.6 miligram içeren bir Petri kabına aktarın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, dekoryonlanmış embriyoları beş ila 10 dakika sonra düz embriyo suyu içeren bir Petri kabına aktarın. Bir cam Pasteur pipet ile yaklaşık 100 embriyo toplayın ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Ortamı atın ve 200 mikrolitre buz gibi soğuk deyolking Ringers çözeltisi ekleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve boyunduruğu çözmek için içeriği bir pipetle yaklaşık 20 kez karıştırın. Tüpleri 100 G'de bir dakika boyunca dört santigrat derecede iki kez santrifüj edin ve süpernatanı atın.Yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları, 10 mililitre tripsin çözeltisi içeren bir Petri kabında bir mililitrelik bir pipet kullanarak aktarın. Toplamayı azaltmak için bir mililitrelik pipet kullanarak çözeltiyi bir veya iki kez karıştırın. Tek bir hücre süspansiyonu toplamak için tripnize edilmiş süspansiyonu 50 mililitrelik bir konik tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin.Yapışmış hücreleri yüzeyden çıkarmak için Petri bulaşıklarını tripsinized süspansiyonla yıkayın. Bir akış sitometresi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücreleri saymak için, yeni bir deney klasörü oluşturduktan sonra, ileri ve yan saçılma grafiği çizin. Floresein izotiyosiyanatın yoğunluğu için bir histogram yapın.İleri ve yan saçılma kapılarını ve FITC eşiğini ayarlamak için önce vahşi tip hücreleri yükleyin. Daha sonra, melanositleri saymak için transgenik FTYRP GFP hattı embriyolarından izole edilen hücreleri yükleyin. Embriyoları bir petri kabında% 1.5 ila% 2 metil selüloza monte edin.Mikroskop altına yerleştirin ve bir pipet ucu kullanarak istediğiniz yönde ayarlayın. Satın alma yazılımını kullanarak görüntüleri edinin. 24 HPF'den küçük embriyolar için, 10X büyütme kullanarak, tüm görüntüyü yakalayın, 24 HPF'den fazla embriyolar için ise birden fazla tarama alanı elde edin ve daha sonra bunları birleştirin.Tahlil yapıldıktan sonra, 48 saat sonra Brightfield görüntülemesi, beş pigmentli melanofor çizgisinin hepsinin varlığını ortaya çıkardı. 48 HPF evresinde, lateral melanofor sayısı hesaplandı ve histon varyantı h2afv morfantlarının kontrole kıyasla melanofor sayısında azalma gösterdiği bulundu. Ortalama gri değer CA14 ve h2afv morfantları için ölçüldü, bu da varyantlar için değerlerin kontrol morfantlarından daha yüksek olduğunu ortaya koydu.Sodyum hidroksit bazlı spektrofotometrik absorpsiyon yöntemi kullanılarak, CA14 morfantlarının kontrol morfantlarından daha az içerik gösterdiği melanin içeriği ölçüldü. Zebra balığı melanofor gelişiminin farklı aşamalarında morfolino bazlı değişiklikleri değerlendirmek için floresan görüntüleme yapıldı. CA14 ve h2afv morfantlarındaki melanofor sayısı FACS kullanılarak analiz edildi.CA14'teki melanofor sayısının değişmeden kaldığı, h2afv'de ise kontrol morfantına kıyasla anlamlı derecede azaldığı gözlendi. Alan başına ortalama floresan yoğunluğu da hesaplandı ve h2afv morfantlarının kontrol morfantlarına göre değerde önemli bir düşüş gösterdiği gösterildi. Görüntülemeden önce balıkları ayarlarken, beş melanofor çizgisini de görselleştirebildiğinizden emin olun.İki yanal çizgiyi ayırt etmek için balıkları biraz eğmeniz gerekir. Melanosit gelişiminde aday genin rolünü belirledikten sonra, CRISPR teknolojisini kullanarak geni dokuya özgü bir şekilde ortadan kaldırabiliriz. Bu daha hedefli bir yaklaşım olacaktır.

reverse-genetic-approach-to-identify-regulators-pigmentation-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, gelişimsel olarak düzenlenir genleri potansiyel artırıcı unsurları bulma ve mozaik zebrafish transgenesis fonksiyonu değerlendirmede bizim yaklaşımımız göstermektedir.

Mozaik Zebra balığı Transgenesis Enhancer Diziler değerlendirilmesi için

Bu video, çok renkli konfokal zaman atlamalı görüntüleme ve hedeflenen hücre ablasyon teknikleri verilmektedir. Time-lapse görüntüleme ilgi birden fazla hücre tiplerinin davranışlarını izlemek için...

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

Bir zebrafish otokton tümör modeli kullanılarak melanoma düzenleyiciler için ekran için hızlı bir şekilde sunulmaktadır. Bu melanosit aday melanom genlerin ifadesi için izin miniCoopR vektör yararlanır. Melanom sağkalım eğrileri, bir işgal testi, ölçek melanosit antikor boyama için bir protokol ve bir melanom nakli tahlil elde bir yöntem tarif edilmiştir.

Bir Zebra balığı Otokton Tümör Modeli kullanılarak Melanom Değiştiricileri için Tarama

Bu tür gen-spesifik morpholinos intraventriküler enjeksiyonları kullanarak doku rejenerasyonu gibi gelişme ve fizyolojik homeostasis sonraki aşamalarında gen fonksiyonunu değerlendirmek için zebrabalıkları için uyarlanabilir ters genetik bir yöntem.

Zebra balığı Larva Çoklu Zor-hedef dokular geçiştirilmesi için Kardiyak Ventriküler Injection kullanarak Genetik Morfolino Yaklaşım ters

farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

Burada zebra balığı embriyonik beynini larva ve çocuk evrelerine kadar in vivo olarak görüntüleyen bir yöntem sunuyoruz. Elektrofizyolojik yaklaşımlardan uyarlanan bu mikroinvaziv prosedür, olgun nöronun hücresel ve hücre altı ayrıntılarına erişim sağlar ve beyin fonksiyonu ve ilaç müdahalesini karakterize etmek için optogenetik ve nörofarmakolojik çalışmalarla birleştirilebilir.

Kafatası ve Deri Temizleme ile Uyanık Zebra Balığı Larvaları ve Yavrularında Tam Aktif Beyin Dokusunun In vivo Görüntülemesi

Bu protokol, transgenik zebra balığı modeli kullanarak retinal pigment epitelini (RPE) genetik olarak ablate etme metodolojisini açıklamaktadır. Farmakolojik bileşikler kullanarak sinyal yolu modülasyonunu içerecek şekilde protokolün uyarlanması kapsamlı bir şekilde detaylandırılmıştır. Pigmentasyona dayalı RPE rejenerasyonunu ölçmek için bir MATLAB platformu geliştirildi ve sunuldu ve tartışıldı.

Zebra Balığı Retinal Pigment Epitelinin Rejenerasyonunu İncelemek için Nitroredüktaz / Metronidazol Aracılı Ablasyon ve Bir MATLAB Platformu (RpEGEN)

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

Keşfedin melanosit gelişiminde pigmentasyon genlerinin rolünü Danio rerio embriyoları kullanarak. Bu ters genetik yaklaşım, melanin içeriği ve melanosit sayısını nicelendirmek için görüntüleme ve akış sitometrisi tekniklerini birleştirir.

Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım

Daha fazla video keşfet