Bant Yöntemi ve El Tipi Mikrodizileyici Kullanılarak Doku Mikrodizisinin Manuel Yapımı

Doku mikrodizisi veya TMA, donör bloklar olarak adlandırılan formalin sabit parafin gömülü doku bloklarından doku çekirdekleri olarak bilinen küçük örnek doku parçalarını tek bir parafin bloğunda birleştiren önemli bir araştırma aracıdır. Bant yöntemi, bloğu dik çekirdeklerin etrafına dökerek inşaat sürecini tersine çeviren ve bu nedenle ideal olmayan donör bloklarla uyumlu olan ve ucuz, yaygın olarak bulunan tek kullanımlık el tipi doku mikrodizileyicileri kullanan tamamen manuel bir yapım yöntemidir. Bu sürecin çok adımlı iş akışı Bay Lee Wisner ve Dr. Brandon Larsen tarafından gösterilecektir.

TMA blokları inşa edilirken hatırlanması gereken en önemli kavramlardan biri, formalin sabit parafin gömülü doku bloklarındaki dokuların aslında üç boyutlu yapılar olduğu gerçeğidir. Bu kavramı açıklamaya yardımcı olmak için burada bir animasyon geliştirdik. Burada gördüğünüz şey, blok içindeki bu dokunun üç boyutlu doğasını gösteren formalin sabit parafin gömülü doku bloğunu gösteren bir animasyondur.

Dokunun bloğun tepesinde görünür olduğunu ve o alanın oldukça büyük olduğunu görebilirsiniz. Eğer X-ışını görüşüne sahip olabilseydik, olduğu gibi ve bloğun içini görebilseydik, dokunun aslında o blok içinde daha derine düzgün bir şekilde şekillenmediğini, neredeyse okyanustaki bir buzdağı gibi, yüzeyde gördüklerinizin aslında aşağıda olanı temsil etmeyebileceğini görebilirdik. Bu doku bloğu içinde, yüzeyde görünmeyen ek doku parçaları olabilir.

Bu dokunun merkezinde daha derinlerde nekroz veya doku ölümü alanları olabilir. Bir patolog aslında bu doku bloğunun üstündeki iki boyutlu bölümü gözden geçirmeli ve daha sonra ilgilenilen dokuyu içeren alanları göstermek ve nekrozu veya aslında ilgi çekici olmayan diğer doku türlerini hariç tutmak için bu slayta açıklama eklemelidir. Dokunun uygun çekirdek örneklemesini kolaylaştırmak için, patolog üç şey yapmalıdır.

İlk olarak, bir slayt işaretleme kalemi kullanarak, patolog slayttaki ilgili dokuyu işaretleyecek, böylece diğer dokulardan kaçınılabilecektir. İkincisi, bu ilgi alanında kaçınılması gereken alanlar varsa, patolog örneklenememesi gereken alanları lekelemek için aynı işaretleme kalemini kullanabilir. Ve son olarak, tercihen farklı bir kalem rengi kullanarak, patolog çekirdek örneklemesi ve TMA yapımı için ilgi alanı içinde ideal olan alanları işaretlemelidir.

Bu işlem yapıldığında, doku bileşiminin bir çekirdek numunenin elde edildiği yerden daha derine inebileceğini ve bunu burada animasyonda göstereceğimizi, çekirdeğin konumunun o çekirdeğin bileşimini belirleyeceğini, dokunun derinliğine ve o bloğun içinde bulunanlara göre değişeceğini akılda tutmak önemlidir. Örneğin, burada gösterdiğimiz ilk çekirdek, dokunun bir kısmını üst yarısında yakalamaktır, ancak bloğun derinliklerinde, bu çekirdeğin elde edildiği yerde artık herhangi bir doku yoktur, bu nedenle sadece parafin mumu örneklenmiştir. Burada gösterdiğimiz ikinci çekirdek, tüm uzunluğu boyunca dokuyu yakalamıştır, çünkü doku, o yerde o bloğun tüm derinliği boyunca mevcuttur.

Üçüncü çekirdek, dokunun bir kısmını yakaladı ve daha sonra ortada hiçbir dokunun bulunmadığı yerde parafin mumunun bir kısmını yakaladı ve daha sonra bu bloğun alt kısmında doku bulunan alt ucunda biraz daha fazla doku yakaladı. Patoloji incelemesi tamamlandıktan sonra, TMA yapımında kullanılacak donör blokların son listesini derleyin, ardından bir TMA haritası oluşturun. TMA haritası, çekirdeklerin tamamlanmış TMA'da ve elde edilen TMA'dan kesilen slayta monte edilmiş doku bölümlerinde nerede bulunacağını gösteren şematik bir taslaktır.

Oryantasyon amacıyla, TMA haritasının çekirdekleri üçe üç veya dörde dört matris gibi eşit bir matrise yerleştirmekten kaçındığından ve en az bir yönlendirme işaretçisi içerdiğinden emin olun. Bant yöntemi, ters çevrilmiş çekirdeklerin etrafına erimiş balmumu dökerek inşaat sürecini tersine çevirdiğinden, bu TMA haritasının ayna görüntüsü olan inşaat haritası olarak bilinen ikinci bir haritanın oluşturulmasını gerektirir. İnşaat haritası, tamamlanan TMA'da doğru yerde görünmesi için inşaat sırasında her bir çekirdeğin nereye yerleştirilmesi gerektiğini gösterir.

Haritalar oluşturulduktan sonra, metal TMA taban kalıbını hazırlayın. Çekirdek yerleşimini yönlendirmek için tek kullanımlık kağıt damalı ızgara kullanın. Kağıt damalı ızgarayı boyuta göre kesin ve ızgaranın arkasına bir parça çift yapışkanlı bant yapıştırın.

Izgarayı ve bandı metal tepsiye yerleştirin ve ızgaranın üzerine ikinci bir çift yapışkanlı bant parçası ekleyin. Patoloji tarafından gözden geçirilmiş H&E slaytını delinecek FFPE doku bloğu üzerine yerleştirin ve doku bloğunun nerede delineceğini belirlemek için patologun işaretlerini kullanın. Tek kullanımlık veya yeniden kullanılabilir bir el tipi manuel çekirdek zımba kullanarak, FFPE donör bloğunu uygun bölgede delin.

Yeniden kullanılabilir bir çekirdek zımba kullanıyorsanız, her doku zımbasından önce ve sonra temizlendiğinden emin olun. Çekirdeği çekirdek zımbadan çıkarın. Çıkarılan çekirdeği çift yapışkanlı bant kaplı ızgaranın artı işaretlerine yerleştirmek için bir iğne çekme işlemi kullanın.

Çekirdeğin, çekirdeğin doku ucu bantla temas edecek ve inşaat haritasında belirtildiği gibi doğru konumda olacak şekilde ters çevrilmiş, dik bir şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Tüm donör bloklar özlü hale gelene ve çekirdekler uygun konumlarına yerleştirilene kadar tekrarlayın. Tüm çekirdekler yerleştirildikten sonra, plastik bir kaseti etiketleyin ve çekirdekleri içeren metal tabanın üzerine yerleştirin.

Çekirdeklerin yüksekliği metal tepsinin derinliğini geçmemelidir, çünkü kaset yerleştirildiğinde uzun çekirdekler eğilir veya devrilir. Erimiş parafin'i kasetten yavaşça çekirdeklerin tepsisine dökün. TMA'nın gövdesinde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için erimiş parafinin taşmasına izin verin.

Parafinin kasetin üst kısmına dolduğundan emin olun, böylece kaset gömülür ve katılaştıktan sonra parafin bloğuna sıkıca bağlanır. Bloğun oda sıcaklığında 30 dakika soğumasını bekleyin ve bu süre zarfında bloğu hareket ettirmeyin. Tamamen katılaşması için bloğu dört santigrat derecede 30 dakika daha soğutun.

Tamamen ayarlandıktan sonra, metal taban kalıbını yavaşça ayırın ve çift yapışkanlı bandı parafin bloğundan çıkarın. TMA oluşturulduktan sonra, yeni TMA'yı kesmek için bir mikrotom kullanın. Blok uygun şekilde yüzleştikten sonra, tam yüz doku bölümlerini toplayın.

Bölümleri önceden ısıtılmış bir su banyosuna aktarın ve doku bölümlerini kaydırarak monte edin. Kuruduktan sonra, H&E boyama ve gerekli olabilecek ek immünohistokimyasal lekeler için temsili bölümler gönderin. Lekeli TMA kesitlerini patolojik inceleme için gönderin.

TMA doğrulaması için, patolog TMA bloğundan H&E slaytını gözden geçirmeli ve ilgilenilen dokunun mevcut olup olmadığını görmek için mikroskop altında her dairesel noktayı gözden geçirmelidir. İnşaat sürecinin kritik bir bileşeni, TMA çekirdeğinin elde edilmesi gereken belirli bir donör bloğundaki ilgili dokuların tanımlanmasıdır. Bu şeklin ilk sütunu, patologun işaretleriyle örnek donör H&E'yi göstermektedir.

İkinci sütun, H&E lekeli dokuların delinmiş alanını göstermektedir. Üçüncü sütun, birinci ve ikinci sütunlarda gösterilen alanlardaki donör bloklardan toplanan TMA çekirdeklerinin H & E lekeli dokusunu göstermektedir. Patolog, ilgili alanın toplandığını ve doku kompozisyonunun aynı olduğunu doğrulamak için eşleşen donör bloğunu ve TMA çekirdek H & E'sini birlikte görüntüleyebilir.

Bir TMA'nın bant yöntemiyle başarıyla tamamlanması için iki temel ölçüt vardır. Birincisi, görsel inceleme ile değerlendirilen, beklenen pozisyonlarda ve birbirinden uzak mesafede doku çekirdeği noktalarının varlığıdır. A ve B'de gösterilen görüntüler, başarıyla tamamlanan iki bant yöntemi TMA'sını ve ilgili H&E slaytlarını göstermektedir.

Bu TMA bloklarının görsel incelemeleri, çekirdeklerin her TMA ve bunlara karşılık gelen bölümlerde mevcut olduğunu ve düzenli olarak aralıklı olduğunu göstermektedir. Bant yöntemi yapım sürecinde ortaya çıkabilecek başlıca inşaat sorunlarından bazıları, katılaşmadan önce metal tabanın erken çıkarılması nedeniyle blok ve kasetin ayrılmasını içerir, resimde gösterildiği gibi C.Çekirdek devrilmesi ve / veya gömülü çekirdeklerin yerleştirilmesi sürüklenmesi, erimiş parafinin aşırı çalkantılı dökülmesi sırasında meydana gelebilir, zayıf yapışkanlı çift taraflı çubuk bant ile daha da kötüleşebilir. Bu şekil, çekirdeklerin her biri için H&E lekesinin örnek bir TMA olduğunu göstermektedir.

Temel noktalardan biri hariç hepsi H&E'de mevcuttur. Şekil ayrıca, bazı çekirdeklerin tam dairesel doku noktaları olarak mevcut olduğunu, diğerlerinin ise tamamen mevcut olmadığını göstermektedir. Bu tür doku kaybı nadir değildir ve tüm çekirdekleri tam olarak ortaya çıkarmak için yetersiz blok yüzeyinden kaynaklanabilir.

Alternatif olarak, eksik veya toplam doku yokluğunun varlığı, o çekirdeğin düşük doku kalitesinden kaynaklanabilir ve bu da boyama işlemi sırasında doku kaybına neden olabilir. Bir sonraki şekilde, TMA'yı daha da doğrulamak için TMA kesitlerinde immünohistokimya ve RNA ISH boyaması yapıldı. Burada gösterildiği gibi, TMA'yı oluşturmak için kullanılan dokuya bağlı olarak çeşitli lekeler kullanılabilir.

Vimentin kalite kontrol olarak kullanılır. U6, RNA kalitesinin bir göstergesidir. EBER EBV durumunu belirlemek için kullanılır.

CD20, B hücrelerinin varlığını gösteren bir B hücresi belirtecidir. Bunlar, TMA'nızı doğrulamaya yardımcı olmak için kullanılabilecek birkaç lekedir. Bu videoyu izledikten sonra, bant yöntemini kullanarak bir doku mikrodizisinin nasıl yapılacağını ve TMA'ların neden önemli zaman ve kaynak tasarrufu sağlayan araştırma araçları olduğunu anlamalısınız.

TMA yapımının ideal bir süreç olmadığını ve devam eden patolojik rehberlik ve gözden geçirmenin sadece yapım sürecinde değil, aynı zamanda ilgilenilen dokunun TMA bölümünde gerçekten mevcut olmasını sağlamak için TMA kesitleri üzerinde yapılan immünohistokimyasal çalışmalar için de kritik bileşenler olduğunu anlamalısınız.