Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması
November 10th, 2021
Bu protokol, nazal epitel hücresi toplanmasını, genişlemesini ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaşmasını ve canlı hücre görüntüleme ve özel yapım senaryolar yoluyla kirpik vuruş sıklığının nicelleştirilmesini açıklar.
Burun mukozasından hava yolu kök hücrelerinin toplanmasını tarif ediyoruz. Bu hücreler genişletilir ve laboratuarda psödostratifiye bir epitel halinde farklılaştırılır. Bu, in vivo hava yollarımıza benzeyen in vitro genişleme ve farklılaşmadır, bu da siliyer hücreler gibi silia beat frekansını ölçmek için kullanılabilecek özel hücrelerin mevcut olduğu anlamına gelir.
Farklı bireyler arasında ve farklı ilaçlara yanıt olarak kirpik vuruş sıklığının tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlamak için, kültür koşullarını ve görüntü edinimini standartlaştırıyoruz. Kirpik beat frekans ölçümleri primer siliyer diskinezi gibi hastalıklarda klinik araç olarak kullanılmaktadır. Bunu kistik fibroz için klinik bir belirteç olarak belirlemeyi umuyoruz.
Prosedürü gösteren Katelin Allan ve Laura Fawcett, laboratuvarımdan doktora öğrencileri ve laboratuvarımdan doktora sonrası Dr. Sharon Wong. Katılımcıdan ağzından nefes almasını isteyerek başlayın. Daha sonra baskın elde bir sitoloji fırçası alın ve beşinci basamağı katılımcının çenesine koyarak eli sabitleyin, sitoloji fırçasını katılımcının burun pasajına katılımcının yüzüne 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve burun meatusundan geçirin.
Fırçayı katılımcının yüzüne dik olacak şekilde dik bir şekilde döndürdükten sonra, fırçayı nazikçe ama sıkıca burnun yan duvarına karşı, alt konkanın ortasından arka kısmına gelene kadar aşağı konkanın altına doğru ilerletin. Fırçayı üç defaya kadar 360 derece döndürün. Ardından, yerleştirme manevrasını tersine çevirerek yavaşça çıkarın, böylece hücreler fırçadan çıkarılmaz.
Fırçayı hazırlanan toplama tüpüne nazal hücre toplama ortamı ile yerleştirin ve toplama tüpünü buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri fırçadan çıkarmak için nazik bir vortekslemeden sonra, buz üzerindeki toplama tüpünü biyogüvenlik kabinine geri aktarın. Serolojik bir pipet kullanarak, medyayı toplama tüpünden yeni bir tüpe aktarın ve sitoloji fırçalarını geride bırakın.
Ardından numuneyi santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bir mililitre koşullu yeniden programlama hücre ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, hücreleri dairesel bir hareketle 50 mililitrelik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş bir hücre eleğinden geçirin.
Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için, süspansiyonu tüpün altından toplayın ve elek içinden birkaç kez geçirin. Ardından hücre eleğini atın. Hava yolu epitel hücrelerini hazırlanan geçirgen destek eklerine tohumlamak için, hücreleri kabarcıklar oluşturmadan iyice karıştırın, homojen ve süspansiyonda olduklarından emin olun.
Ardından, hazırlanan geçirgen destek eklerinin apikal tarafına 150 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hava-sıvı arayüzündeki hava yolu epitel hücrelerini ayırt etmek için, onları iki gün boyunca farklılaştırmada veya ALI ortamında kültürleyin. Daha sonra ortamı aspire edin ve bir hava-sıvı arayüzü oluşturmak için yalnızca bazal bölmeye 750 mikrolitre ALI ortamı ekleyin.
ECM kubbelerindeki hava yolu epitel hücrelerini tohumlamak için, ayrışmış hava yolu epitel hücrelerini% 90 ECM'lik uygun hacimle yeniden askıya alın. Daha sonra pipeti dikey olarak kuyunun dibine mümkün olduğunca yakın 90 derecelik bir açıyla tutun, 50 mikrolitre ECM hücre süspansiyonunu kuyunun ortasına dağıtın. ECM katılaşana kadar plakayı 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
ECM katılaşırken, Hava Yolu Organoid Tohumlama Ortamını veya AOSM'yi, yeniden sıvılaşmaya ve EKM kubbesinin eklenmesi üzerine parçalanmasına neden olmasını önlemek için oda sıcaklığına ısıtın. Kuluçkadan sonra, kuyunun duvarını dağıtarak her bir kuyuya 500 mikrolitre ısıtılmış AOSM ekleyin. Pipetleri doğrudan ECM kubbesinin üzerine koymayın.
Medyayı dört ila yedi gün boyunca her iki günde bir değiştirin. Ortamı aspire etmek için, plakayı 45 derecelik bir açıyla eğin ve kuyunun alt kenarından ECM kubbesinden uzağa aspire edin. Dört ila yedi gün sonra, her bir kuyucuğa 500 mikrolitre ısıtılmış Hava Yolu Organoid Farklılaşma Ortamı veya AODM ekleyerek organoid farklılaşmayı başlatın ve yedi gün boyunca her iki günde bir medyayı değiştirin.
Hava yolu epitel hücresi modellerini içeren kültür plakasını mikroskop plakası ekine yerleştirin ve mikroskop çevre odasını kapatın. Numunenin önceden ısıtılmış, 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit dolu mikroskop odasında 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Mikroskop göz merceğinde, hücre modeline odaklanın.
Ardından, satın alma yazılımını kullanarak, ışık yolunu kameranın monte edildiği bağlantı noktasına geçirmek için L100'e tıklayın. Yazılım aracılığıyla mikroskop görüş alanını görselleştirmek için yeşil Oynat düğmesine tıklayın. Kirpiklerin odakta olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
Menüden hızlandırılmış görüntüler almak için, Al'a ve ardından Hızlı Zaman Atlaması'na tıklayın. Açılır pencerede, bir kaydetme konumu ve dosya adı seçin, 1.000 kare alın. Kirpikleri mikroskop görüş alanında önizlemek için, Uygula'ya ve ardından yeşil Oynat düğmesine tıklayın.
Gerekirse Z odağını ayarlayın. Ardından, Hızlı TimeLapse'i yakalamak için Şimdi çalıştır'ı tıklayın. Gerekli yazılım ve araç kutularını yükledikten sonra, uygun özel analiz komut dosyalarını ve destek komut dosyaları klasörünü bilgisayarın yerel sürücüsüne kopyalayın.
Ardından, bilgisayar yazılımı üzerine, Giriş sekmesine ve ardından Yolu Ayarla'ya tıklayın. Açılır pencerede, Alt Klasörlerle Ekle'ye tıklayın. MATLAB arama yolunun altında, gösterilen klasörü seçin.
Ardından Kaydet ve Kapat'a tıklayın. Sol panelde görünüp görünmediklerini kontrol ederek analiz komut dosyalarının bilgi işlem yazılımına bağlı olduğunu onaylayın. Ardından, alınan örnek ham görüntü dosyalarını bilgisayarın yerel sürücüsüne aktarın.
Ardından BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove tıklayın. m analiz script dosyası bilgi işlem yazılımında. Komut dosyasını çalıştırmak için, Düzenleyici sekmesine ve ardından yeşil Oynat düğmesine tıklayın.
Görüntülenen istem penceresinde, analiz edilecek ham görüntü dosyalarını seçin. Kare başına edinme süresi için pozlama süresini girin. Ardından Tamam'a tıklayın. GetFirstAmplince komutunu çalıştırın.
AveSpectrum dosyalarını içeren klasördeki m komut dosyası. Komut dosyasının FirstAmplitudeStacked çıktısını almasını bekleyin. xlsx dosyası, en yüksek genlik frekansını içeren ve hava yolu epitel kirpiklerinin dövülmesinin fizyolojik aralığı içinde yer almaktadır.
FirstAmplitudeStacked'den frekans değerlerini kopyalayın. xlsx dosyasını açın ve bilimsel analiz yazılımı kullanarak bunları çizin. Kistik fibrozisli üç katılımcı ve üç sağlıklı kontrol katılımcısından elde edilen hava yolu epitel hücreli ALI modellerinde ölçülen kirpik beat sıklığının sonuçları sunulmuştur.
Kültür farklılaşmasının 14. gününde, yenen kirpikler mevcuttu. Kültür farklılaşmasının 14. gününden, 21. gününden itibaren, kohortlar arasında kirpik atış sıklığında istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlenmemiştir. Kültür farklılaşmasının 21. gününde, sağlıklı kontrol katılımcıları için ortalama kirpik vuruş sıklığı, kistik fibrozlu katılımcılarınkinden anlamlı derecede yüksekti.
Ayrıca, mukusun çıkarılmasını takiben aynı hücre modellerinde silia vuruş sıklığı görüntülendiğinde, hem sağlıklı bireylerin hem de kistik fibrozisi olanların ALI modellerinde mukus çıkarıldığında kirpik atma sıklığında istatistiksel olarak anlamlı bir artış olmuştur. Görüntüleme ortamı kesinlikle düzenlenmelidir, çünkü kirpik fonksiyonu çevresel faktörlerdeki değişikliklere karşı son derece hassastır. Bu platform, CFTR fonksiyonunu modüle eden ilaçları tanımlayabilmek için hastaya özgü ilaç taraması için kurulma potansiyeline sahiptir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, nazal mukozadan hava yolu kök hücrelerinin toplanmasını ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaştırılmasını özetlemektedir. Canlı hücre görüntüleme kullanarak kirpiklerin çepeçevre frekansının kantitasyon yöntemlerini içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Solunum Sistemi Tıbbı
Arka Plan
- Hava yolu kök hücreleri nazal mukozadan elde edilebilir.
- Bu hücreler in vitro ortamda genişletilip farklılaştırılabilir.
- Elde edilen modeller in vivo hava yolu epitelini taklit eder.
- Kirpili hücreler, kırpık fonksiyonunu incelemek için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Hava yolu epitel hücreleri için kültür koşullarını standardize etmek.
- Kirpiklerin çepeçevre frekansının tekrarlanabilir kantitasyonunu sağlamak.
- Kirpiklerin çepeçevre frekansını hastalıklar için klinik bir belirteç olarak araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nazal mukozadan hava yolu kök hücrelerinin toplanması.
- Sözde tabakalı epiteliyumda in vitro genişleme ve farklılaşma.
- Kirpiklerin çepeçevre frekansını değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme.
- Veri analizi için özel hazırlanmış komut dosyaları.
Ana Sonuçlar
- Nazal epitel hücrelerinin fonksiyonel modellere başarılı farklılaşması.
- Kirpiklerin çepeçevre frekansını ölçmek için standartlaştırılmış yöntemler kurulmuştur.
- Kirpiklerin çepeçevre frekansının klinik teşhislerde kullanılması için potansiyel uygulama.
- Solunum hastalıklarında kırpıkların rolü hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Bu protokol, hava yolu epitel hücrelerini incelemek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- Kirpiklerin çepeçevre frekansının kantitasyonu, solunum durumlarını teşhis etmede yardımcı olabilir.
- Dahası araştırma, bunun klinik bir belirteç olarak kullanımını doğrulamak için yapılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying cilia beat frequency in primary human nasal epithelial models provides a physiologically relevant system for evaluating CFTR modulator efficacy. This approach supports target validation by linking CFTR channel activity to functional ciliary output in a disease-relevant model. Standardized, environmentally controlled measurement enables reproducible, patient-specific response assessment for preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the relationship between CFTR modulation and ciliary function as a downstream phenotypic readout.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of CFTR-dependent mechanisms in primary human cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dynamic readouts of ciliary activity for compound screening.
- Operational Value: Standardized culture and imaging conditions ensure assay reproducibility across donors and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human airway pathophysiology, including mucus-mediated ciliary inhibition, relevant to CF.
- Operational Value: Supports longitudinal assessment of ciliary recovery post-mucus clearance, informing mechanistic follow-up.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by providing a functional endpoint for CFTR modulator screening, with outputs feeding into lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying ciliary response to CFTR-targeted compounds.
- Screening: Delivers scalable, quantitative CBF measurements suitable for hit confirmation and dose-response profiling.
- Analytics: Custom scripts extract frequency data from high-speed imaging, enabling statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Models human airway epithelium with native mucus production, bridging in vitro findings to clinical CFTR modulator response.
- Enterprise Reuse: Platform can be applied across multiple CFTR modulator programs for consistent, human-relevant functional assessment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in CFTR modulator effects through direct measurement of ciliary function.
- Operational Value: Environmental control and standardized protocols reduce variability and enhance cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Enables patient-stratified response prediction, improving go/no-go decisions in CFTR modulator development.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying non-responders early in preclinical evaluation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary airway cell culture, differentiation, and sterile technique.
- Dependent on high-speed video microscopy and environmentally controlled imaging chambers.
- Necessitates computational infrastructure for running custom MATLAB-based analysis scripts.
- Must account for donor variability in basal cilia beat frequency when designing studies.
- Environmental stability (temperature, CO2, humidity) is critical for reliable CBF measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Collection of Nasal Inferior Turbinate Brushings
2:25
Airway Epithelial Cell Expansion and Maintenance
3:23
Seeding and Differentiation of Airway Epithelial Cells and Maintenance of Differentiated ALI Models
4:12
Three-Dimensional Airway Epithelial Organoids
5:54
Imaging Cilia Beat Frequency
7:18
Data Analysis and Quantification of Cilia Beat Frequency
9:20
Results: Cilia Beat Frequency in Airway Epithelial Cell ALI Models of Cystic Fibrosis Patients and Healthy Participants
10:36
Conclusion
