Name: Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin Streptomyces venezuelae hücre-dışı transkripsiyon-çeviri sistemini yüksek verimli rekombinant protein sentezi için. Bu yöntem yüksek GC içerikli genlerin heterolog ifadesini kolaylaştırır ve biyosentetik yolakların incelenmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki araştırma desteğini kabul etmek isterler: PSF'li bir PDRA olarak SJM için EPSRC [EP/K038648/1] ; Wellcome Trust, Imperial College London'da PSF ile SJM için ISSF bursu sponsoru oldu; Royal Society araştırma hibesi [RGS\R1\191186]; Kent Üniversitesi'nde SJM için Wellcome Trust SEED ödülü [217528/Z/19/Z]; ve Kent Üniversitesi'nde KC için Global Challenges Araştırma Fonu (GCRF) doktora bursu.

NOT: GYM orta ve agar tabağı ile S30A ve S30B yıkama tamponları tarifleri için Tablo 1 ve Tablo 2'ye bakın.
1. Çözümlerin hazırlanması ve genel rehberlik
<ol><li>Bir istisna belirtilmedikçe, hazırlık sonrası tüm çözeltileri, hücreleri (büyüme sonrası) ve hücre özlerini buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 M Mg-glutamat, 4 M K-glutamat, %40 (w/v) PEG 6000, 1 g/mL polivinilsülfiyonik asit ve diğer tüm stokları -80 °C'de saklayın. Kimyasal bozulmayı önlemek için donma-çözülme döngülerinin sayısını en aza indirin.</li>
	<li>3-PGA (pH ayarı gerektirir) gibi enerji çözeltisi stoklarının hazırlanması için ( bkz. Tablo 3), E. coli TX-TL protokolünde verilen yönergeleri izleyin41. NOT: Tüm bileşenler ddH2O'da tamamen çözünür ve -80 °C dondurucuda aliquots olarak saklanır.</li>
	<li>Bireysel stokları veya enerji çözümlerini (daha sonra açıklanmıştır) buz üzerinde çözün. Amino asitleri, tüm amino asitleri çözünürlükte hale getirmek için ~15-30 dakika boyunca girdap ile 42 °C'de ısıtın.</li>
	<li>Bazı amino asitler (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) buz üzerinde çökelirken, dinlenme süresini en aza indirirken, bu çözeltiyi oda sıcaklığında bırakın ve çözmek için bir girdap kullanın.</li>
	<li>Stok çözeltilerinin ve suyun hesaplanan hacimlerini (Tablo 3) ekleyin ve bir girdap kullanarak iyice karıştırın.</li>
	<li>Enerji çözeltisini tüp başına 20-100 μL aliquots olarak veya istenildiği gibi buz üzerinde aliquotlayın ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. S. venezuelae ATCC 10712 hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>1. Gün-Medya/tampon hazırlama ve gecelik kültür öncesi<ol>
<li>Tablo 1'de açıklandığı gibi, 2 L şaşkın bir şişede 1 L steril GYM sıvı ortamı hazırlayın. Ekipman/kimyasal/reaktif kaynakları için Malzeme Tablosuna bakın.</li>
		<li>Tablo 1'de açıklandığı gibi 250 mL Erlenmeyer şişesinde 1 x 50 mL steril GYM sıvı ortamı hazırlayın.</li>
		<li>100 mL 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 mL 1 M MgCl2 ve 500 mL 4 M NH4Cl çözümleri hazırlaarak 1 L S30A ve 1 L S30B yıkama tamponları yapın. Tarifler için Tablo 2'ye bakın.</li>
		<li>Gecelik kültür öncesi hazırlayın. Steril 50 mL GYM sıvı ortamını 250 mL Erlenmeyer şişesinde 30 dakika boyunca 28 °C'ye önceden ısıtın.</li>
		<li>Tek bir S. venezuelae ATCC 10712 kolonisini (veya ilgili suşu) bir GYM agar plakasından önceden ısıtılmış 50 mL GYM sıvı ortamına aşılayın ve 28 °C'de kuluçkaya yatın, 16 saat boyunca 200 rpm (bir gecelik kültür öncesi).</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün-Gündüz kültür öncesi ve ana büyüme kültürünü hazırlayın.<ol>
<li>28 °C'de 250 mL Erlenmeyer şişesinde 30 dakika boyunca önceden ısıtın 50 mL steril GYM sıvı ortamı.</li>
		<li>1 mL gecelik ön kültürü önceden ısıtılmış 50 mL GYM sıvı ortamına aktarın ve 28 °C'de kuluçkaya yatırın, 8 saat boyunca 200 rpm (gündüz kültür öncesi).</li>
		<li>Bu büyüme döneminden sonra, OD600'ü 1 mL (1 cm yol uzunluğu) plastik bir cuvette steril GYM ortamı ile 1:10 seyreltme kullanarak bir spektrofotometrede kontrol edin. NOT: OD600 en az 3-4'e ulaşmış olmalıdır. Zayıf büyüme varsa, 2.2.1-2.2.2 adımlarının tekrarlanması önerilir.</li>
		<li>Alt kültür 0.25 mL gündüz kültür 2 L şaşkın şişeler halinde 1 L sıvı GYM ortamı içine.</li>
		<li>28 °C'de bir gecede çalkalayın, 14 saat boyunca 200 rpm.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün-Hasat hücreleri<ol>
<li>Önceki kuluçka döneminden (14 saat) sonra, ana kültürün OD600'lerini kaydedin. OD600 ölçümü için geceleme kültürünü 1:10 taze GYM ortamı ile seyreltin. NOT: OD600 bu aşamada 3.0-4.0'a ulaşmış olmalıdır.</li>
		<li>OD600<3.0 ise, sarsıntı hızını 250-300 rpm'ye çıkarın ve 3.0'ın OD600'üne ulaşılana kadar büyüyün. Ek 2 saatten (toplamda 16 saat) daha uzun süre büyümeyin.</li>
		<li>OD600>3.0 ise, kültürleri santrifüj kaplarına aktarın ve ıslak buzda 30 dakika boyunca hızla soğutun.</li>
		<li>Hücre kültürünün buz üzerinde soğumasını beklerken, Tablo 1'de açıklandığı gibi 4 mL taze 1 M dithiothreitol (DTT), S30A ve S30B tamponları hazırlayın ve buzda tutun. Kimyasal/reaktif kaynağı için Malzeme Tablosuna bakın.</li>
		<li>Boş bir 50 mL santrifüj tüpünü önceden tartın ve -20 °C'de önceden soğutun.</li>
		<li>Buz üzerine 1 L S30A tampona 2 mL 1 M DTT ekleyin ve iyice karıştırın. NOT: S30A ve S30B yıkama tamponlarına yalnızca kullanmadan önce DTT ekleyin.</li>
		<li>6.000 × g, 4 °C, 10 dk'lık hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı hızlı ve tek bir hareketle dikkatlice atın. NOT: Pelet bozulursa, artık GYM ortamı ile hücre tutulmasını en üst düzeye çıkarın ve protokole devam edin.</li>
		<li>500 mL S30A tampon ekleyin ve hücre kümeleri homojen bir şekilde dağılana kadar santrifüj şişelerini kuvvetlice sallayarak hücreleri yeniden biriktirin.</li>
		<li>Hücreleri 6.000 × g, 4 °C, 6 dk'da santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın. NOT: Hücre peleli bu noktada daha sıkı olsa da, bazı hücreler süspansiyonda kalacaktır (bkz. Şekil 1). 2.3.7'de açıklandığı gibi davranin ve mümkün olduğunca çok hücre tutun.</li>
		<li>2.3.8-2.3.9 adımlarını yineleyin.</li>
		<li>Buz üzerine 1 L S30B tampona 2 mL 1 M DTT ekleyin ve iyice karıştırın. Hücrelere 500 mL S30B arabellek ekleyin. 2.3.9.</li>
		<li>Hücre peletini 10 mL S30B tamponda yeniden çıkarın ve önceden tartılmış, önceden soğutulmuş 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Gerekirse, artık hücreleri ek 5-10 mL S30B tampon ile aktarın. S30B ile 50 mL'ye doldurun.</li>
		<li>Hücreleri 6.000 × g, 4 °C, 10 dk'da santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın.</li>
		<li>2.3.13.</li>
		<li>Kalan S30B süpernatantı 100-200 μL pipetle dikkatlice aspire edin.</li>
		<li>Islak hücre peletini tartın. NOT: Gece spor salonu kültürünün 1 L'si için tipik ıslak hücre pelet ağırlığı (OD600 = 3.0) ~4,5 g'dır.</li>
		<li>Her 1 g ıslak hücre için 0,9 mL S30B tampon ekleyin. Pasteur pipet veya girdap kullanarak hücreleri yeniden depolar.</li>
		<li>Hücreleri yatıştırmak için 500 × g'a kadar kısaca (~10 s) santrifüj. NOT: Protokol bu noktada duraklatılabilir ve hücreler sıvı azot veya kuru buz üzerinde dondurulabilir ve -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Ham hücre özü elde etmek için sonication tarafından hücre liziz
NOT: Bu aşamada, kullanıcı hücreleri 1 mL fraksiyonlarda (seçenek 1) veya 50 mL tüpte (seçenek 2) daha büyük bir hücre süspansiyonu (5 mL) olarak sonication ile bozmayı seçebilir. Hücre süspansiyonunun son hacmi önceki hasat ve yıkama adımları sırasında hücre kaybı nedeniyle değişebileceğinden, tekrarlanabilirliği sağlamak için her iki seçenek de aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir. Yeni bir kullanıcı, protokolü oluşturmak için önce 2.1 seçeneğini denemelidir.
<ol><li>1 mL kesirlerde sonicating ile Hücre Lizisi<ol>
<li>1 mL pipet ucu kullanarak (delik boyutunu artırmak için ucun ucunu kesin), hücre süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. NOT: Hücreler donmuşsa, peletin içeren 50 mL'lik tüpü hücre lizizden önce ılık suda hızla çözün. Pelet çözülmeye başlar başlamaz tüpü ıslak buza aktarın ve 10 dakika soğutun.</li>
		<li>Her mikrosantrifüj tüpünü, sonication için tüpü tutmak için plastik bir tüp rafı kullanarak bir buzlu su kabına yerleştirin. NOT: Hücre ekstresinin aşırı ısınmaya duyarlılığı nedeniyle, protein çökelmesini ve enzymatik aktivitenin azalmasını önlemek için tüplerin ısınmamasını sağlamak önemlidir.</li>
		<li>3 mm çapında uçlu bir sonicator probu kullanın ve % 70 (v/v) etanol ve çift damıtılmış su (ddH2O) ile temizleyin. Sonicator ucunu sıvı yüzeyin ~1 cm altına inene kadar hücre süspansiyonuna üfleyin.</li>
		<li>Sonicator içine aşağıdaki ayarları girin: 20 kHz frekans, 65% genlik, 10 s nabız ZAMANıNDA, 10 s darbeLER KAPSADI süre, 1 dakika toplam sonikasyon süresi.</li>
		<li>Sonication protokolünü çalıştır. Hücrelerin eşit şekilde sonik olduğundan emin olmak için ilk iki dinlenme döngüsü sırasında tüpü yukarı / aşağı ve yana doğru hareket ettirin. Enerji girişini kaydet. NOT: Güvenlik için sonikasyon sırasında uygun işitme koruması takın. Hücreler bozuldukça viskozite azalacak ve soluk krem ıslak hücre pelezi homojen kahverengi bir sıvıya dönüşmelidir. Önerilen enerji girişi ıslak hücrelerin mL başına 240 J'dir. Hücreler sadece kısmen lizlenmişse, süspansiyon, özellikle tüpün yanlarında viskoz hücre kümeleriyle krem renginde görünecektir.</li>
		<li>Tüpü 2-3 kez ters çevirin ve sonication'ı bir veya iki 10 s döngü için tekrarlayın, hücreler tamamen bozulana kadar sık sık karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 mL hücre süspansiyonu sonicating tarafından Hücre Liziz<ol>
<li>Hücreler donmuşsa, peletı içeren 50 mL'lik tüpü hücre lizizden önce sallanarak ılık suda hızla çözün. Pelet çözülmeye başlar başlamaz tüpü ıslak buza aktarın ve 10 dakika soğutun.</li>
		<li>Hücreleri tortulamak için tüpü kısaca 500 x g'da döndürün.</li>
		<li>Sonication için 50 mL tüp buzlu su bir beher yerleştirin. NOT: Hücre ekstresinin aşırı ısınmaya duyarlılığı nedeniyle, protein çökelmesini ve enzymatik aktivitenin azalmasını önlemek için tüplerin ısınmamasını sağlamak önemlidir.</li>
		<li>6 mm çapında uçlu bir sonicator probu kullanın ve % 70 (v/v) etanol ve ddH2O ile temizleyin ( Şekil 1'deki 6 mm probun görsel şemasına bakın). Sonicator ucunu sıvı yüzeyin ~1 cm altına inene kadar hücre süspansiyonuna (~5 mL) üfleyin.</li>
		<li>Sonicator içine aşağıdaki ayarları girin: 20 kHz frekans, 65% genlik, 10 s nabız ZAMANıNDA, 10 s darbeler KAPSAdan zaman, ıslak hücrelerin mL başına 1 dakika toplam sonikasyon süresi (toplamda 5 dk).</li>
		<li>Sonication protokolünü çalıştır. Hücrelerin eşit şekilde sonik olduğundan emin olmak için ilk iki dinlenme döngüsü sırasında tüpü yukarı / aşağı ve yana doğru hareket ettirin. NOT: Güvenlik için sonikasyon sırasında uygun işitme koruması takın. Hücreler bozuldukça viskozite azalacak ve soluk krem ıslak hücre pelezi homojen kahverengi bir sıvıya dönüşmelidir. Enerji girişini kaydet. Islak hücrelerin mL başına 240 J'lik optimum enerji girişi (~5 dk sonikasyondan toplam 1200 J) önerilir.</li>
		<li>Bazı hücreler bozulmadan kalırsa, 3.1.5 adımındaki yönergeleri izleyin.</li>
		<li>Hücre özlerini 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hücre özü açıklaması ve çalıştırma reaksiyonu
<ol><li>Hücre kalıntılarını gidermek için 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 × g'da lisli hücreleri santrifüj edin. Süpernatantı 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine 1 mL aliquots olarak aktarın.</li>
	<li>Hücre özleri için çalıştırma reaksiyonunu gerçekleştirin. Hücre özlerini içeren 1,5 mL'lik tüpleri 30 °C'de bir ısı bloğunda veya inkübatörde 60 dakika boyunca titremeden kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Hücre özlerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüj edin. Süpernatantları 15 mL santrifüj tüpüne bire bir edin. Tüpü homojen olana kadar beş kez ters çevirerek süpernatant karıştırın, sonra buzda tutun. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için yavaşça ters çevirin.</li>
	<li>Hücre ekstresinin 10 μL'sini S30B tamponu ile 100 kat seyreltin ve üç teknik tekrarla bir Bradford tahlilini kullanarak toplam protein konsantrasyonunu ölçün (Bradford tahlil kılavuzu için Ek Malzeme S2'ye bakın).</li>
	<li>Protein konsantrasyonu 20-25 mg/mL ise, hücre özlerini 100 μL aliquots olarak yeni 1,5 mL tüplere aktarın, sıvı nitrojende flaş dondurun ve -80 °C'de saklayın. NOT: Güvenlik için, yüz siperleri ve eldivenler de dahil olmak üzere sıvı nitrojen kullanırken uygun KKD giyin.</li>
	<li>Protein konsantrasyonu <20 mg/mL ise, yüksek kaliteli hücre özü ve TX-TL verimlerinin daha önce yayınlanan çalışmayla karşılaştırılabilir olmasını sağlamak için ham ekstrakt hazırlama adımlarını tekrarlayın5.</li>
</ol>5. Plazmid DNA şablonunun hazırlanması
<ol><li>pTU1-A-SP44-mScarlet-I plazmidini (pUC19 kökenli) üreticinin talimatlarına uygun bir plazmid DNA arıtma kiti kullanarak 50 mL LB kültüründe (100 mg/mL karbenisilin ile) yetişen yeni dönüştürülmüş bir E. coli plazmid suşundan (DH10β, JM109) arındırın.</li>
	<li>Plazmidi 2 x 300 μL çekirdeksiz suda boşaltın ve fraksiyonları birleştirin.</li>
	<li>3 M sodyum asetat (pH 5.2) 0,1 birim (66 μL) ekleyin.</li>
	<li>0,7 hacim (462 μL) izopropanol ekleyin.</li>
	<li>DNA'yı 30 dakika boyunca -20 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>4 °C'de 30 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüj ve süpernatantı atın.</li>
	<li>DNA peletine %70 (v/v) etanolden oluşan 2 mL ekleyin.</li>
	<li>Plazmid DNA peletini yeniden çıkarmak için tüpü 3-4 kez ters çevirin.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 16.000 × g'da santrifüj ve süpernatantı atın.</li>
	<li>5.7-5.9 adımlarını tekrarlayın ve görünür tüm sıvıyı çıkarın.</li>
	<li>DNA peletini 10-30 dakika havayla kurulayın veya vakumlu santrifüjle 5 dakika kurutun.</li>
	<li>Kurutulmuş peletin 600 μL çekirdeksiz ddH2O ile yeniden ıslatır.</li>
	<li>Spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ve saflığını ölçün.</li>
	<li>50-100 μL aliquots hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. NOT: Hücresiz reaksiyonların dar hacim kısıtlamaları nedeniyle 500-1000 ng/μL aralığında yüksek DNA konsantrasyonu önerilir. Plazmid DNA stoğunu 80 nM'ye seyreltin; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I plazmid 80 nM'ye eşdeğerdir. </li>
</ol>6. Streptomices Master Mix (SMM) çözeltisinin hazırlanması
<ol><li>Amino asit çözeltisi<ol>
<li>Üreticinin çevrimiçi olarak verdiği talimatları izleyerek manuel hataları önlemek ve hazırlık süresini azaltmak için amino asit örnekleyici kitini kullanın.</li>
		<li>DdH2O kullanarak 20x amino asit stok çözeltisini 6 mM (5 mM L-Leu) nihai konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>2,4x SMM çözeltisi içinde 2,4 mM 'ye (2 mM L-Leu) kadar daha fazla seyreltin (bkz. Tablo 3). NOT: TX-TL reaksiyonunda son konsantrasyon 1 mM 19x amino asitler ve 0.83 mM L-Leu'dur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enerji çözeltisi ve katkı maddeleri<ol>
<li>Tablo 3'te açıklanan tarifi izleyerek 2,4x SMM çözeltislerindeki diğer bileşenleri hazırlayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, Tablo 3'te açıklanan tarifi izleyerek 2,4x Minimal Enerji Çözeltisi (MES) hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Standart bir S. venezuela tx-TL reaksiyon ayarlama
<ol><li>Hücre ekstresini, SMM (veya MES) çözeltisini ve plazmid DNA'sını buz üzerinde çözün. -20 °C'de 384 kuyulu bir plakayı önceden soğutun.</li>
	<li>Hacmin %25'inin plazmid DNA, %33,33'ünün hücre özü ve %41,67'sinin SMM çözümü olduğu yerlerde TX-TL reaksiyonları ayarlayın; başlangıç zamanı önyargısını önlemek için onları buzda tutun. NOT: Reaksiyon sayısına göre ihtiyaç duyulan reaktiflerin hacmini hesaplamak için standart bir TX-TL şablonu sağlanmıştır (Tablo 4). 33 μL reaksiyon için standart hacim aşağıdaki gibidir: 11 μL hücre özü, 13,75 μL SMM ve 8,25 μL plazmid DNA.</li>
	<li>Çözeltinin homojen olduğundan emin olmak için karışımı düşük hızlı bir ayarda ~5 sn için hafifçe girdaplayın. Köpürme/kabarcık oluşumundan kaçının.</li>
	<li>10 μL aliquots'u hava kabarcıkları tanıtmadan teknik bir triplicate olarak 384 kuyu plakasının üç kuyusuna aktarın. Plakayı şeffaf bir kapakla kapatın ve 5 sn için 400 × g'da döndürün.</li>
	<li>Reaksiyonun 28 °C'de bir inkübatörde (bitiş noktası okumaları için) veya bir plaka okuyucuda titremeden kuluçkaya ya da inkübatörde kuluçkaya ya da bir plaka okuyucuda kuluçkaya yatırın. NOT: Reaksiyonların tamamlanması için genellikle 3-4 saat gerekir. Plaka okuyucu ve mScarlet-I standart ölçümleri hakkında rehberlik için Ek Malzeme S2'ye bakın.</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda, TX-TL sistemlerinin hem deneyimli hem de yeni kullanıcıları için yürütülmesi kolay ayrıntılı adımlarla yüksek verimli bir S. venezuelae TX-TL protokolü açıklanmıştır. Mevcut Streptomyces45 ve E. coli TX-TL41 protokollerinden çeşitli özellikler, S. venezuelae TX-TL5,26 için minimal, ancak yüksek verimli bir protokol oluşturmak için kaldırılmıştır. Burada önerilen iş akış...

Hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sistemleri, sentetik biyoloji için kavramsal mühendislik çerçevesi olan hızlı tasarım-yap-test-öğrenme döngülerini uygulamak için sentetik biyoloji için ideal bir prototipleme platformu sağlar1. Buna ek olarak, açık reaksiyon ortamında yüksek değerli rekombinant protein üretimi için TX-TL sistemlerine olan ilgi artmaktadır2, örneğin, antikor-ilaç konjugelerine standart dışı amino asitleri dahil etmek3. Özellikle, TX-TL bir hücre özü, plazmid veya doğrusal DNA ve protein sentezini toplu veya yarı iletken reaksiyonlarda katalize etmek için bir enerji çözeltisi gerektirir. Escherichia coli TX-TL baskın hücresiz sistem olmakla birlikte, farklı uygulamalar için bir dizi gelişmekte olan modelsiz TX-TL sistemi dikkat çekmiştir4,5,6,7,8. TX-TL'nin temel avantajları arasında esnek ölçeklenebilirlik (nanoliterden litreye kadar ölçek)9,10, güçlü tekrarlanabilirlik ve otomatik iş akışları8,11,12 sayılabilir. Özellikle, TX-TL'nin otomasyonu genetik parçaların ve düzenleyici unsurların hızlandırılmış karakterizasyonuna izin vermektedir8,12,13.
Reaksiyon kurulumu açısından, TX-TL hem birincil hem de ikincil enerji kaynaklarının yanı sıra amino asitler, kofaktörler, katkı maddeleri ve şablon DNA dizisi gerektirir. Nükleotid trifosfatlar (NTP'ler), ilk mRNA (ATP, GTP, CTP ve UTP) ve protein sentezini (yalnızca ATP ve GTP) yönlendirmek için birincil enerji kaynağını sağlar. TX-TL verimini artırmak için NTP'ler maltose14, maltodekstrin15, glikoz14, 3 fosfolycerat (3-PGA)16, fosforilolpyruvate17 ve L-glutamat18 gibi ikincil bir enerji kaynağının katabolizması yoluyla yenilenir. Bu doğal metabolik aktivite şaşırtıcı derecede çok yönlüdür, ancak özellikle gelişmekte olan TX-TL sistemlerinde kötü çalışılmıştır. Her enerji kaynağının ATP verimi, kimyasal stabilite ve maliyet açısından farklı özellikleri ve avantajları vardır, bu da ölçeklenmiş TX-TL reaksiyonları için önemli bir husustur. Şimdiye kadar, E. coli TX-TL için mevcut protokoller, ikincil enerji kaynağı olarak 3-PGA (30 mM), maltodekstrin (60 mM) ve D-riboz (30 mM) karışımı kullanılarak, model yeşil floresan protein (GFP) için 4,0 mg/mL'ye (~157 μM) kadar ulaşmıştır19.
Son zamanlarda TX-TL sistemlerinde sekonder metabolit biyosintetik yolların incelenmesine olan ilgi artmaktadır20,21,22. Özellikle, Actinobacteria antibiyotikler ve tarımsal kimyasallar da dahil olmak üzere ikincil metabolitlerin önemli bir kaynağıdır23,24. Genomları, ikincil metabolit biyosentezi için enzimatik yolları kodlayan biyosentetik gen kümeleri (BGC' ler) ile zenginleştirilmiştir. Actinobacteria genetik parçaları ve biyosintetik yolların incelenmesi için yakın zamanda streptomices bazlı bir dizi TX-TL sistemi geliştirilmiştir5,6,25,26. Bu özel Streptomyces TX-TL sistemleri aşağıdaki nedenlerden dolayı potansiyel olarak faydalıdır: [1] Streptomyces spp.26 enzimleri için yerel bir protein katlama ortamının sağlanması; [2] yüksek G+C (%) gen ekspresyörü için en uygun tRNA havuzuna erişim; [3] biyosintetik öncüllerin temini için potansiyel olarak kaçırılabilen aktif birincil metabolizma; ve [4] yerel hücre özünde bulunan ikincil metabolizmadan enzimlerin, öncüllerin veya kofaktörlerin sağlanması. Bu nedenle, bu benzersiz yetenekleri kullanmak için son zamanlarda yüksek verimli bir S.venezuelae TX-TL araç seti kuruldu5.
Streptomyces venezuelae, endüstriyel biyoteknolojide zengin bir geçmişe sahip sentetik biyoloji için 5,27,28,29 ve Actinobacteria30,31,32'de hücre bölünmesi ve genetik düzenlemeyi incelemek için bir model sistemi olarak ortaya çıkan bir konaktır. Ana tip suş olan S. venezuelae ATCC 10712, 7377 kodlama dizisi, 21 rRNA, 67 tRNA ve 30 biyosinatik gen kümesini kodlayan % 72,5 G+C içeriği (%) (Katılım numarası: CP029197) ile 8,22 Mb'lık nispeten büyük bir genoma sahiptir. Sentetik biyolojide, S. venezuelae ATCC 10712 biyosentetik yolların heterolog ifadesi için çekici bir şasidir. Diğer Streptomices lekelerinin aksine, hızlı bir iki katına (~40 dk), geniş bir genetik ve deneysel araç yelpazesi5,28, misel topaklanma eksikliği ve sıvı ortamda sporülasyon dahil olmak üzere çeşitli önemli avantajlar sağlar28,33. Çeşitli çalışmalar ayrıca poliketitler, ribozomal ve nonribosomal peptitler34,35,36,37,38 dahil olmak üzere çeşitli ikincil metabolitlerin heterolog üretimi için S. venezuelae'nin kullanıldığını göstermiştir. Bu kombine özellikler, bu suşunu sentetik biyoloji ve metabolik mühendislik uygulamaları için çekici bir mikrobiyal konak haline getirir. S. venezuelae heterolog gen ekspresyolu için baskın Streptomices modeli olmasa da, daha fazla gelişme ile, doğal ürün keşfi içinde daha geniş kullanım için hazırlanır.
Bu makale, daha önce yayınlanan ilk protokol26'dan güncellenen yüksek verimli bir S. venezuelae TX-TL sistemi için ayrıntılı bir protokol (Şekil 1) s sunulmuştur. Bu çalışmada, enerji çözeltisi ve reaksiyon koşulları, standart bir plazmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I kullanılarak, 4 saat, 10 μL parti reaksiyonunda mScarlet-I muhabir proteini için protein verimini 260 μg / mL'ye kadar artıracak şekilde optimize edilmiştir. Bu plazmid, protein ekspresyonunun çeşitli yöntemlerini tespit etmek için özel olarak tasarlanmıştır. Protokol ayrıca düzene sokılırken, enerji sistemi verimden ödün vermeden hücresiz reaksiyonların kurulmasının karmaşıklığını ve maliyetini azaltmak için optimize edilmiştir. Optimize edilmiş TX-TL sistemi ile birlikte, gen ekspresyonunun ince ayar için ve TX-TL'yi gerçek zamanlı olarak izlemek için floresan araçlar olarak bir genetik parça kütüphanesi geliştirilmiştir, böylece Streptomyces spp. ve ilgili Actinobacteria'dan gen ekspresyonunu ve doğal ürün biyosentetik yollarını prototiplendirmek için çok yönlü bir platform oluşturulmuştur.
Bu çalışmada, önerilen standart plazmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), yeni bir laboratuvarda S. venezuelae TX-TL iş akışını kurmak için kullanılabilir ve AddGene'de mevcuttur (bkz. Ek Tablo S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I, kullanıcıya diğer açık okuma çerçevelerini (ORF' ler) inceleme esnekliği sağlar. mScarlet-I ORF, S. venezuelae gen ekspresyon için kodon için optimize edilmiştir. SP44 promotörü, hem E. coli hem de Streptomyces spp.39'da oldukça aktif olan güçlü bir kurucu organizatördür. Plazmid, yeni ORF'lerin ortak bir C terminali FLAG-tag ve floresan arsenik saç tokası (FlAsH) bağlayıcı etiket sistemi ile çerçevede alt klonlamasına izin vermek için iki benzersiz kısıtlama enzim bölgesine (NdeI, BamHI) sahiptir. Alternatif olarak, her iki etiket de yeni bir geni alt klonladıktan sonra bir stop codon dahil edilerek kaldırılabilir. Bu baz vektör ile, bir dizi proteinin yüksek verimli ekspresyumu gösterilmiştir, yani oksitetrasiklin biyosentez yolundan proteinler ve Streptomyces rimosus'tan karakteristik olmayan bir nonribosomal peptit sentezi (NRPS). mRNA algılama açısından, pTU1-A-SP44-mScarlet-I standart plazmid, 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) probu ile tespit için bir dBroccoli aptamer (3'-çevrilmemiş bölgede) içerir. Daha fazla esneklik için, EcoFlex40 uyumlu MoClo parçalarından oluşan bir araç seti de AddGene'de kullanıma sunulmuştur, EcoFlex uyumlu Streptomyces mekik vektörü (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ve süper klasör yeşil floresan proteinini (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I ve β-glucuronidaz (GUS). Özellikle, pSF1C-A plazmid pAV-gapdh28'den türetilmiştir ve MoClo montajı için BsaI / BsmBI sitelerinden iyileştirilmiştir. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP, EcoFlex40'tan pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP'ye eşdeğerdir, ancak Streptomyces spp'de konjugasyon ve kromozomal entegrasyon için ek işlevsellik içerir. phiC31 integrase sistemini kullanarak28.
Protokolün ilk aşaması , S. venezuelae ATCC 10712'nin büyümesini veya yakından ilişkili bir suş, orta üstel fazda hücre hasadı, hücre yıkama adımları ve S30A ve S30B tamponlarında dengeyi içerir. Bu aşama üç gün gerektirir ve hücre büyümesi için zaman, aşağıda açıklandığı gibi kalan bileşenleri hazırlamak için kullanılabilir. Hasat edilen hücreler daha sonra sonication tarafından lislenir, netleştirilir ve bir çalıştırma reaksiyonuna tabi edilir. Hazırlığın bu son aşamasında, hücre özleri aktivite kaybını en aza indirmek için -80 ° C'de uzun süreli depolama için hazırlanabilir. Bu protokolü kullanarak TX-TL reaksiyonlarının montajı için, karşılaştırılabilir verim veren Minimal Enerji Çözümü formatı (MES) seçeneğine sahip bir Streptomices Master Mix (SMM) sunulmaktadır. Ayrıca, bir -80 °C gliserol stoğundan bir GYM agar plakasına S. venezuelae ATCC 10712'nin taze bir kültürünün çizİlmesi ve tek koloniler görünene kadar en az 48-72 saat boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatmanız önerilir. Aşağıdaki adımlar için yalnızca taze kültürler kullanılmalıdır.

<table><tbody><tr><td>2,5 L UltraYield Şişe</td><td>Thomson</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA (%>93)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 Kuyu Siyah/Şeffaf Alt Plaka</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür (%98)</td><td>Fluorochem</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM çözelti, %>99)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin)</td><td>Melford</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glikoz (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin)</td><td>Melford</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI (&ge; %98 - HPLC)</td><td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DTT (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT2 (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz-6-fosfat (%>98)</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Serbest Asit (saflık için tedarikçiyle iletişime geçin)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamik asit hemimagnezyum tuzu tetrahidrat (%>98)</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (%98)</td><td>Florohem</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td>Malt özü</td><td>Sigma</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma</td><td>807491</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 96 kuyulu Mikrodiyaliz Plakası, 10K MWCO</td><td>ThermoFisher</td><td>88260</td><td></td></tr><tr><td>Poli(vinil sülfat) potasyum tuzu</td><td>Sigma</td><td>271969</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum glutamat (%>99)</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>RTS amino asit örnekleyici</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (%99)</td><td>Fluorochem</td><td>94554</td><td></td></tr><tr><td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE kolonu (1 g)</td><td>Sigma</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Melford</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Ekipman< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plaka Okuyucu</td><td>BMG</td><td>Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

sentetik biyoloji ve doğal Ürün uygulamaları için yüksek verimli streptomices transkripsiyon-Çeviri araç seti

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomices spp. klinik antibiyotiklerin ve endüstriyel kimyasalların önemli bir kaynağıdır. Streptomices venezuelae ATCC 10712, hızlı büyüyen bir suş ve doğal bir kloramfenikol, jadomycin ve pikromisin üreticisidir, bu da onu yeni nesil sentetik biyoloji şasisi olarak çekici bir aday haline getirir. Bu nedenle, S. venezuelae ATCC 10712'nin ve diğer Streptomyces spp. modellerinin gelişimini hızlandıran genetik araçlar, doğal ürün mühendisliği ve keşfi için son derece arzu edilir. Bu amaçla, yüksek G+C (%) genlerinin yüksek verimli heterolog ekspresyonlarını sağlamak için bu protokolde özel bir S. venezuelae ATCC 10712 hücresiz sistem sağlanmıştır. Bu protokol, 96 kuyu veya 384 kuyu plaka biçimindeki küçük ölçekli (10-100 μL) parti reaksiyonları için uygundur, reaksiyonlar ise potansiyel olarak ölçeklenebilir. Hücresiz sistem sağlamdır ve minimum kurulumda bir dizi rekombinant protein için yüksek verim (~5-10 μ M) elde edebilir. Bu çalışma ayrıca mRNA ve protein sentezinin gerçek zamanlı ölçümü ve etiketli proteinlerin jel içi floresan boyanma için geniş bir plazmid araç seti içerir. Bu protokol ayrıca yüksek verimli gen ekspresyon karakterizasyon iş akışları veya Actinomycetes genomlarında bulunan yüksek G+C (%) genlerinden enzim yollarının incelenmesi ile entegre edilebilir.

Bu ayrıntılı protokol, kullanıcının S. venezuelae ATCC 10712 model suşuna dayalı bir Streptomyces TX-TL sistemi kurmasına yardımcı olmak için bir örnek olarak sağlanmıştır (Şekil 1). Kullanıcı diğer Streptomices suşlarını incelemeye çalışabilir; bununla birlikte, daha uzun iki katına çıkış süreleri veya farklı büyüme tercihleri ile diğer suşların büyüme/hasat aşamalarının en yüksek sonuçları elde etmek için özel olarak optimize edilmesi gerekecektir. Temsili sonuç ...

Bu protokol, Streptomyces venezuelae hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sisteminden yüksek rekombinant protein verimini sentezlemek için geliştirilmiş bir yöntemi detaylandırmamaktadır.

Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Protokolümüz Streptomyces venezuelae hücresiz transkripsiyon-çeviri için basitleştirilmiş bir iş akışı sağlar. Sistemimiz bu model olmayan organizmadan metabolik enzimleri ve yolları kullanıyor. Başlıca avantajları, yüksek GC içeriğine sahip genlerin heterolog ifadesi, uygun bir protein iletme ortamının sağlanması ve biyosintetik yolların ince ayar için açık bir sistemdir.Yöntemimiz Streptomices ve ilgili yüksek GC bakterilerini incelemek için yeni fırsatlar açacaktır. Bu bakterilerdeki enzimlerin ve gen ekspresyonlarının incelenmesini sağlar. Bu teknik, yeni kullanıcılar tarafından uygulama kolaylığı için geliştirilmiştir.Önceden deneyim veya aşinalık gerektiren tek adım, son derece aktif ham özler üretmek için sonication'dır. Önceden kültürlenmiş hücreleri üçüncü günde toplamaya başlamak için, geceleme kültürünü 600 nanometrede optik yoğunluk veya OD ölçümü için taze bir GYN ortamı ile bire 10 oranında seyreltin. 600 nanometredeki kültürün OD'si 0,3'ten azsa, sarsıntı hızını dakikada 250 ila 300 döndürmeye çıkarın ve bir OD 0,3'e ulaşana kadar büyüyün.İki saatten fazla büyümeyin. OD 0,3'ten büyükse, kültürleri santrifüj kaplarına aktarın ve ıslak buzda 30 dakika boyunca hızla soğutun. Hücre kültürünün soğumasını beklerken, dört mililitre taze bir molar dithiothreitol, S30A ve S30B tamponları hazırlayın ve buzda tutun.Boş bir 50 mililitre santrifüj tüpü tarttıktan sonra, eksi 20 santigrat derecede önceden soğutun. Buz üzerinde bir litre S30A tampona iki mililitre bir azı dişi dithiothreitol ekleyin ve iyice karıştırın. Hücreleri 6.000 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin.Süpernatantı hızlı bir hareketle attıktan sonra, 250 mililitre S30A tamponu ekleyin ve hücre kümeleri homojen bir şekilde dağılana kadar santrifüj şişelerini kuvvetlice sallayarak hücreleri yeniden biriktirin. Sonra hücreleri altı dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve S30A tamponunun eklenmesini ve ardından gösterildiği gibi santrifüjlenmeyi tekrarlayın.Ardından, buz üzerinde bir litre S30B tampona iki mililitre bir molar DTT ekleyin ve iyice karıştırın. Hücrelere 250 mililitre S30B tampon ekleyin ve santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın. Hücre peletini 10 mililitre S30B tampona yeniden aktarın ve hücre süspansiyonu önceden soğutulmuş 50 mililitre santrifüj tüpüne aktarın.Gerekirse, artık hücreleri beş ila 10 mililitre S30B tampon ile aktarın ve tüpü S30B ile 50 mililitre hacme doldurun. Hücreleri 10 dakika santrifüjleyin. Üstnatantı atın ve santrifüjü önceki ayarlarda gösterildiği gibi tekrarlayın.Süpernatantı attıktan sonra, kalan S30B süpernatantı 100 ila 200 mikroliter pipetle aspire edin ve ıslak hücre peletini tartın. Her bir gram ıslak hücre için 0,9 mililitre S30B tampon ekleyin. Pasteur pipet veya girdap kullanarak hücreleri yeniden depolar.Hücreleri yatıştırmak için 500 G'ye kadar yaklaşık 10 saniye boyunca kısa bir süre santrifüjlayın. Uç sıvı yüzeyin yaklaşık bir santimetre altına gelene kadar sonicator ucunu hücre süspansiyonuna üfleyin. Sonicator ayarlarına farklı parametreler girin.Frekansı 20 kilohertz'e, genliği %65 darbeye ve kapalı zamanı 10 saniyeye ve toplam sonikasyon süresini bir dakikaya ayarlayın. Sonication başlayın ve hücrelerin eşit sonicated emin olmak için ilk iki dinlenme döngüsü sırasında tüpü yukarı veya aşağı ve yan hareket ettirin. Hücreler tam olarak lizlenmiş değilse, tüpü iki ila üç kez ters çevirin ve hücreler tamamen bozulana kadar sık karıştırma ile bir veya iki 10 saniyelik ek döngüler için sonication'ı tekrarlayın.Hücre kalıntılarını gidermek için lislenmiş hücreleri santrifüj edin, ardından süpernatantı bir mililitre aliquot olarak 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücre özlerinin ikinci dereceden reaksiyonları için, hücre ekstresini içeren hücreyi 30 santigrat derecede bir ısı bloğunda veya bir çalkalayıcı olmadan inkübatörde 60 dakika kuluçkaya bırakın. Transkripsiyon-çeviri reaksiyon için, hücre özü SMM veya MES çözeltisini çözün ve DNA'yı buz üzerinde plazmid.Eksi 20 santigrat derecede 384 kuyu plakasının soğutulduğu ön soğutma. Hacmin %25'inin plazmid DNA, %33,33'ünün hücre özü ve %41,67'sinin SMM çözümü olduğu buzda transkripsiyon-çeviri reaksiyonunu ayarlayın. Köpürmeyi veya kabarcık oluşumunu önlerken çözeltinin homojen olmasını sağlamak için karışımı düşük hızlı bir ayarda yaklaşık beş saniye boyunca hafifçe girdaplayın.10 mikrolitrelik üç aliquot'u, hava kabarcıkları tanıtmadan teknik bir triplicate olarak 384 kuyu plakasının üç kuyusuna aktarın. Plakayı şeffaf bir kapakla kapattıktan sonra, plakayı beş saniye boyunca 400 kez G'de döndürün ve reaksiyonun 28 santigrat derecede bir inkübatörde veya bir plaka okuyucusunda titremeden kuluçkaya yatırın. Streptomices venezuelae hücresiz transkripsiyon-çevirisi, pTU1-A-SP44 standart plazmidinden floresan proteinlerin yanı sıra jel elektroforezi ile tespit edilen biyosentetik enzimlerin yüksek verimli ekspresyonu için optimize edilmiştir.pTU1-A-SP44-mScarlet-I standart plazmidinin ekspresy ifadesi çeşitli yöntemler kullanılarak ölçüldü. dBroccoli RNA aptamer kullanılarak mRNA'nın gerçek zamanlı floresan ölçümleri, FlAsH etiket sistemi kullanılarak olgunlaşmamış mScarlet-I proteini ve olgun mScarlet-I proteini kullanılarak gerçekleştirildi. FlAsH etiketi kullanılarak mScarlet-I'nin jel floresan boyanması, toplam hücresiz proteinin Coomassie Blue lekelemesine ek olarak gerçekleştirildi.Bu işlemi takiben, standart yöntemler kullanılarak zorlu olan enzimleri ve yolları incelemek için aktivite tahlilleri yapılabilir. Ayrıca ölçeklenmiş biyosentez ve yüksek verim gen ekspresyona doğru uzanır. Bu tekniği, yüksek GC bakterilerinden metabolik enzimleri incelemek için geliştiriyoruz.Sistemimizin hücresiz reaksiyonlarda ölçeklenmiş biyosentezi inceleme potansiyelini gösterdik.

a-high-yield-streptomyces-transcription-translation-toolkit-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

A ile Üretilen Kompleksi Antibiyotik Eritromisin Featuring Mantık, Deneysel Merdivenleri ve Heterolog Doğal Ürün biyosentezi Potansiyeli<em&gt; E. coli</em

Bu beş günlük protokolü bütün adımlar, ekipman, ve esaslı etkili endojen Escherichia coli sıfırdan TX-TL hücre serbest ifade sistemi oluşturmak ve çalıştırmak için gerekli ek yazılım özetliyor. Reaktif ile protokol 8 kurulumu için saat veya daha az bir tepki toplamak ve işlem verileri alır.

Bir uygulama için Protokoller Escherichia coli Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Burada, (A), antibiyotik aktivitesi ile doğal ürünün belirlenmesi, (B) bileşiği ile saflaştırılması, (c) biyosentezinin ilk modeli, (D), genom dizileme / -Maden ve detaylı bir protokol mevcut ( E) biyosentetik gen kümesinin doğrulanması.

dan Polyketomycin kullanma A Gösteri: Its Biyosentetik Gen kümesi için bir Doğal Ürün dan Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.

İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX

Bu el yazması mikrobiyal yetiştirme ortamının terzi tasarımı için genel bir yaklaşımı açıklar. Bu güvenilirlik ve sıvı ortam işleme hızı artırmak için laboratuvar robot tarafından desteklenen yeterli ekimi verimi için deneysel tasarım ve microbioreactor teknoloji Kriging tabanlı birleştiren yinelemeli bir iş akışı tarafından etkin hazırlık.

Otomatik Microbioreactor teknolojisini kullanarak Contegra Protein üretim duruma getirilmesi için genel iletişim kuralı

Burada acemi protokollerde araştırmacılar için farmakolojik önemli bakteriyel cinsi Streptomycesfenotipleme başlatmak için mevcut.

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Escherichia coli-boş hücre Protein sentezi dayalı: sağlam, esnek ve erişilebilir platform teknolojisi için iletişim kuralları

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Burada bir kütle spektrometresi güdümlü genom madenciliği protokolü oluşturulmuş ve tanımlanmıştır. Genom dizilimi bilgileri ve LC-MS/MS analizine dayanan bu analiz, kompleks mikrobiyal ve bitki özlerinden moleküllerin belirlenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Yeni Doğal Ürünleri Ortaya Çıkarmak İçin Bir Araç Olarak Kütle Spektrometresi Güdümlü Genom Madenciliği

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Burada sunulan, Escherichia coli BL21 Rosetta2'nin (ΔrecBCD ve ΔrecB) ekzonükleaz V nakavt suşlarından hücre ekstraktlarının hazırlanması ve tampon kalibrasyonu için bir protokoldür. Bu, lineer DNA şablonlarını kullanarak hücresiz protein sentez sistemlerinde ekspresyon için hızlı, kolay ve doğrudan bir yaklaşımdır.

Lineer DNA Şablonlarını Kullanarak Ekzonükleaz Eksikliği Olan Hücresel Ekstraktlardan Hücresiz Protein Sentezi

Keşfedin Streptomyces venezuelae hücre-dışı transkripsiyon-çeviri sistemini yüksek verimli rekombinant protein sentezi için. Bu yöntem yüksek GC içerikli genlerin heterolog ifadesini kolaylaştırır ve biyosentetik yolakların incelenmesine olanak tanır.

Sentetik Biyoloji ve Doğal Ürün Uygulamaları için Yüksek Verimli Streptomices Transkripsiyon-Çeviri Araç Seti

Daha fazla video keşfet