Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu
October 7th, 2021
Kriyo-kesit diseksiyonu, derin nicel proteom analizi için murine beynindeki en büyük nörojenik nişin taze ve donmuş hazırlanmasını sağlar. Yöntem kesin, verimlidir ve minimum doku pertürbasyonuna neden olur. Bu nedenle, bu nişin moleküler mikroçevriminin yanı sıra diğer organların, bölgelerin ve türlerin incelenmesi için idealdir.
Diseksiyon yöntemimiz ventriküler nörojenik nişin hassas izolasyona izin veriyor ve bu nedenle bu nişin moleküler mikroçevroronmentini incelemek için çok uygundur. Bu diseksiyon yönteminin ana avantajı, hassas, verimli olması ve proteom analizi için kütle spektrometresi ile uyumluyken minimum doku pertürbasyonuna neden olmasıdır. Bu protokolde, ventrikülün nörojenik nişini bir fare beyninden çıkarıyoruz, ancak bu yöntem diğer türlere ve çeşitli sağlık ve hastalık durumlarına da uygulanabilir.
Teknik biraz eğitim gerektirebilir. özellikle ventrikül nörojenik nişini açığa çıkarırken neşter kesikleri ile. 8 ila 10 haftalık bir C57 siyah/6 erkek fareyi ötenazi yaptıktan sonra, beyni manuel diseksiyonla çıkarın ve buz gibi diseksiyon ortamı içeren bir kültür yemeğine yerleştirin.
Neşter kullanarak, koku alma ampulü ile korteksin iç kutbu arasında düz bir koronal kesim yaparak koku ampulünü çıkarın. Daha sonra, koronal bir kesim yaparak korteksin ön kutbundan çıkarın, yanal ventriküllerin koronal düzlemde görünür olmasını sağlayın. Daha sonra makas kullanarak, kortikal yüzeyden ventrikül lümenine kadar sagittal bölümden başlayarak her iki lateral ventrikülleri de yukarıdan açın.
Ventrikül fleksiyonunu takiben bu kesimi C şeklinde uzatın. Daha sonra, ek bir koronal kesim kullanarak sol ve sağ sagittal kesiğin kaudal uçlarını bağlayın. Daha sonra, medial ventrikül duvarlarını kaplayan korteks ve korpus callosum'u çıkarın.
Doku medial ventrikül duvarlarına bağlıysa, ek kesikler yapın veya dokuyu yerinden çıkarmak için korteks ve korpus callosum'u makasla kaldırın. Daha sonra, kümes uçlarını kullanarak, lateral ventrikülleri kaplayan korteksi ve korpus callosum'u çıkarın. Forseps kullanarak, ventrikül duvarlarını dikkatlice yayın ve koroid pleksusu çıkarın.
Daha sonra, beyni cam bir kaydırağın üzerine koyun ve açık konfigürasyondaki ventrikül duvarlarıyla beyni dondurmak için kaydırağı kuru buzun üzerine yerleştirin. Bölümlemeden önce, beynin donmuş dokular için gömme ortamı ile arka beyindeki kriyostat bağlanma plakasına bağlı olduğundan emin olun. Ayrıca, özellikle ventriküllerde, hiçbir gömme ortamının fore beyinle temas olmadığından emin olun.
Daha sonra, lateral ventrikülün sonuna kadar beynin 50 ila 100 mikrometre kalınlığında koronal bölümlerini kesin ve bölümleri cam slaytlara monte edin. Cam slaytları bir diseksiyon mikroskobu altında kuru buzun üzerine yerleştirin. Kısa, eksik bir çözülme elde etmek için dilimleri kuru buzdan 15 ila 30 saniye boyunca kaldırın, striatumun kompakt miyelinini yoğun beyaz noktalar olarak gözlemlenebilir hale getirir.
Daha sonra, önceden soğutulmuş bir neşter kullanarak, subependymal bölgeyi bitişik striatumdan ayırın ve bir bütün parça olarak aktarın veya soğutulmuş neşterin künt kenarını kullanarak bir mikrosantrifüj tüpüne iki ila dört parçaya bölünün. O zaman aynı şeyi medial ventrikül bölgesi için de yapın. Striatumun miyelin ilişkili, glikoprotein pozitif iç kapsülleri tümmount örneklerde, ancak nadiren immünohistokimya yoluyla kriyo-kesit diseksiyon örneklerinde tanımlanmıştır.
Tümmount örneklerindeki striatal kontaminasyon, alt bölgedeki miyelin proteinlerinin somato-duyusal korteks örneklerine kıyasla zenginleştirilmesiyle doğrulandı. Buna karşılık, kriyo-kesit-diseksiyon örneklerinde bu miyelin belirteç proteinlerinin karşılaştırmalarında subependymal bölge ve somato-duyusal korteks örneklerinde önemli bir fark olmadığı tespit edildi. Kriyo-kesit diseksiyonu ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu arasında kütle spektrometresi sonuçları karşılaştırıldığında, doku toplama süresi yaklaşık iki kat daha uzun olmasına rağmen, lazer yakalama mikrodiseksiyonu yaklaşık olarak iki kat daha fazla nicel protein verdi.
Prensip bileşen analizi, kareler olarak tasvir edilen lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile toplanan örnekler arasında, daire olarak tasvir edilen kriyo kesit-diseksiyon ile toplananlardan daha büyük değişkenlik olduğunu ortaya koymaktadır. Subependymal ve medial ependymal bölgeler için kriyo-kesit diseksiyonu ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu arasındaki 2D ek açıklama zenginleştirme testi, hücre dışı alanla ilişkili proteinler için hem yöntemlerde hem de bölgelerde benzer zenginleşmeyi ortaya koydu. Kriyo-kesit diseksiyonu, subependymal bölge ile ilişkili hücre dışı matris proteinlerinde nörogenezin daha sağlam bir tanımlanması ve nicelleştirilmesini sağlar.
Tenascin-C durumunda, subependymal bölgede medial ependymal bölgeye kıyasla sadece kriyo-kesit-diseksiyon zenginleştirme gösterdi. Slaytlardaki beyin bölümlerinin tamamen çözülmemesine dikkat edin. Genel olarak, tutarlı bir sonuç için diseksiyon prosedüründeki adımları uygulamak iyidir.
Diseksiyon yöntemi, büyüme faktörleri ve sitokinler gibi çok düşük bol proteinleri kolayca tespit debilen diğer protein analiz yöntemleriyle de kullanılabilir. Bu mikrodispeksiyon yöntemi, yeni bir nörogenez düzenleyicisini tanımlamamıza izin verdi ve başkalarının nörogenezin diğer düzenleyicilerini çeşitli bağlamlarda tanımlamasına izin vereceğine inanıyoruz.
Genel Bakış
Bu çalışma, fare ventriküler nörojenik nişinin hassas ve verimli hazırlanması için bir kriyo-kesit-diseksiyon yöntemi sunmakta olup, derin nicel proteom analizini mümkün kılmaktadır. Doku tahripini en aza indirgemekle, bu teknik özellikle sağlık ve hastalık gibi çeşitli biyolojik bağlamlardaki moleküler mikroçevreyi araştırmak için uygundur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Proteomik
- Nörojenezis
Arka Plan
- Ventriküler nörojenik niş, fare beyninde nörojenezide kritik bir rol oynamaktadır.
- Bu nişi izole etmek için mevcut yöntemler önemli doku hasarına neden olabilir.
- Detaylı moleküler analizler için hassas diseksiyon gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Ventriküler nörojenik nişin doğru bir şekilde çıkarılmasına olanak sağlayan bir yöntem geliştirmek.
- Nörojenezis ile ilgili proteinlerin nicel analizini kolaylaştırmak.
- Farklı türler ve sağlık koşullarında uygulanabilirliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Fare beyninin kriyo-kesit-diseksiyonu uygulanmıştır.
- Çalışma, ventriküler nörojenik nişlerine odaklanarak erkek C57BL/6 fareleri kullanmıştır.
- Multiomik akış süreci bahsedilmemiş, ancak proteomik analiz vurgulanmıştır.
- Ana adımlar arasında belirli beyin bölümlerinin çıkarılması ve analiz için dondurma yer almıştır.
- Teknik, diseksiyon sırasında neşter kullanımında beceri gerektirir.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, nörojenezle ilgili proteinlerin güvenilir tanımlanması ve nicelenmesini sağlamıştır.
- Kriyo-kesit-diseksiyon, lazer yakalama mikrodiseksiyona kıyasla daha az kontaminant vermiştir, bu da veri bütünlüğünü artırmıştır.
- Önemli olan, bu yaklaşımın benzersiz nörojenesis düzenleyicilerini ortaya çıkarmasıdır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, nörojenik nişlerin izole edilmesi için yeni bir yaklaşım göstererek, nörojenezin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Teknik, nöroplasitiklikle ve rejenerasyonla ilişkili protein profilleri hakkında daha derin bilgiler sağlamaktadır.
- Bulgular, çeşitli biyolojik ve patolojik bağlamlarda nörojenik düzenlemeyi incelemede etkilidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Precise isolation of the subependymal zone enables deep quantitative proteome analysis of the neurogenic stem cell microenvironment, addressing a key challenge in neuroscience target validation. The cryo-section-dissection method achieves twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to laser-capture microdissection, improving data robustness and reducing variability. This supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery workflows focused on neurogenesis regulators and extracellular matrix proteins.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing uncontaminated tissue for proteomic analysis of neurogenic niche regulators.
- Operational Value: Reduces tissue perturbation and preparation time, increasing reproducibility and throughput for target validation studies.
- Predictive Value: Improves confidence in target identification by minimizing stromal contamination and enhancing detection of low-abundant proteins like tenascin-C.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates highly purified subependymal zone samples suitable for developing reproducible assays targeting extracellular matrix and secreted factors.
- Operational Value: Compatible with state-of-the-art mass spectrometry, enabling scalable protein quantification for biomarker discovery pipelines.
- Predictive Value: Supports assay standardization by reducing sample variability, as shown by lower principal component dispersion compared to laser-capture microdissection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling by allowing consistent SEZ isolation across health and disease states in multiple species.
- Operational Value: Enables longitudinal proteomic monitoring of neurogenesis regulators in preclinical models with minimal batch effects.
- Predictive Value: Enhances translational biomarker alignment by preserving native protein–protein interactions in the extracellular space.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into assay development for neurogenesis-modulating compounds.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by enabling precise mapping of neurogenesis-associated extracellular matrix proteins and cytokine networks.
- Screening: Prepares standardized tissue inputs for quantitative proteomic screening of compound effects on niche signaling pathways.
- Analytics: Delivers deep, reproducible proteome quantification that facilitates statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by preserving disease-relevant neurogenic niche composition.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable dissection platform applicable across species and pathophysiological contexts, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through enhanced detection of niche-specific regulators and reduced false positives from stromal contamination.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via minimal tissue handling and rapid, consistent sample preparation.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by improving target selectivity and reducing mechanistic ambiguity in neurogenic pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of neurogenesis targets based on robust, deep proteome data from clinically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomical dissection and cryostat sectioning to maintain ventricular wall integrity.
- Dependent on cryostat, microtome, and mass spectrometry infrastructure for sectioning and deep proteome analysis.
- Necessitates standardized thawing and handling protocols to prevent tissue degradation and ensure section quality.
- Adaptation across species may require adjustments in section thickness and dissection angles based on ventricular anatomy.
- Practical limitation: Method effectiveness depends on operator skill in avoiding complete thawing and maintaining tissue architecture during transfer.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Preparation of the Mouse Brain
2:38
Sectioning of the Prepared Brain and Free-hand Dissection of Brain Slices
3:48
Results: Comparison of Cryo-Section-Dissection with Wholemount and Laser Capture Microdissection for Quantitative Proteome Analysis of the Adult Subependymal Zone
5:34
Conclusion
