Glikojen Yapısının Belirlenmesi için Karaciğer Glikojen Moleküllerinin Ekstraksiyonu

Bu protokol, karaciğer glikojen moleküllerinin yapılarını koruyacak ve kaybedilen küçük glikojen parçacıklarının miktarını sınırlayacak şekilde ekstraksiyonuna izin verir. Diyabetin glikojen yapısını değiştirdiğini gösteren önceki araştırmalarla, bu yöntem diyabet ve çeşitli glikojen depolama hastalıklarının incelenmesinde sağlayabilir. Karaciğerden glikojeni çıkarmak için, bir gram donmuş karaciğer dokusunu altı mililitre glikojen izolasyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktararak başlayın.

Buz üzerinde tutarken, bir doku homojenizatörü kullanarak karaciğer dokusunu homojenize edin. Tamamlandığında, hücre süspansiyonunun yarısını veya üç mililitresini yeni bir tüpe aktarın ve ardından 10 dakika kaynatın. Denatüre olmayan glikojen içeren ilişkili proteinleri çıkarmak için süspansiyonun diğer yarısını buz üzerinde tutun.

Glikojen içeriğinin belirlenmesi için, her tüpten sekiz mikrolitrelik bir alikot çıkarın ve tüpü buz üzerinde tutun. Kalan süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6.000 G'de döndürdükten sonra, süpernatanı 3.6 kez 10 ila beşinci G ve 90 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjlemek için ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Kalan süpernatantları attıktan sonra, peletleri 1.5 mililitre glikojen izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra, numuneleri dört mililitrelik ultrasantrifüj tüplerinde 1.5 mililitre% 30 sükroz çözeltisi üzerine katmanlayın, ardından iki saat boyunca daha önce tarif edildiği gibi santrifüjleyin. Süpernatantları attıktan sonra, peletleri 200 mikrolitre deiyonize suda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonundan glikojeni çökeltmek için, hücre süspansiyonlarına 800 mikrolitre mutlak etanol ekleyin ve iyice karıştırın.

Ardından, karışımları eksi 20 santigrat derecede en az bir saat bekleterek çökelmesini sağlayın. Çökeltme meydana geldiğinde, numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüjleyin ve etanol çökeltme işlemini üç kez tekrarlamak için glikojen peletini 200 mikrolitre deiyonize suda yeniden süspanse edin. Son hücre süspansiyonundan, glikojen içeriği tayini için her tüpten sekiz mikrolitrelik bir alikot çıkarın.

Ardından, kalan süpernatanları sıvı nitrojen içinde dondurun ve gece boyunca dondurarak kurutun. Ertesi gün, kurutulmuş glikojen örneklerini dondurucuda eksi 20 santigrat derecede saklayın. Çalışma, farklı koşullarla ekstrakte edilen kurutulmuş glikojen örneğinin saflığını, ham verimini ve glikojen verimini analiz etti.

Çeşitli koşullarla ekstrakte edilen gruplar arasında ham verim ve glikojen verimi açısından önemli bir fark yoktu. Buna karşılık, glikojen saflığı, sakaroz konsantrasyonlarından ve bir kaynatma aşamasının eklenmesinden önemli ölçüde etkilenmiştir. En yüksek saflığa sahip glikojen, %30 sükroz konsantrasyonu ve 10 dakikalık bir kaynatma aşaması kullanılarak ekstrakte edildi.

Glikojen, çeşitli koşulların nihai ekstrakttaki moleküllerin boyutu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için karaciğer homojenatından %30 %50 veya% 72.5 sakaroz, kaynatılmış veya kaynatılmamış olarak ekstrakte edildi. Zincir uzunluğu analizi, %30 %50 ve %72.5 sükroz konsantrasyonları kullanılarak hem kaynatılmış hem de kaynatılmamış altı karaciğer üzerinde gerçekleştirildi. Hidrodinamik yarıçapı RH, 30 nanometreden düşük olan glikojen moleküllerinin veya beta partiküllerinin içeriği hesaplandı.

Kaynatılmış numuneler, kaynatılmamış numunelere göre daha düşük ortalama RH değerlerine ve daha yüksek partikül içeriğine sahipti. Ayrıca, daha düşük sükroz konsantrasyonları, daha düşük RH değerleri ve daha yüksek beta partikül içeriği ile sonuçlandı. Bir kaynatma aşamasının eklenmesi ayrıca daha düşük RH max veya maksimum değerlere yol açarken, sükroz konsantrasyonunun önemli bir etkisi olmamıştır.

Dokunun tamamen homojen hale geldiğinden ve doku parçası kalmadığından emin olun. Bu teknikler, daha büyük alfa parçacıklarını oluşturmak için daha küçük beta parçacıklarını birbirine bağlayan yolların neler olduğunu keşfetmemizin yolunu açıyor.