Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Bu yöntem, üreme alanındaki kilit sorulardan birini, yani genetik olarak düzenlenmiş süreçlerin kadınları etkilediğini bildiğimiz yumurtalık rezervinin boyutunu nasıl ve ne zaman etkilediğini, üreme ömrünü nasıl ve ne zaman etkilediğini cevaplamaya yardımcı olabilir Bu protokol, farklı gelişim aşamalarından bozulmamış yumurtalıklar için aynı teknikleri kullanan büyük ölçekli çalışmalar için benimsenebilir. Germ hücrelerinin verimli bir şekilde ölçülmesini sağlayarak üretilebilir veriler üretir. Aynı türün genetik olarak farklı hayvanlarına uygulanan bu yöntem, genetik faktörler hakkında doğrudan germ hücresi ve yumurtalık gelişimi ve diğer gelişim organları hakkında fikir verebilir.

Prosedürü gösteren Nathaniel Boechat, laboratuvarımdan bir araştırma stajyeri olacak Bolluk adım yeri ile başlamak ve anestezi uygulanmış ergenlik dişi fareyi sırtına sabitlemek için tüm bacakları pençe pedlerinden yavaşça bir tahtaya rahat bir pozisyonda sabitleyerek. Farenin göğüs boşluğunu açmak için, kürek kemiğinin hemen altındaki sternumun her iki tarafındaki kaburgaları dikkatlice kesin, akciğerleri delmekten kaçının, forseps ile cildi veya kaburga kapaklarını tutun ve iç organları açığa çıkarmak için kanatları sabitleyin, kalbin sağ atriyumunu kesmek ve sistemden kan salmak için diseksiyon makası kullanın. Daha sonra kalbi forseps ile tutarak sol ventriküle bir perfüzyon iğnesi yerleştirin ve hafif ve sabit bir basınçla 10 mililitre PBS pompalayın.

Karaciğer böbrekleri ve üreme sistemi gibi dokular pembeden beyaza döndüğünde, PBS'yi taze yapılmış% 1 paraformaldehit veya PFA ile değiştirin ve yaklaşık 10 mililitre PFA ile perfüzyona devam edin. Daha sonra yağ yastığını böbreğin altındaki yumurtalıklarla birlikte yerleştirin ve% 4 PFA içeren bir şişeye yerleştirmek için yağ pedi yumurtalıkları ve uterus boynuzları da dahil olmak üzere tüm üreme sistemini nazikçe disseke edin. % 4 PFA'yı% 70 etanol ile değiştirmeden önce yumurtalıkları oda sıcaklığında 16 ila 24 saat sabitleyin.

Boyama gününde, immün boyama işlemine devam etmeden önce yumurtalıkları düzeltin. İmmüno-boyama protokolünün birinci gününde, kuyu başına bir mililitre PBS'yi temiz bir 24 kuyu plakasında istenen sayıda kuyuya pipetleyin. Geniş bir açıklık yapmak için 1000 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu kesin ve ergenlik yumurtalıklarını% 70 etanol içeren şişelerden Kuyucuklara nazikçe aktarmak için geniş ucu kullanın, ardından kuyudaki PBS'yi taze 0.8 mililitre PBS ile değiştirin Ertesi gün PBS'yi kuyu başına 0.8 mililitre geçirgenlik tamponu ile değiştirmek için kuyulardan aspire edin.

Çalkalayıcı üzerindeki plakaları dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe ettikten sonra, geçirgenlik tamponunu bloke edici tamponla değiştirin Üçüncü günde, birincil antikorları bloke edici tamponda seyrelterek hazırlayın. Yumurtaları görselleştirmek için prenatal ve prepubertal yumurtalıkları oosit belirteçleri ile inkübe edin. Sekizinci günde numuneleri iki saat boyunca taze bir yıkama tamponu ile yıkayın, ardından yıkama tamponunu bir blokaj tamponunda seyreltilmiş 0,5 mililitre ikincil antikor karışımları ile değiştirin.

Buharlaşmayı önlemek için plakayı bir parafilm ile kapatın ve numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında üç gün boyunca inkübe edin. İmmüno-boyama yıkamasından sonraki 11. günde, yıkama tamponunu aspire edin ve numuneleri karanlıkta üç gün boyunca 37 santigrat derecede 0.8 mililitre ölçek kübik bir çözeltisi ile inkübe edin. Ölçek kübik bir çözümünün günlük olarak değiştirilmesi.

15. günde, numuneleri 10 dakika boyunca üç kez ve oda sıcaklığında 0,8 mililitre PBS'yi hafifçe çalkalayarak yıkayın. Daha sonra PBS'yi taze hazırlanmış gazdan arındırılmış% 20 sakkarozun 0,8 mililitresini PBS ile değiştirin ve ardından oda sıcaklığında hafifçe sallayın. Bir saat sonra, numuneleri daha önce açıklandığı gibi, dört ila beş gün boyunca 0.8 mililitre ölçek kübik iki çözeltisi ile işlemek için% 20 sakkaroz çözeltisini değiştirin.

Bir numune seti hazırlamak için, 15 ila 20 mikrolitre ölçekli kübik iki çözelti içeren pubertal yumurtalıkları yapışkan kuyucuğun ortasına aktarmak için ucu kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın. Yumurtalıklar bir damla temizleme çözeltisi ile bireysel kuyuya aktarıldıktan sonra, yapışkan kuyucuğun üzerine yavaşça bir kapak camı yerleştirin ve numuneleri sandviçleyen ve iki kapak kapağı arasında temizleme çözeltisi oluşturan bir conta oluşturmak için bastırın. Görüntüleme yeri için, kapak 3D baskılı mikroskop adaptörü slaytında sandviç kayar.

Görüntü alma parametrelerini mikroskopi çekirdeklerine veya üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın. Varsa, tarama süresini kısaltmak ve verimliliği artırmak için çift yönlü görüntü yakalamayı kullanın. Yazılımdaki çizgi ortalamasını, kare ortalamasını ve kare birikimini ayarlayın.

Başlangıç ve bitiş konumunu belirleyerek Z yığınını ayarlayın, ardından prepubertal yumurtalıklar için iki mikrometre ve pubertal yumurtalıklar için beş mikrometrelik bir Z adım boyutu seçin. Ardından Z telafisi özelliğini ve uyarma kazancını etkinleştirin. Her ikisi için de bir lazer yoğunluğu seçerek numunenin alt ve üst kısmı için Z telafisi ayarlayın.

Tek bir görüş alanında yakalanamayan daha büyük örnekler için döşeme modunu kullanın. Görüntü gezginini etkinleştirin ve dikdörtgen işaretleme aracıyla tüm numuneyi yakalamak için gereken kutucuk sayısını belirtin. Ayar tamamlandıktan sonra, birden fazla döşemeye sahip görüntüler için görüntü alma ile başlayın, tüm döşemeleri yakalamak için gezginle görüntü almaya başlayın.

Görüntü alımından sonra, tüm görüntüleri kaydedin. Birden çok kutucuk edinilmişse, döşemeleri tek bir görüntüde birleştirmek için mozaik birleştirilmiş aracını çalıştırın. Yumurtaların boyutunu belirlemek için görüntüyü açın ve Zs yığını görüntüsünü açmak için dilimle seçeneğini belirleyin.

Çizgi seçeneğini ve ölçü panelini seçin ve oositin X Y çapını belirlemek için bir oositin veya işaretleyicinin bir kenarından diğer kenara en geniş noktada bir çizgi çizerek mesafeyi ölçün. Yığın boyunca ilerleyin ve aynı tipteki çoklu oositler için çap aralığını elde edin. Yumurta sayıları için boyut seçim kriteri olarak en kısa uzunluğu kullanın.

Ardından, 3B görünüm seçeneğinde, noktalar özelliğini seçin. Sahne panelinde, algoritma panelini açmak için yeni noktalar ekle işlevini etkinleştirin. Ardından, daha önce elde edilen oosit boyutuyla boyut seçim filtresi olarak tüm algoritma ayarlarının seçimini kaldırın.

Kaynak kanala gitmek için kanal ileri okunu tıklatın. Ardından, tercih edilen işaretleyiciye sahip kanalı seçin ve elde edilen çapı tahmini X, Y çapına yazın. Boyut seçiminden sonra, otomatik olarak belirlenen model PSF uzama ve arka plan çıkarma özelliğini etkinleştirin.

Ardından, filtre noktaları paneline gitmek için tek ileri oku seçin ve bir eşik belirlemek için kalite filtresini ekleyin. Yumurta sayılarının doğru tahmin edilmesini sağlamak için görüntüyü büyütün. Daha sonra, otomatik sayımları tamamlamak için çift oka tıklayın.

Kaçırılan oositleri manuel olarak seçmek veya otomatik eşik tarafından seçilen oosit olmayan parçacıkların seçimini kaldırmak için düzenle sekmesini kullanın. İşiniz bittiğinde, daha fazla analiz için verileri genel sekmesinin altındaki istatistik sekmesine kaydedin. Toplam yumurta sayısını ve hasarlı yumurtalıkları tahmin etmek için, sağlam yumurtalıkların görüntülerini MRS ile açın ve çerçeve özelliğini seçin.

Çerçeve ayarlarının altında, kutu ızgarası onay işaretlerini ve erişim etiketlerini seçin. XYZ konumunda sekme, tüm XYZ konumlarında 200 mikrometre boşluklu onay işaretleri oluşturmak için 200 mikrom seçin. 200 mikrometre onay işaretlerini kullanarak, her yumurtalık hacminin% 50'sine giren yumurtaları seçin.

Lekeler özelliğine tıklayın ve %50 bölgesine giren yumurtaları renge göre sınıflandırmak için düzenleme etiketlerini seçin. Perfüze edilmemiş ve perfüze edilmiş yumurtalıkların temsili gri tonlamalı, çoklu foton görüntülerinde, primordial foliküllerdeki küçük oositlerin ince sitoplazmik DDX4 boyama tabakası ile görülebilir. Ek olarak, büyüyen foliküllerdeki daha büyük oositler tespit edildi.

Prenatal ve postnatal yumurtalıkların çoklu foton görüntülerinden elde edilen 3D render'lar incelendi. Doğum sonrası 28. günde, ışınlanmamış kontrol dişisinden yumurtalık, ilkel foliküllerde büyük miktarda küçük oosit popülasyonu içeriyordu. Buna karşılık, 0.5 gri gama radyasyonu ile ışınlanmış dişiden yumurtalıklar, birincil foliküllerde küçük oositlerden tamamen yoksundu.

Ancak daha büyük oositler hala mevcuttu. Yumurtaların nicelleştirilmesi için MRS yazılımında goucian filtre kullanılarak 3D çoklu foton görüntüleri işlendi ve nokta özelliği kullanılarak küçük ve büyük boyutlu yumurtalar tanımlanarak nicelleştirildi. Daha sonra, oositlerin ortalama yüzdesi, en erken evre E 15.5'te mevcut olan ortalama sayıya kıyasla her aşamada hesaplandı E 15.5 ve E 18.5 arasında keskin bir şekilde azalan oosit sayısı, çoklu foton görüntülerinde görüldüğü gibi bir orf bir P çizgisini ifade etti.

Yoğunluk analizi, E 18.5'te oositler başına bir P çizgisinin E 15.5'ten daha yüksek ekspresyonlarını göstermiştir. Küçük hasarlı yumurtalıklar analiz için kullanılabilir. Toplam yumurta sayıları hesaplamalı düzeltme kullanılarak belirlenir.

Temsili model, E 15.5 yumurtalıkta G CNA pozitif oositleri, sağlam bir yumurtalıkta vurgulanan% beş 10'luk bir bölge ile göstermektedir. Benzer şekilde, yumurtalığın% 50'sine kadar% 10'luk artımlı bölgelerin eksik olduğu simüle edilmiş bir yumurtalık üretildi. Toplam oosit sayıları ve simüle edilen yumurtalıklar orijinal sağlam yumurtalıklarla karşılaştırıldı.

Ve fark, yüzde sapma olarak sunuldu İyi perfüzyon, iyi görüntü kalitesiyle sonuçlanır. Bu nedenle, PFA'ya geçmeden önce tüm dokuların PBS ile temizlendiğinden emin olun. Ekstra dokuyu keserek yumurtalıkların tamamen açığa çıkmasını sağlayın.

Protokol, çok sayıda numunenin verimli bir şekilde analiz edilmesine izin verir, işbirlikçi çapraz veya çeşitlilik çıktısı gibi genetik referans popülasyonlarından elde edilen nicel veriler, oosit gelişiminin ve oosit sayılarının genetik değiştiricilerinin tanımlanmasına yardımcı olacaktır.