Name: Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Öğrenin karaciğer glikojen moleküllerinin ekstraksiyonunu, yapıyı koruyarak ve küçük partikül kaybını sınırlayarak. Bu yöntem, diyabet ve glikojen depo hastalıklarının incelenmesine yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, FACE ile teknik yardım için Bay Gaosheng Wu ve Bayan Yunwen Zhu'ya ve SEC ile teknik yardım için Bay Zhenxia Hu ve Bay Dengbin'e minnettardır. Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Programı, Çin Doğa Bilimleri Vakfı hibe C1304013151101138 ve 2017 Jiangsu İnovasyon ve Girişimcilik yetenekleri programı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1-5 BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Bu prosedürü optimize etmek için kullanılan fare karaciğerleri21 , 12 erkek BKS-DB / Nju arka plan faresinden alınmıştır (7.2 haftalık, Malzeme Tablosuna bakınız). Hayvan kullanımı, Wuhan Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi, IACUC Sayı No. WDRM 20181113.
1 Hayvan dokuları
<ol><li>Fare karaciğerini tartın (her fareden 1-1.8 g tam karaciğer).</li>
	<li>Fare karaciğerini sıvı nitrojen içinde hızla dondurun ve -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Tampon ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Deiyonize su ile 5 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF ve 5 mM sodyum pirofosfat içeren glikojen izolasyon tamponu hazırlayın ve pH'ı 8'e ayarlayın.</li>
	<li>% 30 (a/a) sükroz çözeltisi hazırlayın (karaciğer glikojeni21 için en uygun olduğu bulunmuştur).</li>
	<li>Sodyum asetat tamponu (1 M, pH 4.5), asetik asit tamponu (0.1 M, pH 3.5), sodyum hidroksit çözeltisi (0.1 M) ve sodyum siyanoborohidrit (1 M) hazırlayın.</li>
	<li>50 μL% 15 buzlu asetik aside 5 mg APTS ekleyerek 8-aminopiren-1,3,6-trisülfonat (APTS) çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>% 0.02 sodyum azid içeren 50 mM amonyum nitrat içeren amonyum nitrat çözeltisi hazırlayın.</li>
</ol>3. Glikojen ekstraksiyonu (Şekil 2)
<ol><li>Donmuş karaciğer dokusunu (~ 1 g) 6 mL glikojen izolasyon tamponu içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Buz üzerinde tutarak, bir doku homojenizatörü kullanarak karaciğer dokusunu homojenize edin.</li>
	<li>Süspansiyonun yarısını (3 mL) yeni bir tüpe aktarın ve 10 dakika kaynatın (glikojen yapısal çalışmaları için en uygun olduğu gösterilmiştir21). Denatüre olmayan ilişkili proteinleri içeren glikojeni çıkarmak için süspansiyonun diğer yarısını (3 mL) buz üzerinde tutun. NOT: Kaynatılmamış numuneler, glikojen ekstraksiyon adımları sırasında her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Glikojen proteinleri çalışma için önemli değilse, tüm numune 10 dakikalık kaynatma adımından geçebilir.</li>
	<li>Her tüpten 8 μL'lik bir alikot çıkarın, alikotları buz üzerinde tutun ve glikojen içeriği tayini için kullanın (bkz. bölüm 4).</li>
	<li>Kalan süspansiyonu 6.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanları ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 90 dakika boyunca 3.6 ×10 5 g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Kalan süpernatanları atın ve peletleri 1.5 mL glikojen izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Numuneleri 4 mL ultrasantrifüj tüplerinde 1,5 mL %30 sükroz çözeltisi üzerine koyun ve 4 °C'de 2 saat boyunca 3,6 ×10 5 g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Kalan süpernatanları atın ve peletleri 200 μL deiyonize suda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Süspansiyonlara 800 μL mutlak etanol ekleyin ve glikojen 23,24'ü çökeltmek için iyice karıştırın. Karışımları -20 °C'de en az 1 saat bekletin.</li>
	<li>Numuneleri 6.000 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları atın ve peletleri 200 μL deiyonize suda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bu etanol çökeltme işlemini 3 kez tekrarlayın ve son glikojen peletini 200 μL deiyonize suda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Glikojen içeriğinin belirlenmesi için her tüpten 8 μL'lik bir alikot çıkarın (bkz. bölüm 4).</li>
	<li>Kalan süpernatanları sıvı nitrojen içinde dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutun (liyofilize). Kuru glikojen örneklerini dondurucuda -20 °C'de saklayın. NOT: Kuru glikojen numuneleri -20 °C'de stabil olmalıdır; Bununla birlikte, herhangi bir yapısal değişiklik olmadan ne kadar sürdüklerini gösteren hiçbir veri yoktur.</li>
</ol>4. Glikojen miktarı tayini (Şekil 3)
<ol><li>Bir mikrosantrifüj tüpüne 8 μL glikojen süpernatan, (bkz. bölüm 3.13 ve 3.4), 5 μL amiloglukozidaz (3269 U/mL) ve 100 μL sodyum asetat tamponu (1 M, pH 4.5) ekleyin ve tüpü deiyonize su ile 500 μL işaretine kadar doldurun.</li>
	<li>Amiloglucosidaz yerine deiyonize su kullanan kontroller hazırlayın.</li>
	<li>Numuneleri 50 °C'de 30 dakika inkübe edin ve kontrolleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>10 dakika boyunca 4 ° C'de 6.000 × g'da santrifüjleyin ve elde edilen her süpernatantın 300 μL'sini 1 mL glukozidaz oksidaz / peroksidaz (GOPOD) reaktifi ile karıştırın.</li>
	<li>0, 10, 20, 30, 40 ve 50 μg D-glikoz içeren 300 μL deniyonize suyu 1 mL GOPOD reaktifi ile karıştırarak bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.</li>
	<li>Karışımları 50 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Bir UV-vis spektrofotometresi kullanarak 96 oyuklu plakalar (kuyucuk başına 150 μL) kullanarak her numunenin absorbansını (510 nm) okuyun.</li>
	<li>Kontrol numunelerinin absorbanslarını (amiloglukozidaz içermeyen) deneysel numunelerin absorbanslarından çıkarın, ardından D-glikoz standart eğrisine dayalı olarak glikojen içeriğini hesaplayın.</li>
</ol>5. Ham verim, glikojen verimi ve saflık tayini
<ol><li>Ham verim için, dondurularak kurutulmuş glikojen örneğini tartın ve verimi ıslak karaciğer dokusunun yüzdesi olarak hesaplayın. NOT: Bu verim, her glikojen içeriği adımında alınan alikotları düzeltecek şekilde ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Glikojen saflığı için, bölüm 4'te açıklandığı gibi nihai peletlerdeki glikojen içeriğini belirleyin. Saflığı, ham verime göre belirlenen glikojen içeriğinin yüzdesi olarak hesaplayın (bkz. adım 5.1).</li>
	<li>Glikojen verimi için, homojenize numunelerin glikojen içeriğini kaynatmadan ve herhangi bir santrifüjlemeden önce, bölüm 4'te açıklandığı gibi belirleyin. Glikojen verimini, son peletlerdeki glikojen içeriğinin yüzdesi olarak hesaplayın (bkz. adım 5.2) ilk homojenatta belirlenen glikojen içeriğinin yüzdesi.</li>
</ol>6. Zincir uzunluğu dağılımlarının analizi (Şekil 4)
<ol><li>1,5 mL'lik tüplerde 0,5 mg dondurularak kurutulmuş glikojen tartın.</li>
	<li>Tüplere 90 μL deiyonize su ve 1.5 μL sodyum azid (0.04 g/mL) ekleyin.</li>
	<li>Glikojeni ayırmak için tüplere 5 μL asetik asit tamponu (0.1 M, pH 3.5) ve 2 μL izoamilaz çözeltisi (180 U / mg) ekleyin.</li>
	<li>Numuneleri 37 °C'de 3 saat inkübe edin.</li>
	<li>pH'ı 7.0'a çıkarmak için numunelere 5 μL sodyum hidroksit çözeltisi (0.1 M) ekleyin.</li>
	<li>Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutun (liyofilize edin).</li>
	<li>Dondurularak kurutulmuş dalları alınmış glikojene 2 μL APTS çözeltisi (50 μL %15 buzlu asetik asit içinde 5 mg APTS) ve 2 μL sodyum siyanobororohidrit (1 M) ekleyin.</li>
	<li>Numuneleri 4.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Numuneleri karanlıkta 60 °C'de 3 saat inkübe edin. NOT: İçeriği ışıktan korumak için tüp alüminyum folyo ile kaplanabilir.</li>
	<li>Numunelere 200 μL deiyonize su ekleyin ve tüm çökelti çözülene kadar vorteksleyin.</li>
	<li>Numuneleri 4.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Analiz için 50 μL'lik alikotları florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE) mikro şişelerine aktarın. NOT: Veriler, her polimerizasyon derecesi için (dallanmış) zincirlerin (Nde(X)) nispi bolluğu olarak gösterilir (DP, sembol X).</li>
</ol>7. Moleküler boyut dağılımlarının analizi (Şekil 5)
<ol><li>0.5 mg dondurularak kurutulmuş glikojeni 50 mM amonyum nitrat ve 1 mg / mL'de% 0.02 sodyum azid içinde çözün.</li>
	<li>Numuneleri bir termomikserde 80 °C'de 300 rpm'de 3 saat inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri, 0,3 mL/dak akış hızıyla 80 °C'de bir ön kolon ve 1000 şve 10.000 şkolon kullanarak bir SEC sistemine enjekte edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Her elüsyon hacmindeki moleküllerin bağıl ağırlığını belirlemek için bir kırılma indisi detektörü kullanın.</li>
	<li>Molar kütleleri 342 ila 1.22 × 106 arasında değişen pullulan standartlarını (PSS) kullanarak, elüsyon süresini RH'ye(hidrodinamik yarıçap) dönüştürmek için bir SEC evrensel kalibrasyon eğrisi çizin. Diferansiyel kırılma indisi (DRI) detektöründen gelen verileri, Rh'nin bir fonksiyonu olarak bir SEC ağırlık dağılımı w (log Rh) olarak ifade edin.</li>
</ol>

<ol><li>Hills, D. M., Heller, H. C., Hacker, S. D., Hall, D. W., Sadava, D., Laskowski, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHills%2C+DM+%22Life%3A+the+science+of+biology.+12th+edn%22">Life: the science of biology. 12th edn</a>. Freeeman, W. H. , (2020).</li>
<li>Calder, P. C., Geddes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+of+high+molecular+weight+from+mammalian+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Glycogen of high molecular weight from mammalian muscle.</a> Carbohydrate Research. 135 (2), 249-256 (1985).</li>
<li>Rybicka, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosomes+-+The+organelles+of+glycogen+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosomes - The organelles of glycogen metabolism.</a> Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).</li>
<li>Takeuchi, T., Iwamasa, T., Miyayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafine+structure+of+glycogen+macromolecules+in+mammalian-tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Ultrafine structure of glycogen macromolecules in mammalian-tissues.</a> Journal of Electron Microscopy. 27 (1), 31-38 (1978).</li>
<li>Drochmans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologie+du+glycogene+-+etude+au+microscope+electronique+de+colorations+negatives+du+glycogene+particulaire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">Morphologie du glycogene - etude au microscope electronique de colorations negatives du glycogene particulaire.</a> Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).</li>
<li>Besford, Q. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li>
<li>Lumsden, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+structure+of+glycogen+in+some+cyclophyllidean+and+trypanorhynch+cestodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular structure of glycogen in some cyclophyllidean and trypanorhynch cestodes.</a> Journal of Parasitology. 51 (4), 501-515 (1965).</li>
<li>Deng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+diabetic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in diabetic liver.</a> Glycoconjugate Journal. 32 (3-4), 113-118 (2015).</li>
<li>Deng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers%2C+exemplified+by+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular-size+dependence+of+glycogen+enzymatic+degradation+rate+and+its+importance+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Polymer+Journal%22%5BJournal%5D)">The molecular-size dependence of glycogen enzymatic degradation rate and its importance for diabetes.</a> European Polymer Journal. 82 (1), 175-180 (2016).</li>
<li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+structure+in+type+1+diabetic+mice%3A+towards+understanding+the+origin+of+diabetic+glycogen+molecular+fragility%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Glycogen structure in type 1 diabetic mice: towards understanding the origin of diabetic glycogen molecular fragility.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 128, 665-672 (2019).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+control+of+glycogen+metabolism+in+knockout+mice+lacking+the+muscle-specific+protein+phosphatase+PP1G%2FR-GL%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/R-GL.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (8), 2683-2694 (2001).</li>
<li>Stetten, M. R., Katzen, H. M., Stetten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhomogeneity+of+glycogen+as+a+function+of+molecular+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhomogeneity of glycogen as a function of molecular weight.</a> Journal of Biological Chemistry. 122 (2), 587-599 (1956).</li>
<li>Nahorski, S. R., Rogers, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzymic+fluorometric+micro+method+for+determination+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzymic fluorometric micro method for determination of glycogen.</a> Analytical Biochemistry. 49 (2), 492-497 (1972).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structural+features+of+glycogen+in+the+kidneys+of+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Molecular structural features of glycogen in the kidneys of diabetic rats.</a> Carbohydrate Polymers. 229, 115526(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in Escherichia coli.</a> Biomacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li>
<li>Parker, G. J., Koay, A., Gilbert-Wilson, R., Waddington, L. J., Stapleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMP-activated+protein+kinase+does+not+associate+with+glycogen+alpha-particles+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 362, 811-815 (2007).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+structural+analyses+of+purified+glycogen+particles+from+rat+liver%2C+human+skeletal+muscle+and+commercial+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Comparative structural analyses of purified glycogen particles from rat liver, human skeletal muscle and commercial preparations.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 45 (5), 478-482 (2009).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+alpha+and+beta+particles+in+glycogen+using+molecular+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nature of alpha and beta particles in glycogen using molecular size distributions.</a> Biomacromolecules. 11 (4), 1094-1100 (2010).</li>
<li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+non-degradative+method+to+purify+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">A new non-degradative method to purify glycogen.</a> Carbohydrate Polymers. 147 (1), 165-170 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Liu, Q., Wang, L., Gilbert, R. G., Sullivan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+liver+glycogen+extraction+when+considering+molecular+fine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Polymers%22%5BJournal%5D)">Optimization of liver glycogen extraction when considering molecular fine structure.</a> Carbohydrate Polymers. 261, 117887(2020).</li>
<li>Zhao, Y., Tan, X., Wu, G., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+fine+structure+to+identify+optimal+methods+of+extracting+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Starch+-+Starke%22%5BJournal%5D)">Using molecular fine structure to identify optimal methods of extracting starch.</a> Starch - Starke. 72, 1900214(2020).</li>
<li>Shokri-Afra, H., Ostovar-Ravari, A., Rasouli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+classical+assay+method+for+liver+glycogen+fractions%3A+ASG+is+the+main+and+metabolic+active+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improvement of the classical assay method for liver glycogen fractions: ASG is the main and metabolic active fraction.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 20, 4328-4336 (2016).</li>
<li>Kerly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+solubility+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The solubility of glycogen.</a> The Biochemical Journal. 24, 67-76 (1930).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+size-exclusion+chromatography+for+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Improving size-exclusion chromatography for glycogen.</a> Journal of Chromatography A. 1332 (1), 21-29 (2014).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+glycogen+chain+length+correlates+with+insolubility+in+mouse+models+of+polyglucosan-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle glycogen chain length correlates with insolubility in mouse models of polyglucosan-associated neurodegenerative diseases.</a> Cell Reports. 27 (5), 1334-1344 (2019).</li>
<li>Orrell, S. A., Bueding, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+products+obtained+by+various+procedures+used+for+the+extraction+of+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison of products obtained by various procedures used for the extraction of glycogen.</a> Journal of Biological Chemistry. 239 (12), 4021-4026 (1964).</li>
<li>Sullivan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+insights+into+glycogen+alpha-particle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular insights into glycogen alpha-particle formation.</a> Biomacromolecules. 13 (11), 3805-3813 (2012).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Önceki çalışmalar, glikojenin yapısının özellikleri için önemli olduğunu göstermiştir; Örneğin, moleküler boyut, glikojen10'un bozunma hızını etkiler ve zincir uzunluğu dağılımı, çözünürlüğünü26 etkiler. Bu ilişkileri doğru bir şekilde anlamak için, glikojeni, mümkün olduğunca temsili ve hasarsız bir numuneyi izole eden bir prosedürle ekstrakte etmek önemlidir. Geleneksel ekstraksiyon yöntemlerinde ya sıcak alkali koşullar ya da soğuk asit kullanılmıştır. Glikojeni diğer do...

Glikojen, hayvanlarda, mantarlarda ve bakterilerde bulunan karmaşık, hiperdallı bir glikoz polimeridir1. Memelilerde, karaciğer glikojeni, homeostazı koruyan bir kan şekeri tamponu olarak işlev görürken, kas glikojeni, doğrudan enerji sağlamak için kısa süreli bir glikoz rezervuarı görevi görür2. Glikojenin yapısı genellikle üç seviye ile tanımlanır (Şekil 1'de gösterilmiştir): 1. Doğrusal zincirler, (1→4)-α glikozidik bağlar yoluyla glikoz monomerleri tarafından oluşturulur ve dallanma noktaları (1→6)-α glikozidik bağlarla bağlanır; 2. Özellikle iskelet kası gibi dokularda bağımsız glikojen molekülleri olarak işlev gören çok dallı β parçacıkları (~20 nm çapında) 3,4; 3. Karaciğerde5, kalpte 6 ve bazı memeli olmayan türlerde bulunan daha küçük β glikojen birimlerinden oluşan daha büyük α glikojen parçacıkları (çapı300 nm'ye kadar)7. Diyabetik farelerden elde edilen hepatik α partikülleri moleküler olarak kırılgandır, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözündüğünde β partiküllere bozunma eğilimi gösterirken, diyabetik olmayan kontrollerden α partiküller genellikle değişmeden kalır. Bir hipotez, bu kırılganlığın diyabette görülen zayıf kan şekeri dengesini daha da kötüleştirebileceğidir, kırılgan α partikülleri potansiyel olarak daha hızlı bozunan β partikülünün daha yüksek oranlarına neden olur 8,9,10,11.
Geleneksel glikojen ekstraksiyon yöntemleri, karaciğer dokusunu sıcak alkali çözeltiye (TCA)12 veya trikloroasetik asit (TCA) 13 veya perklorik asit (PCA) 14 gibi asit çözeltilerine maruz bırakmanın nispeten sert koşullarını kullanır. Glikojeni karaciğer dokusunun diğer bileşenlerinden ayırmada etkili olmakla birlikte, bu yöntemler kaçınılmaz olarak glikojen yapısını bir dereceye kadar bozar15,16. Bu yöntemler, glikojen içeriğinin kantitatif ölçümü için uygun olsa da, bu yapısal hasar nedeniyle glikojen hakkında yapısal bilgi elde etmeye odaklanan çalışmalar için ideal değildir. Bu yöntemlerin geliştirilmesinden bu yana, sükroz yoğunluk gradyan ultrasantrifüjleme 17,18,19 ile soğuk Tris tamponu (glukozidaz bozunmasını inhibe ettiği gösterilmiştir) kullanan daha hafif bir ekstraksiyon prosedürü geliştirilmiştir. PH ~8'de kontrol edildiğinde, bu yöntem glikojeni önceki prosedürlerde görülen asit veya alkali hidrolize maruz bırakmaz.
Homojenize karaciğer dokusunun sükroz yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjü, glikojen partiküllerini hücre materyalinin çoğundan ayırabilir. Gerekirse, hazırlayıcı boyut dışlama kromatografisi ile ek saflaştırma gerçekleştirilebilir, bu da saflaştırılmış glikojenin bağlı glikojen ile ilişkili proteinlerletoplanmasıyla sonuçlanır 20. Daha hafif koşullara sahip bu yöntemin glikojenin yapısını koruma olasılığı daha yüksek olsa da, glikojenin bir kısmının süpernatantta, özellikle daha az yoğun olan daha küçük glikojen parçacıklarında kaybolmasını önlemek zordur15. Glikojen kaybının bir başka potansiyel nedeni, daha ılıman koşulların bir miktar enzimatik bozunmaya izin vermesi ve bunun sonucunda daha sert ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla daha düşük glikojen verimine neden olmasıdır. Son araştırmalar, glikojen21'in yapısını korumak için karaciğer-glikojen ekstraksiyon yönteminin optimizasyonunu bildirmiştir. Burada, daha düşük sakaroz konsantrasyonlarının daha küçük glikojen partiküllerinin kaybını en aza indirip indirmediğini belirlemek için çeşitli sükroz konsantrasyonları (%30, %50, %72.5) test edildi. Gerekçe, daha düşük yoğunluğun daha küçük, daha az yoğun parçacıkların sakaroz tabakasına nüfuz etmesine ve glikojenin geri kalanıyla birlikte pelette toplanmasına izin vermesiydi.
Bu çalışmada, glikojen bozunma enzimlerinin denatüre olup edilemeyeceğini test etmek için 10 dakikalık kaynatma aşaması olan ve olmayan ekstraksiyon yöntemleri karşılaştırıldı ve bu da kısmi bozunmadan arınmış daha fazla glikojenin ekstraksiyonu ile sonuçlandı. Daha önce yayınlanan bir nişasta ekstraksiyon optimizasyonuna benzer şekilde, ekstrakte edilen glikojenin yapısını belirlemek için tüm moleküler boyut dağılımları ve glikojen zincir uzunluğu dağılımları kullanıldı22. Diferansiyel kırılma indisi (DRI) algılamalı boyut dışlama kromatografisi (SEC), toplam moleküler ağırlığı moleküler boyutun bir fonksiyonu olarak tanımlayan glikojenin boyut dağılımlarını elde etmek için kullanıldı. Florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE), verilen her bir boyuttaki (veya polimerizasyon derecesinin) nispi glukozit zincirlerinin nispi sayısını tanımlayan zincir uzunluğu dağılımlarını analiz etmek için kullanıldı. Bu makale, önceki optimizasyon çalışmasına dayalı olarak karaciğer dokularından glikojen ekstraksiyon metodolojisini açıklamaktadır21. Veriler, glikojen yapısını korumak için en uygun yöntemin, 10 dakikalık bir kaynatma adımı ile% 30'luk bir sükroz konsantrasyonu olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>8-aminopiren-1,3,6-trisülfonat (APTS)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>9341</td><td>0.1 M çözelti</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>695092</td><td>0.1 M, pH 3.5 çözelti</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity SEC sistemi</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, ABD</td><td></td><td>Boyut dışlama kromatografisi (SEC)</td></tr> <tr><td>BKS-DB/Nju arka plan fareleri</td><td>Nanjing Üniversitesi Nanjing Biyomedikal Araştırma Enstitüsü</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz Test Kiti (GOPOD Formatı)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td></td></tr><tr><td>Etilenitrilotetraasetik asit (EDTA)</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Homojenizatör</td><td>IKA</td><td>T 25</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0.1 M çözelti</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>2104</td><td>0.1 M çözelti</td></tr><tr><td>P/ACE MDQ plus sistemi</td><td>Ab Sciex, ABD</td><td></td><td>Florofor destekli karbonhidrat elektroforezi (FACE)</td></tr><tr><td>Kırılma indisi dedektörü</td><td>Optilab UT-rEX, Wyatt, Santa Barbara, CA, ABD)</td><td></td><td>Boyut dışlama kromatografisi (SEC)</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>241245</td><td>1 M, pH 4.5 çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborohidrit</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>156159</td><td>1 M çözelti</td></tr><tr><td>Sodyum florür</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>43617</td><td>0.1 M çözelti</td></tr><tr><td>Sodyum nitrat</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>NISTRM8569</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum pirofosfat</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>V90016</td><td></td></tr><tr><td>SUPREMA ön kolon, 1.000 ve 10.000 kolon</td><td>Polimer Standartları Hizmetleri, Mainz, Almanya</td><td></td><td>Boyut dışlama kromatografisi (SEC)</td></tr><tr><td>Trizma</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T 1503</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman</td><td></td><td>4 mL, Üstü Açık İnce Duvar Ultra Şeffaf Tüp, 11 x 60 mm</td></tr></tbody></table>

glikojen yapısının belirlenmesi için karaciğer glikojen moleküllerinin ekstraksiyonu

The Extraction of Liver Glycogen Molecules for Glycogen Structure Determination

Karaciğer glikojeni, hayvanlarda kan şekeri seviyelerinin korunmasında rol oynayan hiperdallı bir glikoz polimeridir. Glikojenin özellikleri yapısından etkilenir. Bu nedenle, temsili glikojen örneklerini izole eden uygun bir ekstraksiyon yöntemi, bu makromolekülün incelenmesi için çok önemlidir. Diğer ekstraksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, sükroz yoğunluk gradyanlı santrifüjleme adımı kullanan bir yöntem moleküler hasarı en aza indirebilir. Bu yönteme dayanarak, yakın tarihli bir yayın, santrifüjleme sırasında kullanılan sakaroz çözeltisinin yoğunluğunun, çok çeşitli boyutlardaki glikojen parçacıklarını ekstrakte etmek için en uygun konsantrasyonu bulmak için nasıl değiştirildiğini (%30, %50, %72.5) açıklamaktadır. Glikojen parçalayıcı enzimleri denatüre etme yeteneğini test etmek ve böylece glikojeni korumak için 10 dakikalık bir kaynatma aşaması tanıtıldı. En düşük sükroz konsantrasyonunun (% 30) ve kaynatma aşamasının eklenmesinin, en temsili glikojen örneklerini çıkardığı gösterilmiştir.

Yukarıda açıklanan prosedür en uygun yöntem için olsa da (10 dakikalık bir kaynatma aşamasının eklenmesiyle% 30 sakaroz), burada daha önce açıklandığı gibi kaynatma aşaması olan ve olmayan üç sükroz konsantrasyonu (% 30,% 50,% 72.5) yoluyla ekstrakte edilen glikojen için veriler sağlanmaktadır21. Protokolü takiben, farklı koşullarla ekstrakte edilen kuru glikojenin saflığı, ham verimi ve glikojen verimi,21'den çoğaltılan Tablo 1'de verilmiştir. Çeşitli koşu...

Sükroz yoğunluk gradyan santrifüjlemesi kullanılarak karaciğer glikojeninin ekstraksiyonu için optimal bir sükroz konsantrasyonu belirlendi. Glikojen parçalayıcı enzimleri inhibe etmek için 10 dakikalık bir kaynatma adımının eklenmesinin faydalı olduğu kanıtlandı.

Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Liver glycogen is a hyperbranched glucose polymer that is involved in the maintenance of blood sugar levels in animals. The properties of glycogen are ...

Bu protokol, karaciğer glikojen moleküllerinin yapılarını koruyacak ve kaybedilen küçük glikojen parçacıklarının miktarını sınırlayacak şekilde ekstraksiyonuna izin verir. Diyabetin glikojen yapısını değiştirdiğini gösteren önceki araştırmalarla, bu yöntem diyabet ve çeşitli glikojen depolama hastalıklarının incelenmesinde sağlayabilir. Karaciğerden glikojeni çıkarmak için, bir gram donmuş karaciğer dokusunu altı mililitre glikojen izolasyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktararak başlayın.Buz üzerinde tutarken, bir doku homojenizatörü kullanarak karaciğer dokusunu homojenize edin. Tamamlandığında, hücre süspansiyonunun yarısını veya üç mililitresini yeni bir tüpe aktarın ve ardından 10 dakika kaynatın. Denatüre olmayan glikojen içeren ilişkili proteinleri çıkarmak için süspansiyonun diğer yarısını buz üzerinde tutun.Glikojen içeriğinin belirlenmesi için, her tüpten sekiz mikrolitrelik bir alikot çıkarın ve tüpü buz üzerinde tutun. Kalan süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6.000 G'de döndürdükten sonra, süpernatanı 3.6 kez 10 ila beşinci G ve 90 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjlemek için ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Kalan süpernatantları attıktan sonra, peletleri 1.5 mililitre glikojen izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.Daha sonra, numuneleri dört mililitrelik ultrasantrifüj tüplerinde 1.5 mililitre% 30 sükroz çözeltisi üzerine katmanlayın, ardından iki saat boyunca daha önce tarif edildiği gibi santrifüjleyin. Süpernatantları attıktan sonra, peletleri 200 mikrolitre deiyonize suda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan glikojeni çökeltmek için, hücre süspansiyonlarına 800 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve iyice karıştırın.Ardından, karışımları eksi 20 santigrat derecede en az bir saat bekleterek çökelmesini sağlayın. Çökeltme meydana geldiğinde, numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüjleyin ve etanol çökeltme işlemini üç kez tekrarlamak için glikojen peletini 200 mikrolitre deiyonize suda yeniden süspanse edin. Son hücre süspansiyonundan, glikojen içeriği tayini için her tüpten sekiz mikrolitrelik bir alikot çıkarın.Ardından, kalan süpernatanları sıvı nitrojen içinde dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutun. Ertesi gün, kurutulmuş glikojen örneklerini dondurucuda eksi 20 santigrat derecede saklayın. Çalışma, farklı koşullarla ekstrakte edilen kurutulmuş glikojen örneğinin saflığını, ham verimini ve glikojen verimini analiz etti.Çeşitli koşullarla ekstrakte edilen gruplar arasında ham verim ve glikojen verimi açısından önemli bir fark yoktu. Buna karşılık, glikojen saflığı, sakaroz konsantrasyonlarından ve bir kaynatma aşamasının eklenmesinden önemli ölçüde etkilenmiştir. En yüksek saflığa sahip glikojen, %30 sükroz konsantrasyonu ve 10 dakikalık bir kaynatma aşaması kullanılarak ekstrakte edildi.Glikojen, çeşitli koşulların nihai ekstrakttaki moleküllerin boyutu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için karaciğer homojenatından %30 %50 veya% 72.5 sakaroz, kaynatılmış veya kaynatılmamış olarak ekstrakte edildi. Zincir uzunluğu analizi, %30 %50 ve %72.5 sükroz konsantrasyonları kullanılarak hem kaynatılmış hem de kaynatılmamış altı karaciğer üzerinde gerçekleştirildi. Hidrodinamik yarıçapı RH, 30 nanometreden düşük olan glikojen moleküllerinin veya beta partiküllerinin içeriği hesaplandı.Kaynatılmış numuneler, kaynatılmamış numunelere göre daha düşük ortalama RH değerlerine ve daha yüksek partikül içeriğine sahipti. Ayrıca, daha düşük sükroz konsantrasyonları, daha düşük RH değerleri ve daha yüksek beta partikül içeriği ile sonuçlandı. Bir kaynatma aşamasının eklenmesi ayrıca daha düşük RH max veya maksimum değerlere yol açarken, sükroz konsantrasyonunun önemli bir etkisi olmamıştır.Dokunun tamamen homojen hale geldiğinden ve doku parçası kalmadığından emin olun. Bu teknikler, daha büyük alfa parçacıklarını oluşturmak için daha küçük beta parçacıklarını birbirine bağlayan yolların neler olduğunu keşfetmemizin yolunu açıyor.

the-extraction-liver-glycogen-molecules-for-glycogen-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, karakterize edilmemiş bir yapıya sahip bir glikojen numunesindeki dallanma derecesini belirlemek için kalitatif bir spektrofotometrik testi açıklıyoruz. Karakterize edilmemiş numunenin absorbans maksimumlarının bilinen dallı yapılara sahip polisakkaritlerinkiyle karşılaştırılması, karakterize edilmemiş numunede dallanmanın varlığını gösterir.

Glikojen dallanma derecesini ölçmek için glikojen dallanma deneyi

Bu videoda, hücre altı glikojen dağılımını görselleştirmek ve ölçmek için insan iskelet kası dokusunun numune hazırlığını ve transmisyon elektron mikroskobu için boyanmasını gösteriyoruz.

İnsan İskelet Kaslarında Glikojen Dağılımını Ölçmek için Transmisyon Elektron Mikroskobu

Burada in vitro glikojen titrasyonu için bir doğru, tekrarlanabilir ve uygun biyokimyasal yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik Abcam Glikojen deney kiti kullanır ve floresan ile titrasyon glikoz ve glikoz glikojen ardışık hidrolizi dayanmaktadır.

Glikojenin Biyokimyasal titrasyonu<em&gt; In vitro</em

Periyodik asit Schiff boyama, dokuların polisakkarit içeriğini görselleştiren bir tekniktir. Bu makale, insan venöz kanından saflaştırılmış periferik kan mononükleer hücrelerinde kullanılmak üzere uyarlanmış periyodik asit Schiff boyama protokolünü göstermektedir. Bu tür örnekler, lenfositler ve bağışıklık sisteminin diğer beyaz kan hücreleri için zenginleştirilmiştir.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitesini ölçmek için teknikler, görünür aralıkta çalışan basit bir spektrofotometre kullanılarak sunulmaktadır.

Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Modifiye edilmiş bir fiksasyon sonrası prosedür, dokudaki glikojen parçacıklarının kontrastını arttırır. Bu yazıda, iskelet kasında lif tipine özgü hücre altı glikojen dağılımı hakkında tarafsız ve nicel veriler elde etmek için dokunun nasıl ele alınacağını, görüntülemenin nasıl yapılacağını ve stereolojik yöntemlerin nasıl kullanılacağını açıklayan adım adım bir protokol sunulmaktadır.

İskelet Kas Liflerinde Subsellüler Glikojen Dağılımının İletim Elektron Mikroskobu Kullanılarak Ölçülmesi

Mevcut protokolde, glikojenin zincir uzunluğu dağılımını (CLD) ve ortalama zincir uzunluğunu (ACL) belirlemek için Florofor Yardımlı Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) tekniği kullanılmaktadır.

Florofor Destekli Karbonhidrat Elektroforezi (FACE) Yöntemi Kullanılarak Glikojen Glukan Zincir Uzunluğu Dağılımının Belirlenmesi

Bu protokol, kütle spektrometrisi görüntüleme kullanılarak hem glikojen hem de N-bağlantılı glikanların titiz ve tekrarlanabilir ölçümünü mümkün kılan temel adımları detaylandırır.

Glycome'in Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Mekânsal Moleküler Görüntülemesi

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

Öğrenin karaciğer glikojen moleküllerinin ekstraksiyonunu, yapıyı koruyarak ve küçük partikül kaybını sınırlayarak. Bu yöntem, diyabet ve glikojen depo hastalıklarının incelenmesine yardımcı olur.

Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Daha fazla video keşfet