Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi

Mikrodesenleyici bast hücre kiralite testi, hastalığın gelişiminde çok hücreli kiral morfogenezi incelemek için güçlü bir araçtır. Hücre araştırmaları için de önemlidir. Bu makromodel sisteminin üretimi ve kullanımı kolaydır, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilir ve ayrıca büyük numune boyutu için otomatik yüksek verimli işleme ile uyumludur.

Titanyum altın kaplı slaytı yaklaşık 12 x 12 milimetrelik küçük kare parçalara bölerek başlayın. Bir cam kesici kullanarak, ezilmiş bir iz bırakmak için yüzey boyunca kaydırın, ardından cam slaytı her iki tarafta tutun ve küçük mahallelere ayrılmak için göçükte bükün. Slaytı temizlemek için, altın tarafıyla, yörüngesel bir çalkalayıcıdaki Petri kabında bulunan% 100 etanol içinde en az 10 dakika bekletin.

Etanol aspire edildikten sonra, bir azot akımı ile üfleyerek slaytı kurulayın. Damgayı azot gazı ile kurutmadan önce polidimetilsiloksan veya PDMS damgalarını sabunlu suyla temizleyin. İki milimolar C18 çözeltisi yapmak için 5.74 miligram oktadecanethiol veya C18'i 10 mililitre 100% etanol içinde çözün, ardından PDMS damgalarını% 100 etanol ile temizleyin.

PDMS damgasını, desen yüzeyi aşağı bakacak şekilde C18 çözeltisinde 10 saniye bekletin ve ardından 60 saniye boyunca azot gazı ile hafifçe kurulayın. Kuruduktan sonra, pulu çıkarmadan önce 60 saniye boyunca altın slaytın üzerine bakacak şekilde yerleştirin. Doğru damgalamayı sağlamak için, desenleri düzgün bir şekilde aktarmak üzere cımbızı yavaşça damganın üzerine dokunun.

Daha sonra, bir mililitre% 70 etanol'ü ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına pipetleyerek nem odalarını hazırlayın. Cımbızları kullanarak, yüzeyi örtmek için bir parça parafilm yerleştirin ve kabarcıkların kalmamasını sağlayın. Gerekirse fazla etanol çıkarın.

Nem odasındaki parafilm üzerine her çeyrek cam slayt için 40 mikrolitre EG3 çözeltisi damlacıkları ekleyin ve damlacıklar arasında altın slaytların aralığını hesaba katmak için yeterli boşluk bırakın. C18 baskılı altın slaytı damlacığın üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirmek için cımbız kullanın ve slaytın altında kabarcık kalmamasını sağlayın. Buharlaşmayı en aza indirmek için kızakları kaldırmadan yavaşça itin.

Petri kabını parafilm ile sıkıca kapattıktan sonra, en az üç saat oda sıcaklığında bırakın. Bir biyogüvenlik kabininde, EG3'ü çıkarmak için% 70 etanolde üç kez yukarı bakan altın sürgüyü ıslatın ve durulayın, ardından sterilizasyon için 10 dakika etanol içinde bırakın. Etanol aspire edildikten sonra steril PBS ekleyin.

Gösterildiği gibi etanol yerine PBS ile başka bir nem odası hazırlayın. Daha sonra, parafilm üzerine her çeyrek slayt için 50 mikrolitre fibronektin çözeltisi damlacığı ekleyin ve damlacıklar arasında biraz boşluk bırakın. Ardından, slaytı daha önce gösterildiği gibi damlacığın üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve Petri kabını biyogüvenlik kabininde 30 dakika bekletin.

Altın kaplı slaytı üç kez duruladıktan sonra, slaytı PBS'de yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Hücreleri tohumlamadan önce, ortamı ve tripsini 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosunda ısıtın. Daha iyi hücre bağlantısı için, desen slaytını kültür ortamı içeren 12 delikli bir plakaya batırın ve inkübatörde 37 santigrat derecede ısıtın.

Hücreler tripsinize edildikten sonra, hücreleri FBS içeren medya ile nötralize edin, hücreleri üç dakika boyunca 100 kez G'de pelet edin ve daha sonra hücre peletini taze ortamda yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve mililitre başına 200.000 hücre konsantrasyonunu elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin. Bir altın slayt içeren her bir kuyucuğa 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Hücre bağlantısı için 15 dakika kuluçkaya yatmadan önce düzgün hücre tohumlaması için plakayı birkaç kez hafifçe sallayın. 15 dakika sonra, hücre ekini mikroskop altında kontrol edin ve gerekirse biraz daha kuluçkaya yatırın. Hücreler bağlandıktan sonra, her bir kuyucuktan bağlanmamış hücreler içeren ortamı aspire edin ve bir mililitre taze kültür ortamı ekleyin.

İnkübatördeki hücreleri 24 saat boyunca kültürleyin ve kiralitenin oluşup oluşmadığını belirlemek için akıcılığı kontrol edin. Gerekli akıcılık sağlandığında, kültür ortamını çıkararak hücreleri sabitleyin. PBS ile bir kez duruladıktan sonra, slayta% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve PBS ile üç kez tekrar durulamadan önce oda sıcaklığını 15 dakika inkübe edin.

Görüntüleri elde etmek için, kamera işlevselliğine sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanın ve slayttaki her halkayı yüksek çözünürlükte yakalayın. Kiralite karakterizasyonu için MATLAB kod dosyalarını indirin, kod klasörünü ve alt klasörleri MATLAB yoluna ekleyin ve ROI_selection açın. m dosyası.

Dördüncü satırda, dizini istediğiniz veri klasörüne değiştirin. 14. satırdaki görüntü boyutunu, halkanın iç daire boyutunu temsil eden ilk iki rakamla değiştirin, diğer ikisi ise dışını temsil eder. Faz kontrast görüntülerindeki ilgi alanını veya yatırım getirisini belirlemek için, ROI_selection MATLAB kodunu yürütün.

m çalıştır düğmesine tıklayarak. Halkaya sığması için seçim karesini manuel olarak sürükleyin, ardından seçimi onaylamak için resme çift tıklayın. Klasördeki tüm görüntülerden YG'yi seçtikten sonra, her görüntü için YG bilgilerini depolamak üzere bir paspas dosyası oluşturulur.

Ardından analysis_batch açın. m dosyasını açın ve daha önce gösterildiği gibi klasörün dizinini değiştirin. Kod analysis_batch yürütmek için çalıştır düğmesine tıklayın.

m, çoklu hücresel halka modellerinin kiralitesini belirlemek için. Bir datatoexcel. txt dosyası, her halka için dairesel istatistiklerin yanı sıra saat yönünde kiral olmayan ve saat yönünün tersine halkaların sayılarını içeren bir dosya oluşturulacaktır.

Mevcut bulgular, geliştirilen halka paterni kiralite testinin deneysel olarak yararlılığını ve bu testin hücre iskeletindeki değişikliklere duyarlılığını göstermektedir. Bu çalışmada, 50 nanomolar latrunkülin A tedavisi ile aktin polimerizasyonunu bozarak, fare miyoblastı C2C12 hücrelerinin, saat yönünde veya CCW kiral önyargısının saat yönünde veya CW.In ilavesine bir değişiklik sergilediği, insan göbek vasküler endotel hücrelerinin veya protein kinaz C'yi aktive etmek için 12-o-tetradekanoyl-phorbol-13-asetat veya TPA ile tedavi edilen hUVEC'lerin, hücre kiralitesinin CW'den CCW'ye doza bağlı bir kaydığını gösterdiği bulunmuştur. Kalıplara hücre tohumlamasından sonra, yanıtı incelemek için ortama kimyasallar veya ilaçlar eklenebilir ve transwell sistemi hücre ortak kültürünü incelemek için dahil edilebilir.

Bu tahlil, farklı deneysel ortamlar altında çok hücreli kiraliteyi araştırmak için etkili bir araç sağlar, hücre kiralitesinin çeşitli biyolojik fenomen ve süreçlerdeki rolü hakkında önemli bilgiler sunar.