Name: Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Öğrenin, MALDI-TOF kütle spektrometrisi ile urasil-DNA glikozilaz aktivitesini etiketsiz ve hızlı bir şekilde analiz etme yöntemini. Bu teknik DNA onarım mekanizmaları araştırmalarında yüksek özgüllük sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NCFPB Fonksiyonel Genomik Entegre Çekirdek Tesisi'ne (Taipei, Tayvan) ve NRPB Farmakogenomik Laboratuvarı'na (Taipei, Tayvan) teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Tayvan, R.O..C. Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir [hibe numarası MOST109-2314-B-002 -186 - K.-Y.S., ÇOĞU 107-2320-B-002-016-MY3 - S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 - W.-h.F.]. H.-L.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden doktora bursu almıştır. Açık erişim ücreti için finansman: Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, R.O.C.

1. Substrat/şablon hazırlama
<ol><li>Dubleks bölge için ~50 ± %10 dengeli G + C içeriğine ve minimum 50 °C erime sıcaklığına sahip urasil substrat/şablon dubleks tasarlayın. NOT: 18 nt substratlar ve 19 nt şablonları arasındaki bir nükleotid farkı (Tablo 1 ve Şekil 1) daha iyi MS sinyali yorumlamasına ve uygun tavlamaya yardımcı olur. Şablon iplikçik, A-U veya G-U uyumsuzlukları üretmek için tamamlayıcı DNA görevi görür (Tablo 1), ancak MS ölçümlerinde referans sinyali olarak da kullanılabilir. HPLC saflaştırılmış sentetik oligonükleotidlerin kullanımı bu çalışma için tatmin edicidir.</li>
	<li>DNA'yı 1 mM EDTA ve 10 mM Tris-HCl'de (25 °C'de pH 8.0) (TE) 100 μmol / L konsantrasyonunda bir stok olarak çözün ve -20 °C'de saklayın. Bu 20 μL stoğu TE ile 800 μL'lik son bir hacme kadar seyreltin (4 μmol / L'ye 25 kat seyreltme). Üreticinin atanan konsantrasyonunu sağlamak için DNA çözeltisinin UV'yi görünür bir spektrofotometrede λ = 260 nm'de absorbansını ölçün. Örneğin: 4 μmol/L U+9 için A260 = 0,204 ve 4 μmol/L T1 için A260 = 0,192 (Tablo 1).</li>
	<li>Oligonükleotid kalite kontrolü için MALDI-TOF MS analizi (bölüm 4-6), belirlenmiş m/z değerlerinde benzersiz tepe sinyallerini inceleyerek ve sinyal-gürültü oranının >100 olduğunu kontrol ederek gerçekleştirin (Şekil 1B ve Şekil 1D).</li>
</ol>2. DNA glikozilaz testi
<ol><li>Glikozilaz reaksiyonu için T1/U+9 dubleks G:U substratı (Tablo 1 ve Şekil 1A) kullanarak, örneğin 1,5 mL steril mikrosantrifüj tüpünde, 70 μL H2O, 10 μL 10x UDG reaksiyon tamponu, 5 μL T1 stoğu ve 5 μL U+9 stoğu (adım 1.2) ekleyin. NOT: Doğru mikropipet tipini seçin ve gerekli hacmi işlemek için üreticilerin talimatlarını izleyin. Örneğin, 0,1-2 μL sıvı dağıtmak için 2 μL'lik bir pipet kullanın, 2-10 μL sıvı dağıtmak için 10 μL'lik bir pipet kullanın ve sonuçların doğruluğunu ve hassasiyetini sağlamak amacıyla 20-100 μL sıvı dağıtmak için 100 μL'lik bir pipet kullanın. Reaktif karışımının tarif edilen hacmi 10 tahlil içindir; istenen reaksiyon sayısı için ses seviyesini ayarlayın. 1x UDG reaksiyon tamponu 1 mM EDTA, 1 mM ditiyotreitol ve 20 mM Tris-HCl (25 °C'de pH 8,0) içerir. 10x UDG reaksiyon tamponunun kaynağı için Malzeme Tablosuna bakın.</li>
	<li>Tüpü güvenli bir şekilde kapatın; 65 ° C'de 30 dakika boyunca bir su banyosunda, daha sonra 37 ° C'de 30 dakika boyunca ve son olarak substrat / şablon dubleksin uygun şekilde tavlanmasını sağlamak için 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>1,5 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpüne, 49 μL buz gibi soğuk 1x UDG reaksiyon tamponu ve 1 μL UDG (5.000 birim / mL; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, 0,1 birim / μL'ye seyreltin. NOT: 10 μL'lik bir reaksiyonda, 0,1 birim UDG, 3 dakika içinde bir T1/U+9 dubleksten 30 pmol'den fazla urasil parçalayabilir.</li>
	<li>1,5 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpünde, adım 2,2'den itibaren 9,0 μL substrat karışımı ekleyin ve tüpü 37 ° C'ye ısıtın. Adım 2.3'ten seyreltilmiş UDG'nin 1.0 μL'sini ekleyin. Reaksiyonu zamanlamak için bir zamanlayıcı kullanın ve içeriği karıştırmak için tüpe hafifçe vurun. NOT: Birim tanım testi için kuluçka süresi 30 dakikadır. Kinetik bir analiz için, başlangıç oranını elde etmek için 0.5, 1, 2, 3, 5 dakikalık bir zaman kursu analizi kullanın. Bir UGI inhibisyon testi için, reaksiyonu 15 dakika boyunca zamanlayın.</li>
	<li>Tüpleri, ortam sıcaklığında 3.200 × g'da 3-5 s reaksiyon karışımı ile santrifüj edin. Ardından, reaksiyonu hemen 37 ° C'ye aktarın.</li>
	<li>Reaksiyon sonlandırma
	<ol>
<li>0,25 M HCl ve 0,23 M Tris tabanlı çözeltiler hazırlayın. 15 mL'lik bir test tüpünde, 1x UDG reaksiyon tamponunu taklit etmek için 10 mL'lik bir 1 mM EDTA ve 20 mM Tris-HCl (25 °C'de pH 8.0) çözeltisi ekleyin. 1 mL 0,25 M HCl ile asitleştirin ve pH'ın ~2 ± 0,5 olduğundan emin olmak için bir pH metre ile kontrol edin. 1 mL 0,23 M Tris baz ile nötralize edin ve 6,5 ± 0,5 nihai pH için bir pH metre ile kontrol edin. NOT: pH test şeritlerinin kullanılması, reaktif karışımının pH seviyelerini yeniden doğrulamanın hızlı ve kolay bir yoludur.</li>
		<li>Enzimi inaktive etmek üzere 10 μL reaksiyon karışımını asitleştirmek için 1 μL 0.25 M HCl ekleyin ve 6 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Aside uzun süre maruz kalarak AP bölgesinin kırılmasını önlemek için DNA ürünlerini nötralize etmek için 1 μL 0.23 M Tris baz ekleyin. Matris talaş transferi için ürün karışımının hacmini artırmak üzere 13 μL TE ekleyin ve ardından buz üzerine yerleştirin. NOT: AP ürünü kimyasal olarak kararsızdır ve 2 gün içinde MALDI-TOF MS tarafından analiz edilmelidir. Bir haftadan uzun süre saklandıktan sonra, iplik kopmalarının önemli bir kısmının birikmesi, AP ürünlerinin β / δ eliminasyon reaksiyonları nedeniyle meydana gelir (Şekil 1D-G).</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm 25 μL UDG reaksiyon ürünlerini mikrosantrifüj tüplerinden 384 delikli bir mikrotitre plakasına aktarın. NOT: Tamponlardaki sodyum veya potasyum gibi yüksek konsantrasyonlardaki katyonlar, MALDI-TOF MS analizinde parazit oluşturur ve bu nedenle tuzdan arındırma gerektirir. E. coli UDG reaksiyon tamponu çok düşük konsantrasyonlarda katyon içerdiğinden, tuzdan arındırma gerekli değildir. Bununla birlikte, daha önce açıklandığı gibi tuzdan arındırma gerektiren metal katyonları içeren diğer DNA glikozilaz reaksiyonlarını ölçmek için bu protokolü değiştirin35.</li>
</ol>3. UDG reaksiyon ürünlerini bir matris çipine aktarın
<ol><li>Nanolitre dağıtıcının kapısını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 384 delikli mikrotiter plakasını adım 2.7'den güvertenin plaka tutucusuna yükleyin.</li>
	<li>Matris çip dizisini ilgili keşif plakası konumuna yerleştirin. Yüklü izci plakasını nanolitre dağıtıcının işleme güvertesine yerleştirin ve kapıyı kapatın.</li>
	<li>Aktarım ekranındaki çalıştır düğmesine dokunun ve cihazın 384 delikli mikrotitre plakasından matris çipine numune dağıtmaya başlamasını bekleyin.</li>
	<li>Dağıtım sırasında her bir nokta için çipin görüntüsünü ve dağıtım hacimlerini göstermek için Görüntü sekmesi seçeneğini kullanın. Çip üzerindeki lekeli hacmin 5-10 nL aralığında olduğundan emin olun.</li>
</ol>4. Kütle spektrometresi üzerindeki tahlil parametrelerini ayarlayın
<ol><li>İçe aktarma için tahmin edilen sinyal m/z değerini içeren bir .xlsx dosyası hazırlamak için uygulama programını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). NOT: DOSYA I.xlsx (Tablo 2) içindeki ayarlar, bölüm 2'deki G:U alt tabakasının UDG tahlili için örnek ayarlardır.</li>
	<li>Tasarımcı Biçiminde Tahlil Grubu İçe Aktar seçeneğini sağ tıklatıp açılır listeden .xlsx dosyasını seçerek (örneğin, adım 4.1'den DOSYA I.xlsx) yeni bir UDG testi oluşturmak ve tanımlamak için uygulama programını kullanın.</li>
	<li>Müşteri:Proje:Plaka düğmesine sağ tıklayın ve yeni bir tahlil plakası oluşturmak için açılır seçenek ağacının üst kısmına tıklayın. İletişim kutusuna bir dosya adı yazın (örneğin, laboratuvar kodu ve tahlil tarihi için CTT20210620) ve plaka türü açılır menüsünde 384 delikli plaka türünü seçin ve Tamam düğmesine basın. Ekranın sağında boş bir plaka olup olmadığına bakın.</li>
	<li>Tıkla Tahlil seçeneği; açılır listeden tahlili seçin (örneğin, DOSYA I.xlsx).</li>
	<li>Seçilen tahlili (örneğin, DOSYA I.xlsx) plaka üzerindeki her örnek nokta konumuna atamak için, imleci boş plakanın her bir konumuna getirin, kuyuyu vurgulamak için tıklayın ve Plex Ekle'yi seçmek için sağ tıklayın.</li>
	<li>Adım 2.7'den itibaren çip üzerindeki tüm örnekler için üstbilgi içermeyen .xlsx biçiminde (örneğin, Tablo 3'ün 0620.xlsx) bir çalışma listesi hazırlamak için bir masaüstü veya dizüstü bilgisayar kullanın. Yeni Örnek Proje Ekle düğmesini tıklatın; çalışma listesini içe aktarmak için açılır listeden dosyayı seçin (örneğin, 0620.xlsx).</li>
	<li>Ekranın solundaki çalışma listesinde (örneğin, 0620.xlsx) tüm test numune kodlarını arayın. Çalışma listesindeki örnek kodu tıklatın ve testleri her bir konuma bağlamak için plakanın karşılık gelen konumuna sağ tıklayın.</li>
</ol>5. Kütle spektrometresi çalışması
<ol><li>Kütle spektrometresini ( Malzeme Tablosuna bakınız) analiz edilecek numune çipine (bölüm 3'ten) bağlamak için uygulama programını kullanın.</li>
	<li> Varsayılan ayara tıklayın. İletişim kutusunda, adım 4.3'ten bir dosya adı yazın (örneğin, CTT20210620); Deneme Adı'nda, Çip Barkodu'na çip kimliğini yazın ve ayarları kaydedin.</li>
	<li>Kütle spektrometresi kontrol programını başlatın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Kütle spektrometresinin Giriş/Çıkış düğmesine basın ve güvertenin uzamasına izin verin. Talaş tutucuyu çıkarın ve numune çipini adım 3.4'ten talaş tutucuya yerleştirin. Yüklenen çip tutucuyu genişletilmiş güverteye yerleştirin ve numune çipinin cihaza girmesi için Giriş/Çıkış düğmesine basın.</li>
	<li>Uygulama programının Acquire simgesini çift tıklatın. Al penceresinde, cihazı başlatmak ve çip üzerindeki örneklerden kütle spektrumları elde etmek için otomatik çalıştırma sekmesine tıklayın.</li>
</ol>6. Kütle spektrumlarını görüntüleme ve verileri analiz etme
<ol><li>Veri analizi programını çalıştırın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Veritabanı ağacına göz atın ve adım 5.2'den çip kimliğini seçin. Çip üzerinde iyi bir hedefi vurgulamak için tıklayın ve kütle spektrumunu göstermek için spektrum simgesine tıklayın.</li>
	<li>Yeni bir pencerede belirli bir spektrum aralığını kırpmak üzere Özelleştirme İletişim Kutusu'nu seçmek için sağ tıklayın. m / z'nin üst ve alt sınırlarını yazmak için X Ekseni'ne tıklayın ve ilgilenilen sinyaller de dahil olmak üzere belirtilen aralık spektrumunu göstermek için Tamam'a basın. NOT: DNA miktarı, her m/z değer birimindeki tepe yoğunluğu ile orantılıdır.</li>
	<li>Sinyallerin U substratı, AP ürünü ve şablona karşılık gelen m/z değerlerinin tepe yüksekliğini ölçün. Zirveye tıklayın ve ekranın sol üst köşesindeki tepe yüksekliğini görüntüleyin. NOT: 1.600 genişlik/1.200 birimlik bir spektrum, bilgisayar ekranında inceleme ve kayıt tutma için makul bir boyuttur.</li>
	<li>Kayıt tutma spektrumunu kaydetmek için, Dışa Aktar'ı sağ tıklatın ve açılır listeden JPEG dosya türünü seçin. Açılır listeden depolama aygıtını seçmek için Hedef ve Diske Gözat'a tıklayın (örneğin, flash disk E:). Dosya adını yazın (örneğin, 0620_1-2.jpg) ve Ver'i tıklatın.</li>
	<li>Gerekirse, dışa aktarılan bir JPEG dosyasını yazdırın ve bir cetvel kullanarak tepe yüksekliğini manuel olarak ölçün.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Bu yazıda, AP içeren DNA ürünlerini doğrudan tespit etmek için UDG MALDI-TOF MS tahlil yönteminin kullanılması için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu yöntemin temel avantajları, urasil içeren substratların etiketsiz, ölçeklenebilir, kullanımı kolay olması ve substrat tasarımında daha fazla esneklik sağlamasıdır.
UDG tedarikçisi tarafından önerilen fenol / kloroform ekstraksiyonu, ürün DNA'sının bozulmasını önlemek için enzimin inaktivasyonunu sağlar. Bununla birlikte, fenol ekstraksiyon...

Urasil RNA'da normal bir baz olmasına rağmen, genomik DNA'da sık görülen ve oldukça mutajenik bir lezyondur. Urasil, bir deoksisitidinin spontan/enzimatik hidrolitik deaminasyonundan kaynaklanabilir. Her canlı hücrede, bu deaminasyon fizyolojik koşullar altında günde 100-500 kez gerçekleşir1,2. Bu değişiklikler onarılmazsa, DNA dizisi bileşiminde mutasyona neden olan bir değişiklik olabilir. DNA'daki urasil, replikasyon sırasında dATP ile eşleşmeyi tercih ettiğinden, sitozin urasil'e deaminasyon yaparsa, iki replikasyon olayında, döl DNA3'ün yarısında yeni bir G: C'den A: T'ye geçiş mutasyonu olacaktır.
Genetik stabiliteyi korumak için hücresel stratejiler arasında, baz eksizyon onarımı (BER), DNA4'teki urasil gibi hasarlı bazları onaran önemli bir mekanizmadır. BER, evrimsel olarak oldukça korunmuş bir süreçtir. İki genel BER yolu vardır: tek bir nükleotidin onarım yoluna giden kısa yama yolu ve en az iki nükleotidin onarım yolunu üreten uzun yama yolu5. BER, birkaç adımda gerçekleşen koordineli bir mekanizmadır. BER'deki ilk adım, hasarlı nükleotid bazının hasara özgü bir DNA glikozilaz tarafından enzimatik hidrolizidir ve bir apurinik / apirimididinik (AP) ara bölge oluşturur6. Bunu, AP bölgesindeki şeker-fosfat omurgasının bir endonükleaz tarafından bölünmesi, DNA uçlarının bir liyaz ile temizlenmesi, bir DNA polimeraz ile boşluk doldurulması ve son nickin bir ligaz ile kapatılması izler5.
Urasil-DNA glikozilaz (UDG), urasili Escherichia coli'deki BER için urasil içeren DNA'dan hidrolize eder. Farklı ayırma tekniklerini içeren radyo-etiketli DNA kullanan geleneksel UDG testleri6,7,8,9,10,11,12,13 genellikle zaman alıcı, emek yoğun, maliyetli etiketleme reaktifleri, karmaşık prosedürler ve radyoaktif maddelere maruz kalma risklerini azaltmak için yoğun eğitim ve uygulama gerektirir. Florometrik oligonükleotid testleri, moleküler işaretçilere ve Förster rezonans enerji transfer teknolojisine15,16,17,18,19,20 ek olarak radyoizotop etiketlemesinin14 yerine geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen tüm yöntemler için özel etiketleme gereklidir. Son zamanlarda etiketsiz biyosensör tahlilleri21,22,23 ve G-dörtlüx24,25,26 oluşumuna dayanan kolorimetrik yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, problardaki çoklu A: U çiftleri veya özel olarak tasarlanmış diziler, enzim birimi tanımını zorlaştırır.
MALDI-TOF MS, DNA ANALIZINDE ÇOK FAYDALı OLABILECEK BIR TEKNOLOJIDIR. Geliştirilen uygulamalar arasında tek nükleotid polimorfizmi genotipleme27,28, modifiye nükleotid analizi29 ve DNA onarımı ara tanımlama30,31,32,33,34 bulunmaktadır. MALDI-TOF MS, AP bölgesi içeren DNA ürünlerini tespit etmek için DNA glikozilaz analizi için kolayca benimsenmelidir. Bununla birlikte, DNA'daki AP bölgeleri birçok deneysel koşulda iplikçik kopmasına eğilimlidir33. Burada, önemli bir iplik kopma gürültüsü olmadan AP saha üretimini doğrudan ölçmek için MALDI-TOF MS kullanılarak bir UDG testi sunulmaktadır. Bu etiketsiz yöntemle çalışmak kolaydır ve DNA glikozilaz inhibitörü taramasının farmasötik uygulaması için yüksek bir potansiyele sahiptir.

<table><tbody><tr><td>2-Amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol (Tris bazı)</td><td>J.T baker</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Otoklavlanmış deiyonize su</td><td>MILLIPORE</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T Baker</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Eldivenler</td><td>AQUAGLOVE</td><td></td><td>Protokolü 1,2,3</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td><td>SIGMA</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokolü 2</td></tr><tr><td>Düşük tutma pipet uçları (0.5-10 & L)</td> <td>ekstra gen</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Düşük tutma pipet uçları (1,250 &mikro; L)</td> <td>ulusal bilimsel tedarik co, Inc.</td><td></td><td>Protokol 1,2</td></tr><tr><td>Düşük tutma noktalı pipet uçları (200 & mikro; L)</td> <td>ulusal bilimsel tedarik co, Inc.</td><td></td><td>Protokol 1,2</td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td></td><td>Protocol 4, 5 Kütle spektrometresi kontrol programları arasında Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE ve Start RT Process bulunur.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td>RS1000</td><td>Protokolü 3</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Kubota</td><td></td><td>Protokolü 2</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj</td><td>Clubio</td><td></td><td>Protokolü 2</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü (1.5 mL)</td><td>Ulusal bilimsel tedarik co, Inc.</td><td></td><td>Protokol 2</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüp rafı</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokol 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipet ve nbsp; (P1000)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipet ve nbsp; (P2)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipet (P10)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipet (P100)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipet (P200)</td><td>Gilson</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipet (SL2)</td><td>Rainin</td><td></td><td>Protokolü 1,2</td></tr><tr><td>Oligonükleotidler</td><td>Entegre DNA Teknolojileri (Singapur)</td><td></td><td>Protokol 1,2</td></tr><tr><td>Görev Grafiği IC50 Hesap Makinesi (v.1)</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td></td><td>Şekil 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>WAKO</td><td></td><td>Protokolü 2</td></tr><tr><td>SpectroCHIP dizisi</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td> <td># 01509</td><td>Protokol 3, 5</td></tr><tr><td>Zamanlayıcı</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokol 2</td></tr><tr><td>Typer 4.0 yazılımı</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td> <td># 10145</td><td>Protokolü 6 Typer 4.0, Test Tasarımcısı, Test Editörü, Plaka Editörü ve Typer Analizörü dahil olmak üzere dört programdan oluşur.</td></tr><tr><td>UDG Reaksiyon Tamponu (10x)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B0280S</td><td>Protokol 2</td></tr><tr><td>Urasil Glikozilaz İnhibitörü</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0281S</td><td>Protokol 2</td></tr><tr><td>Urasil-DNA Glikozilaz</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0280L</td><td>Protokol 2</td></tr><tr><td>UV-VISBLE spektrofotometre UV-1601</td><td>SHIMADZU</td><td></td><td>Protokol 1</td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>ZETA ZC-4000 ( Tayvan.Inc)</td><td></td><td>Protokol 2</td></tr></tbody></table>

matris yardımlı lazer desorpsiyonu/İyonizasyon ile urasil-dna glikozilaz testi uçuş süresi kütle spektrometrisi analizi

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Urasil-DNA glikozilaz (UDG), sitozinin hidrolitik deaminasyonundan oluşan urasilin düzeltilmesi için baz eksizyon onarım yolunda önemli bir bileşendir. Bu nedenle, genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. UDG aktivitesini ölçmek için oldukça spesifik, etiketsiz, radyo-izotopik olmayan bir yöntem geliştirilmiştir. Bölgeye özgü bir urasil içeren sentetik bir DNA dubleks, UDG tarafından bölündü ve daha sonra Matris destekli Lazer Desorpsiyon / İyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) analizine tabi tutuldu. DNA'daki apurinik / apirimidinik bölge (AP) ürününü iplik kopmadan korumak için bir protokol oluşturuldu. Substrattan ürüne m/z değerindeki değişim, urasil hidrolizini UDG ile değerlendirmek için kullanıldı. UDG kinetik analizi için Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s ve Kcat = 9.31 s-1 veren bir G: U substratı kullanıldı. Bu yöntemin urasil glikozilaz inhibitörü (UGI) testine uygulanması, 7.6 pM'lik bir IC50 değeri vermiştir. Tek sarmallı ve çift sarmallı DNA substratları içinde çeşitli pozisyonlarda urasil kullanan UDG özgüllüğü, farklı bölünme verimlilikleri göstermiştir. Bu nedenle, bu basit, hızlı ve çok yönlü MALDI-TOF MS yöntemi, çeşitli monofonksiyonel DNA glikozilazları için mükemmel bir referans yöntemi olabilir. Aynı zamanda DNA glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak potansiyele sahiptir.

Şablonlar ve alt tabakalar Örnek olarak bir G şablonu ile eşleştirilmiş merkezde U ile sentetik oligonükleotidler (U + 9) alındığında (Şekil 1A), sentetik oligonükleotid saflığının kalite kontrolü için eşdeğer miktarda şablon ve urasil içeren substratın boş bir kontrolü kullanılabilir (Şekil 1B; sinyaller belirlenen m / z ve düşük arka plan gürültüsü ile eşleşir). MS veri analizi için tepe yükseklikleri ölçüldü (Şekil 2</...

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

DNA onarım mekanizmaları, tüm canlı organizmalarda genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. Urasil-DNA glikozilaz, temel doku onarım yolunda çok önemli bir DNA onarım proteinidir. MALDI-TOF kütle spektrometrisini kullanarak, enzim aktivitesi testi için AP ürününü doğrudan tespit edebiliriz.Geleneksel glikozilaz testi, substrat emeği gerektirir. Bu yöntem etiketsizdir ve urasil substratından AP ürününe kütle değişimini doğrudan tespit eder. Diğer avantajlar arasında yüksek özgüllük, çok yönlülük, ölçeklenebilirlik, hız ve gerçekleştirilmesi kolay bulunur.Örnek olarak E.coli urasil-DNA glikozilaz kullandık. Bu yöntem diğer DNA glikozilaz testleri için kolayca değiştirilebilir. Doğru pipetleme ve seyreltme becerilerine sahip iyi eğitimli laboratuvar personeli çok önemlidir.Daha iyi sinyaller ve daha az arka plan gürültüsü için taze hazırlanmış reaktifler ve düşük tuz tamponları kullanılmalıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Hui-Lan Chang olacak. T1 U+9 dubleksin guanin-urasil baz taşıyan substratını kullanan bir DNA glikozilaz testi için, 1,5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüpüne 70 mikrolitre su, 10 mikrolitre 10X urasil-DNA glikozilaz veya U

uracil-dna-glycosylase-assay-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Üreaz yöntemi aracı metabolitlerin GC / MS analizi için numune hazırlama, mucit tarafından sunulmaktadır. Bu yöntem, bir adım, tek bir süreç niceleme karbonhidratlar, organik ve amino asitler tandem kütle spektrometresi ile doğumsal yenidoğan tarama takip.

Bir adım metabolomik: Karbonhidratlar, Tek Bir Usul Sayısallaştırılmış Organik ve Amino Asitler

Bir sinkrotron de ayarlanabilir vakum ultraviole fotoiyonizasyon kütle spektrometresi birleştiğinde bir moleküler demet izole gaz fazında moleküller ve kümelerin elektronik yapısını keşfetmek için uygun bir araç sağlar. DNA baz dimerleri Proton transferi mekanizmaları bu teknik ile aydınlatılmıştır.

Ayarlanabilir Vakum Ultraviyole (VUV) Sinkrotron Radyasyon Molecular Beam Kütle Spektrometresi

Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Burada, on-on translocation-2 (TET2) iletişim kuralı etkin etiketsiz insan bir verimli tek adım arıtma için mevcut iyon değiştirme Kromatografi ve sıvı kromatografi-tandem mass kullanarak onun tahlil kullanarak 5-metilsitozin dioxygenase spektrometresi (LC-MS/MS)-yaklaşım alarak.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

DNA polimeraz proofreading ve DNA onarım tahlil bir sigara etiketli ve radyo izotopik bir yöntem yüksek çözünürlüklü MALDI-TOF Kütle spektrometresi ve bir tek nükleotid uzantısı strateji kullanarak geliştirilmiştir. Tahlil çok özel, basit, hızlı ve kolay yazım denetleme için gerçekleştirmek ve tamir olmak için 9-nükleotit kısa yamalar kanıtladı.

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

Burada RNA DNAzyme bağımlı dekolte için bir protokol salıyoruz. Bu, RNA 2'-O-metilasyonun hızlı ve yere bağlı analizini sağlar. Bu yaklaşım, snoRNA aktivitesinin ön veya önemli değerlendirilmesi için kullanılabilir.

RRNA 2'-O-Metilasyonun DNAzyme bağımlı analizi

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Burada, lezyon indüksiyonundan sonra DNA'nın kopyalanmasında tek sarmallı DNA boşluklarını araştırmak için DNA lif testinin iki modifikasyonunu açıklıyoruz. S1 fiber testi, ssDNA'ya özgü S1 endonükleazı kullanarak replikatif sonrası boşlukların tespit edilmesini sağlarken, boşluk doldurma testi, boşluk onarımının görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin verir.

DNA Fiber Testi Kullanılarak İnsan Hücrelerinde Replikasyon Sonrası Boşlukların Birikmesi ve Onarımının Tespiti

MALDI-TOF, oksitlenmiş RNA ve eksoribonükleaz Xrn-1 arasındaki reaktiviteden elde edilen fragmanları karakterize etmek için kullanıldı. Mevcut protokol, RNA ve / veya DNA içeren diğer işlemlere uygulanabilecek bir metodolojiyi açıklamaktadır.

MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması

Burada, müsinlerden O-glikanların salınması ve ardından MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak tuzdan arındırma, permetilasyon ve analiz için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon Uçuş Süresi Kütle Spektrometresi Kullanılarak Permetillenmiş Müsin O-glikanlarının Profillenmesi

Öğrenin, MALDI-TOF kütle spektrometrisi ile urasil-DNA glikozilaz aktivitesini etiketsiz ve hızlı bir şekilde analiz etme yöntemini. Bu teknik DNA onarım mekanizmaları araştırmalarında yüksek özgüllük sağlar.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Daha fazla video keşfet