Biyolüminesans Kullanarak Farelerde Meme Kanseri Büyümesi ve Metastatik Koloni Oluşumunun İzlenmesi

Burada, çeşitli meme kanseri hücre hatlarında lusiferaz ve yeşil floresan protein ekspresyonunu içeren noninvaziv bir izleme yöntemini tanımladık. Bu protokol, farelerde tümör oluşumunu ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir teknik sağlar.

Bu sofistike, invaziv olmayan aracı kullanarak, meme kanseri tedavisi ve hastalık yönetiminde büyük bir potansiyele sahip olan farelerde tümör büyüme kinetiğini ve metastatik kolonizasyonu gerçek zamanlı olarak izleyebiliriz. Lusiferaz ve floresan tespitinin birleştirilmesi, meme kanseri progresyonu ve hastalık yönetimi ile ilgili klinik öncesi çalışmaları ilerletmek için yararlı bir stratejidir. Bu, antikanser ilaç çalışmaları için uygulanabilir.

Bu protokol meme kanseri ile sınırlı değildir ve akciğer ve pankreas gibi diğer karsinomlara uygulanabilir. MCF-7, MDA-MB-468 ve MDA-MB-231 GFP ve lusiferaz pozitif hücreleri ayrı ayrı 16 santimetrelik bir plakada %80 akıcılığa kadar büyüterek başlayın. Hücreleri tripsinizasyonla topladıktan sonra, her bir kuyucukta artan sayıda hücreyi siyah bir 96 delikli plakaya tohumlayın.

Ardından, tüm kuyucukları 100 mikrolitre DMEM ile doldurun ve 37 santigrat derece,% 5 CO2 inkübatöründe 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin. PBS'de mililitre başına 1.5 miligram konsantrasyonda lusiferin çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Kuluçka sonrası, her bir oyuğa 100 mikrolitre lusiferin çözeltisi eklemeden önce hücreleri PBS ile bir kez nazikçe yıkayın.

İki dakika bekleyin ve ardından biyolüminesans kullanarak tüm meme kanseri hücrelerinde lusiferaz aktivitesini ölçün. Fareye enjekte etmeden önce, beş milyon MCF-7 ve MDA-MB-468 hücresini 200 mikrolitre PBS'ye ve iki milyon MDA-MB-231 GFP ve lusiferaz pozitif hücreleri 100 mikrolitre PBS'ye aktarın. Anestezi uygulanan fareyi, başın üzerine sırtüstü pozisyonda bir koni yerleştirerek enjeksiyon için hazırlayın.

Daha sonra, farenin meme bezinin üzerindeki karın bölgesini pamuklu çubukla etanol ile silin ve hazırlanan hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini yavaşça enjekte etmek için yağ yastığının altına 27 gauge'lik bir iğne sokmadan önce dördüncü meme bezini forseps ile kaldırın. Enjeksiyondan sonra, fareyi kaputtan çıkarın ve bilince dönene kadar gözlem altında yeni bir kafese aktarın. Biyolüminesans tespitinden önce, bilinçli fareyi boynunu sol eliyle tutarak ve elini sola eğerek kısıtlayın, bu da farenin yüzünün yukarı doğru alt gövdesi sırtüstü pozisyonda olmasına neden olur.

Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak farenin sol alt karın çeyreğine intraperitoneal olarak mililitre başına 30 miligram lusiferin 100 mikrolitre enjekte edin. Fareyi anestezi olmadan yedi dakika boyunca tutun, ardından tümör kinetiğini ölçmeden önce anestezi odasında üç dakika bekleyin. Fare kuluçka altındayken, yazılımı açın ve Başlat düğmesine tıklayarak görüntüleme sistemini başlatın.

Otomatik pozlama süresi 60 saniyede, bağlama ortamı f/stop one diyafram açıklığında, uyarma filtresi engellenmiş ve emisyon filtresi açık olacak şekilde kurulumu otomatik pozlamada tutun. Başlatma sona erdiğinde, Görüntüleme Sihirbazı ve Biyolüminesans'ı seçin ve ardından görüntü konusunda fareyi seçmek için İleri, Filtreyi Aç'ı tıklatın. Alan görünümünde, 10 santimetrede C aşamasını ve 1,50 santimetrede konu yüksekliğini seçin.

Ardından, kapıyı kapatıp Al düğmesini tıklatmadan önce farenin sahne alanına uygun sırtüstü konumda yerleştirildiğinden emin olmak için Image Setup Stage'i (Görüntü Kurulum Aşaması) tıklatın. Ekranda bir görüntünün görünmesini bekleyin. Diğer fare için prosedürü tekrarlayın.

Akciğer metastazını tespit etmek için, kalın bir karton kağıt kullanarak primer tümörün güçlü sinyalini örtün ve akciğerlerin sadece ventral tarafını kameraya doğru maruz bırakın. Daha önce açıklandığı gibi aynı parametreleri kullanarak görüntüyü yakalayın. Meme kanseri hücre hatları, floresan GFP'yi eksprese eden bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi ve FAC sıralamasına tabi tutuldu.

GFP-pozitif hücreler enfeksiyondan iki gün sonra sıralandı, floresan mikroskopla kaplandı ve görselleştirildi. İn vitro lusiferaz aktivitesi, lusiferaz aktivite düzeylerinde hücre sayısına bağlı bir artış ile doğrulandı. Ek olarak, lusiferaz aktivitesi ile hücre sayısı arasında doğrusal bir korelasyon bulundu.

Meme kanseri hücre hatları enjekte edildikten sonra, fareler tümör büyüme kinetiğini belirlemek için her iki haftada bir biyolüminesans okumasına tabi tutuldu. Tümör büyüme kinetiği, MDA-MB-231 hücre hatlarında, daha az agresif hücre hatları olan MCF-7 ve MDA-MB-468'den daha hızlıydı. Lüminesans aktivitesi üç hücre hattı için ölçüldü.

Enjeksiyondan altı hafta sonra, hasat edilen tümörlerin GFP ekspresyonunu koruduğu bulundu. Ayrıca, tüm farenin akciğerinden gerçek zamanlı olarak pozitif biyolüminesans okumaları elde edildi. Pozitif metastatik kolonileri doğrulamak için akciğer toplandı ve GFP ve biyolüminesans için metastatik koloniler gözlendi.

Enjeksiyon işlemini gerçekleştirirken dikkatli olmak daha önemlidir. Yanlış enjeksiyon, tümör büyüme hızında sapmaya veya tümör yokluğuna neden olabilir. GFP ekspresyonunu saptayarak, akciğer metastazını in vivo ve ex vivo olarak inceleyebiliriz.

Ek olarak, immünohistokimya tabanlı boyama ile akciğerlerin histopatolojisini de inceleyebiliriz. Bu teknik, ilaç etkinliği çalışmalarının etkisi gibi yeni soruları keşfetmek için yararlı olabilir.