Name: Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Öğrenin farelerde meme kanseri büyümesini ve metastatik koloni oluşumunu biyolüminesans ile gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu protokol kanser ilaç çalışmaları için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Y.D.S. laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Kudüs'teki Hadassah Tıp Merkezi'ndeki Wohl Translasyonel Tıp Enstitüsü'ne küçük hayvan görüntüleme tesisini sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, İsrail Kanser Araştırma Fonu'ndan Araştırma Kariyer Geliştirme Ödülü ile desteklenmiştir.

Tüm fare deneyleri, İbrani Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi onaylı protokol MD-21-16429-5 kapsamında gerçekleştirildi. Buna ek olarak, İbrani Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre hattı bakımı
NOT: Bu protokolde insan meme kanseri hücre hatları (MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231) kullanılmıştır.
<ol><li>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium'undaki (DMEM) tüm meme kanseri hücre hatlarını, nemlendirilmiş bir karbondioksit (% 5 CO2) inkübatöründe 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir. NOT: Hücre yoğunluğunu düzenli olarak kontrol edin; %70 akıcılığa ulaştıklarında gelecekteki kullanımlar için bölün ve genişletin.</li>
</ol>2. Virüs hazırlığı
<ol><li>HEK293T hücrelerine ayrılana kadar 1 mL tripsin ile muamele edin.</li>
	<li>Tripsin aktivitesini nötralize etmek için 10 mL DMEM (% 10 FBS) ekleyin ve hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Hücreleri çökeltmek için 5 dakika boyunca 150 × g'da santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı atın ve 1 mL taze DMEM ortamı ekleyin.</li>
	<li>Hücre konsantrasyonunu ve tohum 1.2 × 106 hücre/kuyuyu altı delikli bir plakada belirleyin.</li>
	<li>Ertesi gün, transfeksiyon reaktifi, serumsuz DMEM, zarf plazmidi (VSV-G), lentivirüs ambalaj plazmidi (ΔVPR) ve pLX304 Luciferase-V5 blast plazmidi veya FUW GFP plazmidi dahil olmak üzere gerekli tüm reaktifleri önceden ısıtın.</li>
	<li>1,5 mL'lik otoklavlanmış bir santrifüj tüpünde, 50 μL serumsuz DMEM'i 0,3 μg VSV-G plazmid, 1 μg ΔVPR ve 1,2 μg pLX304 Luciferaz-V5 blast plazmid veya FUW GFP plazmidi ile karıştırın.</li>
	<li>Bu plazmidleri ortamla iyice karıştırdıktan sonra, transfeksiyon reaktifinden 5 μL ekleyin, yavaşça karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kuluçkayı takiben, karışımı HEK293T hücrelerine damla damla ekleyin.</li>
	<li>24 saat sonra, büyüme ortamını 2 mL (% 30 FBS) DMEM ile değiştirin. Ertesi gün (transfeksiyon sonrası 48 saat), virüsleri içeren ortamı ("pLX304 Luciferase-V5 veya FUW GFP virüsleri") toplayın. NOT: %30 FBS kullanımı virüs üretim verimliliğini artırır.</li>
	<li>HEK293T hücre kalıntılarını önlemek için, virüs içeren ortamı 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden veya 5 dakika boyunca 150 × g'lık santrifüjden geçirin ve süpernatanı toplayın. NOT: Uzun süreli depolama için, virüsün çalışan alikotlarını -80 ° C'de tutun.</li>
</ol>3. GFP ve lusiferazı kararlı bir şekilde eksprese eden hücrelerin oluşturulması ("GFP + Luc + hücreleri")
<ol><li>Hücreleri enfekte etmeden bir gün önce, tohum 8 × altı kuyucuklu bir plakada kuyu başına 105 hücre.</li>
	<li>Gece boyunca inkübasyondan sonra, büyüme ortamını 8 μg / mL polibren içeren taze ortamla değiştirin. Hücrelere damla damla 200 μL FUW GFP virüsü ekleyin.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Virüs verimliliğini artırmak için, plakayı 30 dakika (37 °C ) boyunca 560 × g'de santrifüj edin (spin enfeksiyonu).</li>
	<li>Hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin ve GFP ekspresyonunu floresan mikroskopi ile doğrulayın.</li>
	<li>GFP eksprese eden hücreleri, floresan ile aktive olmuş hücre sıralama (FACS) (GFP +) ile sıralayın (Şekil 1A).</li>
	<li>GFP ile sıralanmış hücrelere, adım 3.2'de açıklandığı gibi pLX304 Luciferase-V5 blast virüsleri bulaştırın.</li>
	<li>pLX304 Luciferaz-V5 patlama eksprese eden hücreleri (GFP +, Luc + hücreleri) zenginleştirmek için hücreleri enfeksiyon sonrası 30 saat blastisidin (10 μg / mL) ile tedavi edin. Daha sonra, her iki günde bir, blastisidin içeren taze bir ortamla değiştirin. Ek olarak, bir kontrol olarak, naif hücreleri aynı blastisidin içeren ortamla tedavi edin. NOT: Enfekte ve kontrol hücreleri arasındaki açık bir fark, birkaç günlük blasticidin tedavisinden sonra gözlenmelidir. Bu etki hücre hattına bağımlıdır ve genellikle ~ 8-10 gün sürer. Kötü bir hayatta kalma oranı, düşük bir viral üretim verimini gösterecektir. Eğer öyleyse, düşük verimlilik gelecekteki deneyleri etkileyebileceğinden yeni bir virüs grubu üretin.</li>
</ol>4. İn vitro lusiferaz aktivitesinin doğrulanması
<ol><li>MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 GFP+ Luc+ hücrelerini 15 cm'lik bir plakada %80 akıcılığa kadar büyütün. Hücreleri adım 2.1-2.2'de açıklandığı gibi tripsinizasyon ile toplayın.</li>
	<li>Her bir kuyucukta artan sayıda hücreyi (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104) siyah bir 96 kuyucuklu plakaya tohumlayın. NOT: Siyah 96 delikli plakalar, beyaz veya şeffaf plakalar otolüminesans sinyalleri üreteceğinden, lusiferaz seviyelerini ölçmek için daha uygundur. Bir kontrol olarak, PBS'den otolüminesans olmadığından emin olmak için tek başına bir kuyucukta fosfat tamponlu salin (PBS) kullanın.</li>
	<li>Tüm kuyucukları 100 μL DMEM ile doldurun ve 16-24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS'de lusiferin çözeltisini 30 mg / mL'lik stoktan 1.5 mg / mL konsantrasyonda hazırlayın. Lusiferin çözeltisinin stoğunu alıkoyun ve -20 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Hücreleri PBS ile bir kez nazikçe yıkayın, her bir oyuğa 100 μL lusiferin çözeltisi ekleyin ve 2 dakika bekleyin. Son olarak, biyolüminesans kullanarak tüm meme kanseri hücrelerindeki lusiferaz aktivitesini ölçün. NOT: Hayvan deneylerinden önce in vitro GFP ve lusiferaz ekspresyonunun incelenmesi çok önemlidir. Ek olarak, arka planı çıkarmak için boş kuyucuklar kullanılır.</li>
</ol>5. GFP + Luc + hücreleri ile farelerin enjekte edilmesi
<ol><li>5 × 106 (MCF-7 ve MDA-MB-468) veya 2 × 106 (MDA-MB-231) GFP+ Luc+ hücrelerini sırasıyla 200 μL veya 100 μL PBS'ye aktarın.</li>
	<li>Enjeksiyondan önce, steril biyolojik davlumbazı% 5 dezenfektan çözeltisi ile temizleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, fareleri, 2-3 dakika boyunca 1 L / dak'lık bir hava akış hızında% 4 izofluran içeren filtrelenmiş (0.2 μm) hava ile uyuşturun. NOT: Uygun anestezinin onaylanması esastır; farenin ayak parmağını sıkıştırın ve herhangi bir yanıt arayın.</li>
	<li>Anestezi uygulanan fare kafasının üzerine sırtüstü pozisyonda bir koni yerleştirin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlerine veteriner merhem uygulayın.</li>
	<li>Farenin karın bölgesini, meme bezinin üstünde, pamuklu çubukla etanol ile silin ve 4. meme bezini forseps ile kaldırın.</li>
	<li>İğneyi yağ yastığının altına 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) yerleştirin ve hücre süspansiyonunun 100 μL'sini yavaşça enjekte edin. NOT: Cildin altında yuvarlak bir çıkıntı görünecektir. Ek olarak, yanlış bir enjeksiyon, tümör büyüme hızında sapmaya veya aynı deney grubunda tümörün yokluğuna neden olabilir.</li>
	<li>Enjeksiyon işleminden sonra, fareleri davlumbazdan çıkarın ve yeni bir kafese aktarın. Bilince dönene kadar fareleri izleyin. NOT: Kullanılan tüm iğnelerin ve şırıngaların keskinlik kutusuna atıldığından emin olun.</li>
</ol>6. GFP + Luc + farelerde lusiferaz seviyelerinin ölçülmesi
<ol><li>Biyolüminesans tespitinden önce, boynunu sol eliyle tutarak bilinçli fareyi kısıtlayın. Ardından, elinizi sola doğru eğin, farenin yukarı bakması ve alt gövdenin sırtüstü pozisyonda olmasını sağlayın.</li>
	<li>İğne boyutu 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) olan 1,0 mL'lik bir şırınga kullanarak farenin sol alt karın kadranındaki farenin karın yüzeyine intraperitoneal olarak (yani 100 mg/mL) 100 μL lusiferin (30 mg/mL) enjekte edin. NOT: İğnenin ucu, viseral organlara nüfuz edebileceğinden, karın duvarından 3-5 mm'den daha fazla yerleştirilmemelidir. Ek olarak, anestezi uygulanan farelerin vücudundaki lusiferin dağılımı bilinçli farelerden daha yavaş olduğu için anestezi olmadan i.p. enjeksiyonu yapılması önerilir. Bu nedenle, bilinçli farelerde lusiferaz seviyelerinin izlenmesi daha hızlı bir prosedürdür.</li>
	<li>Tümör kinetiğini ölçmeden önce fareyi anestezi olmadan 7 dakika ve ardından anestezi odasında 3 dakika tutun. NOT: Kuluçka süresi, farklı deneyler, hücre hatları ve türler arasında türlere göre değişir. Bu nedenle, deneylere başlamadan önce kuluçka süresinin kalibre edilmesi önerilir.</li>
	<li>Fareleri 5.2-5.3 adımlarında açıklandığı gibi anestezi altına alın.</li>
	<li>Kuluçka sırasında yazılımı (Malzeme Tablosu) açın, görüntüleme sistemini başlatın ve Başlat düğmesine tıklayın. NOT: Fotoğraf makinesinin soğumasının ~10 dakika süreceğini ve -90 °C'ye ulaşacağını unutmayın. Ek olarak, arka plan kontrolü olarak, naif farelerde (yani, lusiferaz genini ifade etmeyen hücrelerle enjekte edilen GFP + fareler) lusiferaz seviyelerini ölçün.</li>
	<li>Aşağıdaki ayarları kullanarak kurulumu otomatik pozlamada tutun: otomatik pozlama süresi, 60 sn; Bağlama Ortamı, F/Stop 1; Uyarma filtresi engellenmiş; Emisyon filtresi açık. Başlatma sona erdiğinde, Görüntüleme Sihirbazı'nı seçin | Biyolüminesans ve ardından İleri |'i tıklatın Filtre |'ni açın görüntü konusunda Fare'yi seçin.</li>
	<li>Saha Görünümü'nde, C (10 cm) aşamasını ve Konu Yüksekliği: 1,50 cm'yi seçin.</li>
	<li>Image Setup Stage to C (Görüntü Kurulumu) to C ( Image Setup Stage to C) seçeneğini tıklatın ve Acquire (Elde Et ) düğmesini tıklatmadan önce, farenin sahne alanına doğru sırtüstü konumda yerleştirildiğinden emin olun.</li>
	<li>Kapıyı kapatın, Al düğmesine tıklayın ve ekranda bir görüntünün görünmesini bekleyin. NOT: Otomatik Pozlama seçeneğiyle, güçlü bir sinyal sinyale bağlı olarak 5-20 s sürer; zayıf bir sinyal yaklaşık 60 s alacaktır.</li>
	<li>Diğer fareler için bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Akciğer metastazını tespit etmek için, kalın siyah karton kağıt kullanarak primer tümörün güçlü sinyalini örtün ve akciğerlerin sadece ventral tarafını kameraya doğru maruz bırakın. Yukarıda açıklanan parametreleri kullanarak görüntüyü yakalayın.</li>
</ol>7. Biyolüminesans ve floresan kullanarak ex vivo görüntü elde etme
<ol><li>Kurutucuda karbondioksit (CO2) inhalasyonu kullanarak fareleri ötenazi yapın ve otoklavlanmış makas ve forseps kullanarak fareleri diseke edin.</li>
	<li>% 0.9 salin kullanarak fareleri perfüze edin, organları toplayın ve organdaki kan lekelerini gidermek için 1x PBS ile durulayın.</li>
	<li>Durulanmış organı bir Petri kabına aktarın ve biyolüminesans makinesinin aşamasına yerleştirin. Adım 6.2-6.6'da açıklandığı gibi aynı biyolüminesans ayarını uygulayın. NOT: Lusiferaz sinyalindeki azalma nedeniyle, bu adım zaman sınırlayıcıdır. Böylece, fareleri ötenazi yaptıktan sonra, organı hemen biyolüminesans ile görselleştirin.</li>
	<li>GFP görüntüleri için, Biyolüminesans yerine Floresan GFP filtresini kullanarak adım 6.3'te açıklanan ayarın aynısını uygulayın.</li>
	<li>GFP + kolonilerinin varlığını incelemek için stereo mikroskop kullanarak akciğer görüntüleri alın.</li>
</ol>8. Biyolüminesans veri analizi
<ol><li>Yazılımı çift tıklatın ve Dosya menüsünden Aç'ı seçin.</li>
	<li>Tüm dosyaları açın ve simge durumuna küçültün. Tüm birimlerin Işıltı (Fotonlar) olduğundan emin olun. Ayrıca, tüm görüntüler için aynı parametreleri korumak üzere Tümüne Uygula'yı tıklatın.</li>
	<li>Görünüm menüsünden, yeni bir pencere açacak olan Araç Paleti'ni seçin.</li>
	<li>Araç Paleti penceresinden YG Araçları sekmesini seçin ve Tür'de Ortalama Bkg YG'yi seçin.</li>
	<li>Yatırım getirisi araçlarından Daire'yi seçin ve farenin torasik alanına küçük bir daire çizin.</li>
	<li>Daireye çift tıklayın, Arka Plan YG sekmesinden Gelecekteki YG'ler için BKG olarak kullan seçeneğini belirleyin ve Bitti'ye tıklayın.</li>
</ol>9. Toplam akının ölçülmesi
<ol><li>Araç Paleti penceresinden YG Araçları sekmesini seçin ve Tür'de YG Ölçümü'nü seçin.</li>
	<li>Yatırım getirisi araçlarından Daire'yi seçin ve farenin birincil tümörüne büyük bir daire çizin.</li>
	<li>YG'yi kopyala'yı sağ tıklatın ve YG'yi her farenin her bir dosyasına yapıştır'ı sağ tıklatın.</li>
	<li>YG Ölçümleri adlı yeni bir pencere açacak olan YG Araçları sekmesinden YG'leri Ölç'ü tıklayın. Bu sekmeden, Ölçüm Türlerini Parlaklık (Fotonlar) ve Görüntü Özniteliklerini Tüm Doldurulmuş Değerler olarak tutun.</li>
	<li>Dosyayı Ölçüm Dosyası (*.txt) veya CSV (*.csv) biçiminde dışa aktarın.</li>
	<li>Dışa aktarılan verileri bir elektronik tabloda açın ve Toplam Akı (p / s) ve haftaların değerlerini alın. NOT: Bu adım, farklı grupları ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, bir araçla tedavi edilen farelere karşı bir ilaçla tedavi edilenler.</li>
	<li>Zamanın X ekseni boyunca ve Toplam Akının (p/s) Y ekseni boyunca sunulduğu bir XY grafiği oluşturun. Her hafta için, her örnek grup için Toplam Akı (p / s) parametresini alın ve parametrik olmayan Öğrencinin t-testini kullanarak önemli farklılıkları belirleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Waks, A. G., Winer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+treatment%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Breast cancer treatment: A review.</a> JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).</li>
<li>Jin, X., Mu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer%3A+Basic+and+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer: Basic and Clinical Research. 9, Suppl 1 23-34 (2015).</li>
<li>Saha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics+of+breast+cancer+brain+metastasis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics of breast cancer brain metastasis in a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (56), e3175(2011).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model.</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Research. 8 (4), 212(2006).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e51967(2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+whole+picture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The whole picture.</a> Nature. 463 (7283), 977-979 (2010).</li>
<li>Wang, Y., Tseng, J. -C., Sun, Y., Beck, A. H., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+tumor+burden+and+molecular+pathways+in+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of tumor burden and molecular pathways in mouse models of cancer.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 135-144 (2015).</li>
<li>Kim, J. E., Kalimuthu, S., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cell+tracking+with+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo cell tracking with bioluminescence imaging.</a> Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (1), 3-10 (2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), (2016).</li>
<li>Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Different+Methods+for+Determining+Cell+Proliferation+in+Breast+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54040(2016).</li>
<li>Zimmerman, M., Hu, X., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+and+CTL+adoptive+transfer+immunotherapy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis and CTL adoptive transfer immunotherapy mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2077(2010).</li>
<li>Lv, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+transplantation+of+breast+tumors+as+preclinical+models+for+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61173(2020).</li>
<li>Cheng, R. Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+triple+negative+breast+cancer+using+orthotopic+breast+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Studying triple negative breast cancer using orthotopic breast cancer model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60316(2020).</li>
<li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li>
<li>Khatib, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+peroxidase+8+%28GPX8%29%2FIL-6%2FSTAT3+axis+is+essential+in+maintaining+an+aggressive+breast+cancer+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The glutathione peroxidase 8 (GPX8)/IL-6/STAT3 axis is essential in maintaining an aggressive breast cancer phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21420-21431 (2020).</li>
</ol>

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını açıklamışlardır.

Hayvan temelli deneyler kanser araştırmaları için zorunludur 7,8,9 ve gerçekten de birçok protokol geliştirilmiştir 3,6,10,11,12,13,14. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu biyolojik etkiyi sadece...

Meme kanserleri dünya çapında sık görülen kanser türleridir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 250.000 yeni vaka teşhis edilmektedir1. Yüksek insidansına rağmen, yeni bir antikanser ilaç seti meme kanseri hasta sonuçlarını önemli ölçüde iyileştirmiştir2. Bununla birlikte, birçok hasta hastalık nüksetmesi ve hasta morbidite ve mortalitesinin birincil nedeni olan hayati organlara metastatik yayılım2 yaşadığından bu tedaviler hala yetersizdir. Bu nedenle, meme kanseri araştırmalarındaki temel zorluklardan biri, gelişimlerini engellemek için yeni araçlar geliştirmek üzere distal metastazların oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları tanımlamaktır.
Kanser metastazı, hücrelerin birincil tümörden ayrıldığı ve kan dolaşımı yoluyla komşu dokuları istila ettiği dinamik bir süreçtir. Böylece, hücrelerin benzer bir metastatik kaskaddan geçtiği hayvan modelleri, bu süreci yöneten mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırabilir 3,4. Ek olarak, bu in vivo modeller meme kanseri terapötik ajanlarının geliştirilmesi için gereklidir 5,6. Bununla birlikte, bu ortotopik modeller gerçek tümör büyüme kinetiğini gösteremez, çünkü etki sadece sonlandırma üzerine belirlenir. Bu nedenle, tümör gelişimini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak tespit etmek için lusiferaz bazlı bir araç kurduk. Ek olarak, bu hücreler metastatik kolonileri tespit etmek için GFP'yi eksprese eder. Bu yaklaşım nispeten basittir ve herhangi bir invaziv prosedür içermez3. Bu nedenle, lusiferaz ve floresan tespitini birleştirmek, meme kanseri terapötikleri ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL eppendorf tüpleri</td><td>Lifegene</td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; L uçlar</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 & L uçlar</td><td>Lifegene</td><td>LRT1000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L ipuçları</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu hücre kültürü plakası</td><td>COSTAR</td><td>3516-96</td><td></td></tr><tr><td>kuyulu Plakalar SİYAH düz tabanlı</td><td>Bar Naor</td><td>BN30496</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayaçları</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III sıralayıcı</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 İğne 27 G (3/4 '')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak Şırıngalar 1 mL x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm Stil Çanak</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm Stil Çanak</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası kızakları</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM), yüksek glikoz, glutamin</td> <td>içermezBiyolojik Endüstriler</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i mikroskobu</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eppendorf Santrifüj 5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Dr. Yossi Buganim'in laboratuvarından (Kudüs İbrani Üniversitesi) hediye edilmiştir</td></tr> <tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>Dr. Lior Nissim'in laboratuvarından (Kudüs İbrani Üniversitesi)</td></tr> <tr><td>Isoflurane, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin Çözeltisi</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Canlı Görüntü Yazılımı</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>biyolüminesans ölçüm</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td> <td># 8455</td><td>David M. Sabatini' tarafından sağlanmıştır. s lab (Whitehead enstitüsü, Boston, ABD)</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>David M. Sabatini' tarafından sağlanmıştır s lab (Whitehead enstitüsü, Boston, ABD)</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Çözeltisi Biyolojik Endüstriler</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 90 mm (90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td> Pipetler 25ml Lifegene LG-GSP010050S <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetler 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferase-V5 patlama plazmidi</td><td>Addgene</td> <td># 98580</td><td></td></tr><tr><td>Polibren</td><td>Sigma Aldrich</td> <td># 107689</td><td></td></tr><tr><td>Prizma 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Rezervuarları</td><td>Bar Naor</td><td>BN20621STR200TC</td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Stereo mikroskoplar</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Biyo-Laboratuvarı</td><td></td><td></td>190359400</tr><tr><td>Şırınga filtreleri</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi %0,5 çözelti</td><td>Biyolojik endüstriler</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin EDTA Çözeltisi B (%0,25), EDTA (%0,05)</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>03-052-1a</td><td></td></tr><tr><td>Vakum tahrikli Filtreler</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td></td><td></td>dezenfektan</tr><tr><td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Sınıf</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

biyolüminesans kullanarak farelerde meme kanseri büyümesi ve metastatik koloni oluşumunun İzlenmesi

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Meme kanseri sık görülen heterojen bir malignitedir ve kadınlarda özellikle uzak organ metastazı nedeniyle mortalitenin ikinci önde gelen nedenidir. Kanser hücrelerinin meme yağ yastığına enjekte edildiği yaygın olarak kullanılan ortopik fare modelleri de dahil olmak üzere çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, bu modeller tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu izlemeye yardımcı olamaz. Farelerde kanser hücrelerini gerçek zamanlı olarak izlemek için en yeni araçlar, tümör biyolojisinin anlaşılmasını önemli ölçüde ilerletecektir. 
Burada, lusiferaz ve yeşil floresan proteini (GFP) kararlı bir şekilde eksprese eden meme kanseri hücre hatları oluşturulmuştur. Spesifik olarak, bu teknik, in vitro lusiferaz aktivitesinin ölçülmesiyle başlatılan ve ardından kanser hücrelerinin obez olmayan diyabetik-şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-SCID) farelerinin meme yağ pedlerine implantasyonu ile başlatılan iki ardışık adım içerir. Enjeksiyondan sonra, hem tümör büyümesi hem de metastatik kolonizasyon, noninvaziv biyolüminesans görüntüleme sistemi tarafından gerçek zamanlı olarak izlenir. Daha sonra, akciğerlerdeki GFP eksprese eden metastazların miktarı, gözlemlenen biyolüminesans sonuçlarını doğrulamak için floresan mikroskobu ile incelenecektir. Lusiferaz ve floresan bazlı tespit araçlarını birleştiren bu sofistike sistem, meme kanseri terapötiklerinde ve hastalık yönetiminde kullanım için büyük potansiyele sahip olan kanser metastazını in vivo olarak değerlendirir.

GFP ve lusiferaz vektörlerini eksprese eden meme kanseri hücre hatları (MDA-MB-231, MCF-7 ve MDA-MB-468) ürettik. Spesifik olarak, bu sıralı bir enfeksiyon ile elde edildi. İlk olarak, meme kanseri hücre hatları, floresan GFP'yi eksprese eden bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. GFP-pozitif hücreler (GFP +) enfeksiyondan 2 gün sonra sıralandı (Şekil 1A, B) ve pLX304 Luciferase-V5 vektörü ile enfekte edildi. Daha sonra, belirtilen (GFP +, Luc ...

Burada, çeşitli meme kanseri hücre hatlarında lusiferaz ve yeşil floresan protein ekspresyonunu içeren noninvaziv bir izleme yöntemini tanımladık. Bu protokol, farelerde tümör oluşumunu ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir teknik sağlar.

Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Bu sofistike, invaziv olmayan aracı kullanarak, meme kanseri tedavisi ve hastalık yönetiminde büyük bir potansiyele sahip olan farelerde tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izleyebiliriz. Lusiferaz ve floresan tespitinin birleştirilmesi, meme kanseri progresyonu ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir. Bu, antikanser ilaç çalışmaları için uygulanabilir.Bu protokol meme kanseri ile sınırlı değildir ve akciğer ve pankreas gibi diğer karsinomlara uygulanabilir. MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 GFP ve lusiferaz pozitif hücreleri ayrı ayrı 16 santimetrelik bir plakada %80 akıcılığa kadar büyüterek başlayın. Hücreleri tripsinizasyonla topladıktan sonra, her bir kuyucukta artan sayıda hücreyi siyah bir 96 delikli plakaya tohumlayın.Ardından, tüm kuyucukları 100 mikrolitre DMEM ile doldurun ve 37 santigrat derece,% 5 CO2 inkübatöründe 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin. PBS'de mililitre başına 1.5 miligram konsantrasyonda lusiferin çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kuluçka sonrası, her bir oyuğa 100 mikrolitre lusiferin çözeltisi eklemeden önce hücreleri PBS i

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kemik metastazı deneysel bir fare modeli lusiferaz meme tümör hücreleri ifade intrakardiyak teslim edildikten sonra kurulmuştur. Biyoparlaklık ve mikro BT görüntüleme ile tümör gelişimi ve osteolitik lezyon sonuçlandı boyuna takip edildi.

Biyoparlaklık ve Micro CT Görüntüleme Tümör Metastazlari ve osteolitik Lezyonlar İzleme

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Kaynak:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Brasília Üniversitesi, 2Temel Psikolojik Süreçler Bölümü, Psikoloji Enstitüsü, Brasília ÜniversitesiBu video, lusiferaz eksprese eden meme adenokarsinom hücrelerini dişi bir fareye enjekte ederek ve zaman...

Dişi Fare Modelinde Meme Tümörü İlerlemesinin Biyolüminesans Görüntülemesi

Biyoparlaklık görüntüleme tümörleri ve metastazları lokalize için iyi bilinen bir araçtır, ama bu görüntülerin miktar genellikle karmaşık hesaplamaları ve özellikle araçların gerektirir. Biz hiçbir hesaplamalar gerektiren ve tümör yükü ve tedavi yanıtı fare modellerinde izlenecek sağlayan hassas satın alma koşullarına göre, kolay kullanımlı luminoscore yöntem açıklanmaktadır.

Fare Lenfoma Modellerinde İzleme Tümör ilerleme ve Tedavi Etkileri Biyoparlaklık Tabanlı Tümör Niceleme Yöntemi

Ortotopik meme kanseri primer tümör modeli ve primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması açıklanan spontan metastaz oluşturmak için fare ömrünü uzatmak için. tümör büyümesi ve ilerlemesi izlenir ve lusiferaz floresan görüntüleme ile ölçülür.

Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Biz bir fare orthotopic meme kanseri modeli ve radikal mastektomi modeli insan meme kanseri ilerleme taklit etmek için tümör yükünü ölçmek için bioluminescence teknolojisi ile tanıtmak.

Fare Orthotopic metastatik meme kanseri Model oluşturma ve fare radikal mastektomi gerçekleştirme

Bu protokol, Çift Bioluminesans görüntüleme ile tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi gerçek zamanlı olarak izlemek için tümör taşıyan bir fare modelinin kurulması açıklanmaktadır.

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Bu çalışma, yeşil floresan protein ve biyolüminesans sinyallerinin yanı sıra kantitatif moleküler algılama tekniğinin entegrasyonu ile tümör yüklemesini doğru bir şekilde değerlendirmek için gelişmiş bir protokol hazırlaştır.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Burada, onkojenik nükleik asitlerin terapötik susturulması için klinik olarak uygulanabilir bir yaklaşım sağlayarak, RNA oligomerlerini taşıyan manyetik demir oksit nanopartiküllerinin hayvan modellerinde metastatik meme kanserine in vivo olarak verilmesi için protokolü açıklıyoruz.

Murin Meme Kanseri Metastazlarında Nanoilaç Birikiminin İzlenmesi

Öğrenin farelerde meme kanseri büyümesini ve metastatik koloni oluşumunu biyolüminesans ile gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu protokol kanser ilaç çalışmaları için değerli bir araç sunar.

Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi

Daha fazla video keşfet