Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Diffüz orta hat gliomu oldukça invaziv bir beyin tümörüdür. Bu yöntem, DMG hücrelerinin nasıl göç ettiğini ve istila ettiğini 3B bağlamda gerçek zamanlı olarak incelemeye yardımcı olur ve önemli bir adezyon molekülünün potansiyel rolü hakkında özel bilgiler sağlar. Bir etiketleme reaktifi ve spesifik bir antikor anti-CD44 kullanarak, canlı hücre görüntüleme ile CD44'ün DMG hücreleri üzerindeki plazma membranı üzerindeki ekspresyonunu 3D migrasyon ve invazyonda da inceleyebiliriz.

Bu tekniğin uygulanması, CD44'ün bu hücrelerin hareketliliğindeki potansiyel rolünü vurgulayarak, değerli ve invaziv bir moleküler hedefi temsil edebileceğini düşündürdü. Başlamak için, 100 mikrolitre steril su ekleyerek ALR'yi yeniden sulandırın ve çözeltiyi pipetleyerek karıştırın. Antikoru TSM ortamındaki ALR ile yuvarlak tabanlı çok kuyulu bir plakada veya kehribar bir tüpte karıştırın ve ışıktan koruyun.

Son tahlil konsantrasyonunun üç katında oyuk başına 25 mikrolitre dağıtmak için yeterli miktarda ortam hazırlayın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Testin sonunda 0.5 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için BSR'yi TSM ortamında 1.5 milimolar konsantrasyonda seyreltin. Daha sonra, NS'nin oturduğu kuyunun dibine dokunmaktan ve NS'nin varlığını görsel olarak kontrol etmekten kaçınarak, her bir kuyucuktan 75 mikrolitre ortamı yavaşça ve yavaşça çıkarın.

Her bir oyuğa yavaşça 25 mikrolitre BSR ve ALR antikor kompleksi ekleyin ve ALR antikor kompleksinin ortamla iki ila üç dakika karışmasına izin verin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, her NS'nin kuyunun dibinde merkezi olarak bulunduğundan emin olun. Bir iğne kullanarak çıkararak kabarcık oluşumunu önleyin.

Plakanın tabanının soğumasını sağlamak için plakayı beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Kuyunun iç duvarına önceden soğutulmuş bir P200 ucu yerleştirerek, kabarcık oluşumunu önleyerek ve kuyu dibine dokunarak kuyu başına 75 mikrolitre BMM dağıtın. BMM'nin ortamla karışmasını sağlamak için plakayı beş dakika buz üzerinde bırakın.

Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak NS'nin yerini kontrol edin. Ve merkezi olarak mevcut değilse, plakayı beş dakika boyunca 180 kez G'de dört santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra plakayı 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nem ayarlı inkübatör içine yerleştirilmiş canlı hücre analiz cihazına aktarın. Kuyular BMM ile kaplandıktan sonra bir P200 ucu kesin.

Seçilen her kuyucuktan 50 mikrolitre hücre ortamı ve NS alın ve kaplanmış düz tabanlı bir kuyuya aktarın. Her bir kuyucuktaki NS'nin varlığını ve konumunu görsel olarak kontrol edin. Her bir oyuğa yavaşça 50 mikrolitre seyreltilmiş BSR ve ALR antikoru ekleyin ve reaktiflerin karışması için iki ila üç dakika bekleyin.

Ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, çoğaltılmış NS'lerin çoğunun kuyuda merkezi olarak bulunduğundan emin olun. Herhangi bir kabarcık olmadığından emin olduktan sonra, plakayı daha önce gösterildiği gibi canlı hücre analiz cihazına yavaşça aktarın. Canlı hücre analiz cihazı yazılımında, elde edilecek program seçeneğini seçin, ardından artı sekmesine tıklayın ve plakaları metin yazısında belirtildiği gibi aralıklarla taramak için programa göre tara'yı seçin.

Yazılım penceresinde, gemi oluşturun veya geri yükleyin ve ardından Yeni seçeneğine tıklayın. İnvazyon testi için küresel tarama tipini, faz artı parlak alanı, yeşil görüntü kanallarını ve 4X objektifi seçin. Geçiş tahlili için seyreltme klonlama taraması, tip 4X hedefi ve faz ve yeşili seçin.

Plaka tipini seçin ve taranacak kuyucukları plaka haritasında vurgulayarak tanımlayın, ardından tarama frekansını ayarlayın. Programa Ekle'ye tıklayın ve taramayı başlatın. Yeni Analiz Tanımı Oluştur sekmesini seçin.

Ardından, sekmede sırasıyla istila ve geçiş için küresel istila veya temel analizör uygulamasını seçin. Görüntü kanalında invasion ve migration'a uygun kanalları seçin. Analiz ayarını önizlemek ve iyileştirmek için üç ila dört kuyudan birkaç temsili görüntü seçin.

İnvazyon tahlili için, analiz tanımı sekmesinde, küresel ve istilacı hücreler arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için parlak alan ve yeşil kanallardaki uygulama ayarlarını metin yazısında belirtilen ayarlarla ayarlayın. Migrasyon tahlili için, birleşim ve yeşil hücreler arasında kesin bir segmentasyon oluşturmak için uygulama ayarlarını faz ve yeşil kanallardaki metin metninde belirtildiği gibi ayarlayın. Birkaç kuyucuğa rastgele tıklayarak NS için analiz ayarlarının doğru olup olmadığını kontrol edin.

Analiz edilecek kuyuları ve zaman noktalarını seçin. Analiz tanımını kaydedin ve Son'a tıklayın. Primer DMG hastadan türetilen hücrelerde CD44 ekspresyonunun temsili immünofloresan konfokal görüntüleri, CD44'ün hücre göçü ve invazyonundaki rolünü göstermiştir.

Canlı 3D hücre immünokimyası, CD44 ekspresyonunun görselleştirilmesine izin verir. Hem göç hem de istila için zaman atlamasının temsili çerçeveleri, zaman içinde gözlemlenen aynı hücrede yeşil floresan sinyalinin varlığını ve yokluğunu gösterir, bu da hücreler göç ederken ve istila ederken CD44 ekspresyonunun açık ve kapalı olduğunu gösterir. Migrasyon ve invazyon süreçleri 96 saat boyunca takip edilir ve yüksek düzeyde CD44 içeren QCTB-R059 hücreleri gösterilir.

CD44 ekspresyonunun nicelleştirilmesi ve zaman içindeki artışı, hem göç hem de invazyon için ALR ile ilişkili genel yeşil floresan sinyali ile ölçüldü. Anti-CD44 antikoru canlı hücrelerde kullanıldığında, hücre morfolojisini etkiler, mezenkimal benzerden amip benzeri istilaya geçişi ve bu hücrelerin invaziv ve göç kapasitesinin azalmasına neden olur. Yöntemin en kritik adımı, etiketleme reaktifinin bir antikorla karıştırılması, karışımın Matrigel ve besiyerine eklenmesi ve canlı hücre görüntüleme cihazına erişimdir.

Bu yöntem, doğrudan hücreler ve temasın aracılık ettiği DMG hücre etkileşimini araştırmak için iki veya daha fazla ayırt edici etiketleme reaktifi ve antikorun kullanılmasıyla daha da uygulanabilir. Yöntemimiz, DMG göçü ve invazyonunun hücresel ve moleküler mekanizmalarını 3D olarak araştırmak için yeni araçlar sunar ve infiltratif fenotiplerini inhibe etmek için yeni yönler sağlar.