Name: Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Öğrenin, intratibiyal enjeksiyonla farelerde primer osteosarkom ve akciğer metastazı modelleri oluşturmayı. Bu yöntem, tümör gelişimini klinik özelliklerine uygun şekilde taklit eder ve tedavi stratejilerinin test edilmesine olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, (1) Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2018YFC1704300 ve 2020YFE0201600), (2) Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973877 ve 82174408) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Şangay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı. Dört haftalık erkek BALB / c atimik fareler, osteosarkom hücrelerinin ortopik enjeksiyonu için ameliyattan bir hafta önce iklimlendirildi. Fareler, SPF beslemesine ve steril suya ad libitum erişimi olan 12 saatlik açık / karanlık bir döngüde kafes başına beş fare ile ayrı ayrı havalandırılan fare kafeslerine yerleştirildi.
1. Hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Osteosarkom hücresi (143B-Luciferaz) enjeksiyonu gününde, 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında kültürlenmiş %80-90 oranında kaynayan hücreleri PBS (pH 7.4) ile iki kez yıkayın ve 1.5 mL'lik %0.25 tripsin ile 3 dakika boyunca tripsize edin. Daha sonra, tripsini söndürmek için 6 mL% 10 serum içeren MEM ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. NOT: 143B-Lusiferaz hücre hattı, pLV-lusiferaz vektörü23 ile 143B hücre hattı transfectinden elde edilir.</li>
	<li>Hücre sayma plakasının odasına 20 μL hücre süspansiyonunu aspire edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın (bkz.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı bir pipetle aspire edin ve hücre peletini 8.5 mg/mL'lik bir bazal membran matrisinde (bakınız Malzeme Tablosu) 2 x 107 hücre/mL'lik son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücreleri buz üzerinde tutarak, onları ameliyathaneye getirin. Hücreler 2 saat içinde kullanılmalıdır. NOT: Yanlış enjeksiyon dozlarını önlemek için (örneğin, şırıngalardaki ölü alan nedeniyle), ekstra bir hücre süspansiyonu hazırlanır (genellikle gerekli hücre süspansiyonu hacminin iki katı). Bodrum membran matrisi, oda sıcaklığı24'ün üzerinde pıhtılaşma özelliğine sahip olduğu için her zaman buz üzerinde tutulur.</li>
</ol>2. Osteosarkom hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu için cerrahi
NOT: Ameliyat aletleri Şekil 1'de gösterilmiştir.
<ol><li>Fareler spesifik patojensiz koşullarda yetiştirildi. Tüm prosedürler steril aletlerle aseptik bir dolapta yapıldı.</li>
	<li>Fareleri% 2 izofluran ve% 98 oksijene (oksijen akış hızı, 2 L / dak) maruz bırakarak anestezi yapın.</li>
	<li>Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere az miktarda oftalmik merhem uygulayın. NOT: Tüm prosedürü iyi havalandırılan bir alanda gerçekleştirin. Osteosarkom hücre enjeksiyonundan önce, her farenin bir ayak parmağı sıkışmasıyla derin anestezi altında olduğundan emin olun; farenin hala seğirme veya sarsıntı gibi yanıtları varsa, yukarıdaki yanıtlar kaybolana kadar uzun süre bekleyin.</li>
	<li>Her fareyi sırtüstü pozisyonda tutun. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak farenin ayak bileğini tutun ve tibianın enjeksiyon bölgesini %70 etanol çubuğu ile dezenfekte edin. NOT: Fare ayak bileğini sıkıca tutmak için, hem başparmak hem de işaret parmak uçları sonraki prosedürler için büyük önem taşır.</li>
	<li>Tibia ve fibulayı hareket ettirmek için her farenin ayak bileği eklemini dışa doğru döndürün ve proksimal tibia platosu (tibianın üst kısmı) deriden açıkça görülebilene kadar diz eklemini uygun bir konuma getirin (Şekil 2A).</li>
	<li>İğneyi 1 mL'lik bir şırıngaya takın ve iğne ucunu enjeksiyon bölgesine doğru doğrultun. Şırınga iğnesinin tibianın uzun eksenine paralel olduğundan emin olun.<ol>
<li>İğneyi deri / eklem kapsülünden geçerken patellar ligamentin içinden veya bitişiğinden perkütan olarak yerleştirin; th0en, mikro hacimli bir şırınga ile osteosarkom hücre enjeksiyonu için tibia platformundan tibianın (medüller boşluk) distal ucuna doğru bir delik açmak için şırıngayı (1/2 ila 3/4 daire) döndürün (Şekil 2B, C). NOT: İğne ucu doğruysa, tibianın eşzamanlı dönüşü delme sırasında hissedilebilir. İğnenin, iğnenin yaklaşık yarısı tibiada olana kadar doğrudan ileri itilmek yerine şırınga dönüşü ile ileriye doğru hareket ettiğinden emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Başarılı bir sondaj sağlamak için şırınga iğnesinin medüller kanala belirgin bir hareket yapıp yapmadığını kontrol edin. NOT: İğnenin doğru konumunu onaylamak ve görüntüleri toplamak için bir X-ışını muayenesi yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>143B osteosarkom hücre süspansiyonunu (adım 1.5'ten itibaren) mikro hacimli bir şırıngaya yükleyin ve tibiadaki 1 mL şırıngayı 143B hücre yüklü mikro hacimli şırınga ile değiştirin (Şekil 2D). Yüksek basınç uygulamadan her bir atimik farenin tibiasına (yaklaşık 2 x 105 hücre) 143B hücre süspansiyonunun ~ 10 μL'sini (iğnede önceden var olan çözeltiyi göz ardı edin) yavaşça enjekte edin.</li>
	<li>Mikro hacimli şırınga çıkarıldığında enjeksiyon bölgesini 20-30 s pamuklu çubukla bastırın.</li>
	<li>Her fareyi temiz bir kafese geri koyun ve fare anesteziden tamamen kurtulana kadar (yaklaşık 10 dakika) yakından izleyin.</li>
	<li>Bir X-ışını görüntüleme sistemi kullanarak tümör büyümesini in vivo olarak izleyin. Tümör hacmi (V) hesaplaması için bir kumpas ile her hafta kanser kütlesinin daha uzun çapını (a) ve kısa çapını (b) ölçün: V = 1/2 x a x b2. NOT: Fareleri% 2 izofluran ve% 98 oksijene maruz bırakarak anestezi yapın. Fareler röntgen görüntüleme için anestezi altına alındı. Lusiferaz veya floresan protein etiketli osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu, primer ve metastatik osteosarkom lezyonlarının izlenmesini sağlar. NOT: Diz ve akciğer metastazı tümör büyümesine bağlı osteosarkomlu farelerin insancıl sonlanım noktaları aşağıdaki kriterlere dayanıyordu: (1) Vücut Kondisyon Skoru, (2) %20 kilo verme eşiği, (3) 2 cm'lik tümörlerin ortalama maksimum çapı veya (4) ciddi şekilde sınırlı hayvan davranışı.</li>
</ol>3. Patolojik inceleme (analiz için primer ve pulmoner metastatik osteosarkom örneği toplanması)
<ol><li>Osteosarkom hücre enjeksiyonundan altı hafta sonra, fareleri CO2 inhalasyonu için maruz bıraktıktan sonra servikal çıkık ile feda edin.</li>
	<li>Fareyi sırtüstü pozisyonda tutun ve her iki arka bacağı da gerin.</li>
	<li>Osteosarkom taşıyan tüm bacakları kasık bölgesinden ayırın. NOT: Tüm bacakların aynı anatomik bölgeden ayrıldığından emin olun.</li>
	<li>Deri, kaslar ve ayakları çıkararak osteosarkom taşıyan bacakların histolojik örneğini hazırlayın ve ardından her farenin örneğini 24 saat boyunca 20 mL formalin çözeltisi (% 10) ile 50 mL'lik bir tüpte sabitleyin, ardından ara sıra tampon değişimi ile 14 gün boyunca% 10 EDTA çözeltisinde dekalsifikasyon yapın.</li>
	<li>Örneği parafin içine yerleştirin ve daha önce yayınlanmış çalışma25'i takiben histolojik inceleme için bölümler hazırlayın.</li>
	<li>Akciğerleri yavaşça ayırın ve 20 mL formalin çözeltisi (% 10) ile doldurulmuş 50 mL'lik bir tüpe koyun. 24 saat sonra, her farenin akciğerlerini% 70 etanol içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hematoksilin ve Eozin (H & E) boyama ve immünohistokimya testi25 için akciğerleri parafine gömün.</li>
</ol>

<ol><li>Bielack, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+in+high-grade+osteosarcoma+of+the+extremities+or+trunk%3A+an+analysis+of+1%2C702+patients+treated+on+neoadjuvant+cooperative+osteosarcoma+study+group+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+microenvironment+and+osteosarcoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).</li>
<li>Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+incidence+and+survival+rates+from+1973+to+2004%3A+data+from+the+Surveillance%2C+Epidemiology%2C+and+End+Results+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program.</a> Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+safety+comparison+of+first-line+chemotherapeutic+agents+%28high-dose+methotrexate%2C+doxorubicin%2C+cisplatin%2C+and+ifosfamide%29+for+osteosarcoma%3A+a+network+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51(2020).</li>
<li>Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+considerations+for+osteosarcoma+metastatic+at+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Orthopedics%22%5BJournal%5D)">Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation.</a> Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).</li>
<li>Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+adolescents+and+adults%3A+survival+analysis+with+and+without+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases.</a> Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).</li>
<li>Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+mouse+models+of+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Commonly used mouse models of osteosarcoma.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).</li>
<li>Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+in+the+post+genome+era%3A+Preclinical+models+and+approaches+to+identify+tractable+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+immunology+and+immunotherapy+of+canine+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).</li>
<li>Cobb, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+osteosarcoma+in+the+rat+as+a+model+for+osteosarcoma+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man.</a> British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).</li>
<li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+mouse+osteosarcoma%2C+dependent+on+p53+loss+and+potentiated+by+loss+of+Rb%2C+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease.</a> Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).</li>
<li>Entz-Werlé, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+apc%3Btwist+double-mutant+mice%3A+a+new+model+of+spontaneous+osteosarcoma+that+mimics+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease.</a> Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).</li>
<li>Erstad, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+and+heterotopic+murine+models+of+pancreatic+cancer+and+their+different+responses+to+FOLFIRINOX+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+for+osteosarcoma+in+the+mouse%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).</li>
<li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratibial+injection+causes+direct+pulmonary+seeding+of+osteosarcoma+cells+and+is+not+a+spontaneous+model+of+metastasis%3A+A+mouse+osteosarcoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+and+Related+Research%22%5BJournal%5D)">Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+reproducible+osteosarcoma+rat+model+using+orthotopic+implantation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique.</a> Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected].</a> Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).</li>
<li>Leacock, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+transgenic+model+of+Ewing%27s+sarcoma+reveals+conserved+mediators+of+EWS-FLI1+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).</li>
<li>Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteosarcoma+of+the+proximal+tibia+in+a+dog+6+years+after+tibial+tuberosity+advancement%5BTitle%5D)+AND+%22The+Canadian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement.</a> The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).</li>
<li>Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+human+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for human osteosarcoma.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cantharidin+inhibits+osteosarcoma+proliferation+and+metastasis+by+directly+targeting+miR-214-3p%2FDKK3+axis+to+inactivate+%CE%B2-catenin+nuclear+translocation+and+LEF1+translation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation.</a> International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphyllin+I+suppresses+human+osteosarcoma+growth+by+inactivation+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7605(2017).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li>
<li>Kocatürk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Paschall, A. V., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+mouse+model+of+spontaneous+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54040(2016).</li>
<li>Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+primary+bone+tumors+and+bone+metastasis+with+solid+tumor+graft+implantation+into+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61313(2020).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260(2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Osteosarkom hücrelerinin ortotopik enjeksiyonu, osteosarkom karsinogenezindeki spesifik faktörlerin fonksiyon ve mekanizmasını incelemek ve terapötik etkinliği değerlendirmek için gelişmek için ideal bir modeldir. Tümör büyümesindeki farklılıkları önlemek için, aynı sayıda% 80 -% 90 oranında akan aktif osteosarkom hücrelerinin çoğu, her farenin tibiasına dikkatlice enjekte edilir ve hücre tripsinizasyon süresi, hücre canlılığını etkilemeden sıkı bir şekilde kontrol edilir. Hücre kümeleri, her farenin tibiasına yanlış hüc...

Osteosarkom, çocuklarda ve ergenlerde en sık görülen primer kemik kanseridir1,2, esas olarak çevre dokuya sızar ve hatta hastalar teşhis edildiğinde akciğerlere metastaz yapar. Pulmoner metastaz osteosarkom tedavisi için temel zorluktur ve pulmoner metastazı olan osteosarkomlu hastaların beş yıllık sağkalım oranı %20-%30 gibi düşük bir seviyededir3,4,5. Bununla birlikte, primer osteosarkomun beş yıllık sağkalım oranı, kemoterapinin başlaması nedeniyle 1970'lerden bu yana yaklaşık% 70'e yükselmiştir6. Bu nedenle, yeni tedaviler geliştirmek için osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastazın temel mekanizmasını anlamak acilen gereklidir. İnsanlarda osteosarkom ilerlemesini en iyi taklit eden fare modellerinin uygulanması büyük önem taşımaktadır7.
Osteosarkom hayvan modelleri spontan, indüklenmiş genetik mühendisliği, transplantasyon ve diğer tekniklerle üretilir. Spontan osteosarkom modeli, tümör oluşum süresinin uzaması, tümör oluşum hızının tutarsız olması, düşük morbidite ve düşük stabilite nedeniyle nadiren kullanılmaktadır 8,9. İndüklenmiş osteosarkom modelinin elde edilmesi spontan osteosarkomdan daha erişilebilir olmasına rağmen, indükleyici faktör mikroçevreyi, patogenezi ve osteosarkomun patolojik özelliklerini etkileyeceğinden indüklenmiş osteosarkom modelinin uygulanması sınırlıdır10. Transgenik modeller, insan fizyolojik ve patolojik ortamlarını daha iyi simüle edebildikleri için kanserlerin patogenezini anlamaya yardımcı olmaktadır; Bununla birlikte, transgenik hayvan modelleri, transgenik modifikasyonun zorluğu, uzun vadeli ve yüksek maliyeti nedeniyle sınırlamalara sahiptir. Dahası, p53 ve Rb gen modifikasyonu ile üretilen en yaygın kabul gören transgenik hayvan modellerinde bile, dört ekstremite kemiğinde sarkomun sadece% 13.6'sımeydana geldi 11,12.
Transplantasyon, basit manevrası, stabil tümör oluşum hızı ve daha iyi homojenliği nedeniyle son yıllarda en sık kullanılan primer ve uzak metastatik kanser modeli üreten yöntemlerden biridir13. Transplantasyon, heterotopik transplantasyonu ve transplantasyon bölgelerine göre ortotopik transplantasyonu içerir. Osteosarkom heterotopik transplantasyonunda, osteosarkom hücreleri, hayvanların primer osteosarkom bölgelerinin (kemik) dışına, genellikle deri altına, deri altından enjekte edilir14. Heterotopik transplantasyon, hayvanlarda ameliyat yapmaya gerek kalmadan basit olmasına rağmen, osteosarkom hücrelerinin enjekte edildiği bölgeler gerçek insan osteosarkom mikro ortamını temsil etmemektedir. Osteosarkom ortotopik transplantasyonu, osteosarkom hücrelerinin tibia15,16 gibi hayvanların kemiklerine enjekte edilmesidir. Heterotopik greftlerle karşılaştırıldığında, ortotopik osteosarkom greftleri kısa bir kuluçka süresi, hızlı büyüme ve güçlü eroziv doğa ile karakterizedir; bu nedenle, osteosarkomla ilgili çalışmalar için ideal hayvan modelleridir17.
En sık kullanılan hayvanlar fareler, köpekler ve zebra balığıdır18,19. Osteosarkomun spontan modeli genellikle köpeklerde kullanılır, çünkü osteosarkom köpeklerde en sık görülen tümörlerden biridir. Bununla birlikte, bu modelin uygulanması uzun tümör oluşum süresi, düşük tümörigenez hızı, zayıf homojenlik ve stabilite nedeniyle sınırlıdır. Zebra balıkları genellikle hızlı üremeleri nedeniyle transgenik veya nakavt tümör modelleri oluşturmak için kullanılır20. Ancak zebra balığı genleri insan genlerinden farklıdır, bu nedenle uygulamaları sınırlıdır.
Bu çalışma, atimik farelerde osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla pulmoner metastaz ile tibiadaki primer osteosarkomun üretilmesi için ayrıntılı prosedürleri, önlemleri ve temsili görüntüleri açıklamaktadır. Bu yöntem, terapötik etkinlik değerlendirmesi için fare tibiasında primer osteosarkomu oluşturmak için uygulandı ve bu da yüksek tekrarlanabilirlikgösterdi 21,22.

<table><tbody><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>Sayma hücreleri</td></tr><tr><td>Anestezi makinesi</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>Anestezi farelerinin ekipmanları</td></tr><tr><td>BALB/c atletik fareler</td><td>Şangay SLAC Laboratuvar Hayvanları Co, Ltd.</td><td>/</td><td>hayvan</td></tr><tr><td>Bodrum Membran Matrisi</td><td>Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>356234, BD, Matrigel</td><td>hücreleri yeniden askıya alıyor</td></tr><tr><td>Biyolüminesans görüntüleme sistemi</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>, enjeksiyon hücresi lusiferaz ile etiketlenmişse, tümör büyümesini ve pulmoner metastazı izler</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü (15 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning</td><td>Santrifüj hücreleri</td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Anestezi fareleri</td></tr><tr><td>MEM ortamı</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>LM-E1141</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Mikro hacimli şırınga</td><td>Şangay yüksek güvercin sanayi ve ticaret A.Ş., Ltd</td><td>0-50 &mu; L</td><td>Kaval kemiğine hassas hücreler enjekte</td></tr><tr><td>edin Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>ST447</td><td>insan osteosarkom hücrelerini yıkayın</td></tr><tr><td>1ml şırınga</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>sondaj</td></tr><tr><td>143B hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td>osteosarkom hücre hattı</td></tr><tr><td>Tripsin (% 0.25)</td> <td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>25200056, hücrelerin Gibco</td><td>tripsin tedavisi</td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Beyotime Biyoteknoloji</td><td>ST798</td> Aktivite vektörünü <td>değerlendirmek için boyama hücreleri</td></tr><tr><td>(pLV-lusiferaz)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plazmid</td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>Plazmid transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>X-ışını görüntüleme sistem</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>Tümör büyümesini tespit etmek için X-ışını görüntüleri elde edildi</td></tr></tbody></table>

ortotopik osteosarkom ve akciğer metastazı fare modelleri oluşturmak için İntratibiyal osteosarkom hücre enjeksiyonu

Intratibial Osteosarcoma Cell Injection to Generate Orthotopic Osteosarcoma and Lung Metastasis Mouse Models

Osteosarkom, çocuklarda ve ergenlerde en sık görülen primer kemik kanseridir ve akciğerler en sık metastatik bölgedir. Pulmoner metastazı olan osteosarkomlu hastaların beş yıllık sağkalım oranı %30'dan azdır. Bu nedenle, insanlarda osteosarkom gelişimini taklit eden fare modellerinin kullanılması, osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastazın temel mekanizmasını anlamak ve yeni terapötikler geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Burada, osteosarkom hücrelerinin intratibia enjeksiyonu yoluyla primer osteosarkom ve pulmoner metastaz fare modellerini oluşturmak için ayrıntılı prosedürler bildirilmiştir. Biyolüminesans veya X-ışını canlı görüntüleme sistemi ile birlikte, bu canlı fare modelleri, osteosarkom büyümesini ve metastazını izlemek ve ölçmek için kullanılır. Bu modeli oluşturmak için, osteosarkom hücrelerini içeren bir bazal membran matrisi mikro hacimli bir şırıngaya yüklendi ve anestezi uygulandıktan sonra her bir atimik farenin bir tibiasına enjekte edildi. Fareler, birincil osteosarkom IACUC onaylı protokolde boyut sınırlamasına ulaştığında kurban edildi. Osteosarkom taşıyan bacaklar ve metastaz lezyonu olan akciğerler ayrıldı. Bu modeller kısa bir inkübasyon süresi, hızlı büyüme, ciddi lezyonlar ve primer ve pulmoner metastatik lezyonların gelişimini izlemede duyarlılık ile karakterizedir. Bu nedenle, bunlar osteosarkom karsinogenezi ve pulmoner metastaz, tümör mikroçevresi spesifik faktörlerin fonksiyonlarını ve mekanizmalarını araştırmak ve in vivo terapötik etkinliği değerlendirmek için ideal modellerdir.

Başarılı ortotopik (primer) osteosarkom ve metastatik pulmoner modeller, osteosarkom hücrelerinin doğru ortotopik enjeksiyonuna bağlıdır. Burada intratibiyal osteosarkom hücre enjeksiyonu ile ortotopik (primer) osteosarkom modeli başarıyla geliştirilmiştir. Şekil 3A , ortotopik (birincil) osteosarkom taşıyan temsili bir fareyi ve Şekil 3B , temsili izole edilmiş bir ortotopik (birincil) osteosarkomu göstermektedir. Tümör hacmi haftada bir kez kumpas ile...

Bu protokol, ortopik osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturmak için intratibia osteosarkom hücre enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Osteosarcoma is the most common primary bone cancer in children and adolescents, with lungs as the most common metastatic site. The five-year survival ...

Bu protokol, primer osteosarkom ve pulmoner metastaz lezyonlarını taşıyan fare modelleri oluşturma tekniğini açıklar. Osteosarkom hücrelerinin intratibiyal enjeksiyonu ile, bu model tümör osteosarkomunun klinik gelişim özelliklerini en iyi şekilde taklit eder. Doğru sayıda osteosarkom hücresi, aynı tümör oluşum hızlarına ve tümör hacimlerine izin veren bir mikro hacimli şırınga kullanılarak tibiaya doğrudan enjekte edilir.Osteosarkom hücre enjeksiyonu gününde, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri üç dakika boyunca 1.5 mililitre% 0.25 tripsin ile tripsinize edin. Daha sonra altı mililitre% 10 serum içeren MEM ortamı ekleyin.Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Hücre sayma plakasının odasına 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu aspire edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800 kez g'de santrifüj yapın.Süpernatantı bir pipetle aspire edin, hücre peletini mililitre başına 8.5 miligramlık bir bazal membran matrisinde yeniden askıya alın ve buzun üzerine yerleştirin. Fareyi sırtüstü konuma getirin. Başparmak ve işaret parmağını kullanarak farenin ayak bileğini tutun ve tibianın enjeksiyon bölgesini %70 etanol çubukla dezenfekte edin.Tibia ve fibulayı hareket ettirmek için her farenin ayak bileği eklemini dışa doğru döndürün ve proksimal tibia platosu deriden görünene kadar diz eklemini uygun bir konuma getirin. İğneyi bir mililitrelik bir şırıngaya takın ve iğne ucunu tibia eksenine paralel olarak enjeksiyon bölgesine doğru doğrultun. Tibia platformundan tibianın distal ucuna doğru bir delik açmak için iğneyi perkütan olarak yerleştirin.Daha önce buz üzerine yerleştirilen osteosarkom hücre süspansiyonunu bir mikro hacimli şırıngaya yükleyin ve tibiadaki bir mililitrelik şırıngayı osteosarkom hücresi yüklü mikro hacimli şırınga ile değiştirin. Çok fazla basınç uygulamadan her bir atimik farenin tibiasına yaklaşık 10 mikrolitre osteosarkom hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin. Daha sonra mikro hacimli şırıngayı enjeksiyon bölgesinden çıkarın ve bölgeye pamuklu çubukla yaklaşık 30 saniye boyunca bastırın.Fareyi tekrar temiz bir kafese yerleştirin ve iyileşmesini 10 dakika boyunca gözlemleyin. Bu şekil, intratibial osteosarkom hücre enjeksiyonundan geliştirilen ortotopik osteosarkomlu fare modelini ve izole formunu göstermektedir. Her hafta tümör hacminde kademeli bir artış gözlenir.Lusiferaz etiketli osteosarkom hücrelerinin enjeksiyonundan sonraki ilk haftadan altıncı haftaya kadar elde edilen X-ışını görüntüleri, hacimde kademeli bir artış gösterdi. Ayrıca, fare tibisine enjeksiyondan sonra elde edilen görüntü, in vivo olarak ortopik osteosarkom büyümesi gösterdi. Osteosarkom hücrelerinin intratibiyal enjeksiyonunun neden olduğu pulmoner metastazı, biyolüminesans canlı görüntüleme sistemi kullanılarak in vivo olarak başarıyla izlendi.Stereomikroskop altında yapılan gözlem, izole akciğer dokularında metastatik koloniler olduğunu ortaya koydu. Parafin gömülü akciğer dokularında HE boyaması metastatik lezyonlar gösterdi. İğne, şırıngayı döndürerek tibia platformundan dijital tibiaya doğru bir delik açmak için patellar ligament yoluyla eklem kapsülüne perkütan olarak sokulmalıdır.

intratibial-osteosarcoma-cell-injection-to-generate-orthotopic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama...

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Video, bir fare modelinde meme kanseri ortotopik aşılama tekniğini göstermektedir. Bu teknik, deri altı veya cerrahi olmayan enjeksiyona kıyasla tümör boyutu ve şeklinde daha az değişkenlik ile yüksek bir tümör oluşumu oranı üretir.

Ortotopik Enjeksiyon: Dokuya Özgü Kanser Hücrelerinin Yetişkin Bir Fareye İmplante Edilmesi

Kanser tümörü çevreleyen dokunun hem de yerel pro- ve anti-inflamatuar aracılar tarafından etkilenir kompleks bir hastalıktır. Bu nedenle, daha çok deri altı modellere göre ortotrop enjeksiyon modelleri, bir şekilde daha iyi taklit eden insan patoloji kanser ilerlemesinin incelemek için yararlı olabilir.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Bu el yazması, deneysel kemik metastazları oluşturmak için kanser hücrelerini özellikle kemikler de dahil olmak üzere arka bacak dokularına iletmek için bir teknik olan intra-iliak arter (IIA) enjeksiyonunun ayrıntılı prosedürünü sağlar. Başlangıçta meme tümörü modelleri ile oluşturulmuş olsa da, bu protokol diğer kanser türlerine de kolayca genişletilebilir.

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Bu makalede, pulmoner metastaz tahlil (PuMA) Protokolü'nün ayrıntılı bir açıklama sağlamak için hedeftir. Bu model araştırmacılar metastatik osteosarkom (OS) hücre büyümesini widefield floresan veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak akciğer dokusunda çalışmaya izin verir.

Metastatik akciğer kolonizasyon pulmoner metastaz tahlil kullanarak osteosarkom içinde eğitim pratik düşünceler

Burada, bir protokol indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) üretimi için Li-Fraumeni sendromu (LFS) hasta türetilmiş fibroblastlar, iPSCs mezenkimal kök hücre (MSCs) yoluyla farklılaşma üzerinden dokusunu ve modelleme içinde vivo mevcut LFS hasta kaynaklı dokusunu kullanarak tumorigenesis.

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Burada, biz meme kanseri hücrelerinin basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine implant için bir protokol mevcut ve bu fare orthotopic meme kanseri model uygun meme yağ yastığı yapısına sahip çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir kanser.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Burada, metastaz biyolojisinin preklinik araştırılması ve yeni terapötiklerin gelişimi için kullanılabilecek spontan pulmoner metastaz ile osteosarkomun amputasyon prosedürünün ardından singeneik ortotopik implantasyon tanımlanmıştır.

Metastaz Oranını Kontrol Etmek için Amputasyonlu Syngeneic Ortotopik Osteosarkom Sprague Dawley Sıçan Modeli

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Mevcut protokol, insan osteosarkom dokusu kullanılarak hasta kaynaklı bir ksenogreft (PDX) fare modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır.

İnsan Osteosarkom Dokuları ile Hasta Kaynaklı Ksenogreft Fare Modelinin Kurulması

Öğrenin, intratibiyal enjeksiyonla farelerde primer osteosarkom ve akciğer metastazı modelleri oluşturmayı. Bu yöntem, tümör gelişimini klinik özelliklerine uygun şekilde taklit eder ve tedavi stratejilerinin test edilmesine olanak tanır.

Ortotopik Osteosarkom ve Akciğer Metastazı Fare Modelleri Oluşturmak için İntratibiyal Osteosarkom Hücre Enjeksiyonu

Daha fazla video keşfet