Name: Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Öğrenin, mikrodesenleme tekniği kullanarak çok hücreli kiraliteyi in vitro olarak nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, farklı hücre türlerindeki sol-sağ asimetrileri otomatik olarak nicelendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OD / NICHD DP2HD083961 ve NHBLI R01HL148104) tarafından finanse edilmiştir. Leo Q. Wan, Pew Charitable Trusts tarafından desteklenen Biyomedikal Bilimler alanında (PEW 00026185) bir Pew Scholar'dır. Haokang Zhang, Amerikan Kalp Derneği Doktora Öncesi Bursu (20PRE35210243) tarafından desteklenmektedir.

1. Polidimetilsiloksan (PDMS) pullarının imalatı16
<ol><li>CAD yazılımını kullanarak, iç çapı 250 μm ve dış çapı 450 μm olan bir dizi mikro ölçekli halka çizin. Bu protokolde kullanılan desen, halkalar arasında 850 μm mesafeye sahip 10 x 10 dizidir.</li>
	<li>Bir mikrofabrikasyon şirketinin maske baskı hizmetini kullanarak desenin saydamlık maskesini istenen çözünürlükte yazdırın (bkz. NOT: Halkanın sağlanan boyutlarının birçok hücre tipi7 için çalıştığı kanıtlanmıştır.</li>
	<li>Negatif fotodirenç kalıbı (SU-8 gibi)8 yapmak için istenen özellikleri içeren maskeyi kullanarak ultraviyole (UV) fotolitografi yapın.<ol>
<li>Fotodirenç ile kaplanmış silikon gofret eğirme makinesini, 1.1-1.2 adımlarında üretilen saydamlık maskesiyle örtün.</li>
		<li>Bir UV temas hizalayıcısında, fotodirenci maskenin şeffaf bölgeleri altında UV ışığı ile polimerize edin. NOT: Daha fazla yıkama ve geliştirmeden sonra, istenen özelliklere sahip ana kalıp imal edilir8. Çalışma ayrıntıları, kullanılan özel ekipmana bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS elastomerik prepolimerlerini, kürleme maddesi ile 10: 1 oranında karıştırarak hazırlayın ve ardından karışımı bir Petri kabında kalıba dökün.</li>
	<li>PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için kabı 30 dakika boyunca bir vakum odasına yerleştirin ve en az 2 saat boyunca 60 ° C'de bir fırında pişirin.</li>
	<li>PDMS'nin tamamen kürlenmesinden sonra, desen dizilerini damgalar halinde kesin. NOT: Mikrokontakt baskının sonraki aşamalarında kullanım kolaylığı nedeniyle daha kalın pullar (yaklaşık 1 cm) tercih edilebilir.</li>
</ol>2. Cam slaytların kaplanması
<ol><li>Cam slaytları temizleyin. Slaytları% 100 etanol banyosuna batırın, 5 dakika boyunca sonikatın ve ardından suyla durulayın.</li>
	<li>Bu adımı önce asetonla, sonra izopropanolle, ardından azot akışında kurutarak tekrarlayın.</li>
	<li>Cam slaytlar üzerindeki titanyum ve altın katmanları kaplamak için bir elektron ışını (E-ışın) buharlaştırma ekipmanı kullanın. NOT: Titanyum tabakası için istenen kalınlık 15 Å'dır (1 ş= 10-10 m). Altın tabaka için istenen kalınlık 150 Å'dir. Titanyum tabakası altın ve cam slayt arasında bir yapıştırıcı görevi gördüğünden, önce titanyumu ve sonra altını kaplayın.</li>
	<li>Temizlenmiş kızakları buharlaştırma odasına yerleştirin ve panjurların altına altın ve titanyum potalar yerleştirin.</li>
	<li>Metalleri eritmeden önce 10-5 Pa'dan daha düşük bir vakum oluşturmak için odayı aşağı pompalayın. Elektron ışınını metale odaklayın ve gücü, biriktirme hızının biriktirme kalınlığını kontrol etmek için uygun olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Metal biriktirmeyi başlatmak için deklanşörü açın. İstenilen kalınlığa ulaşıldığında deklanşörü kapatın.</li>
	<li>Potaları iki metalin sıralı buharlaşması arasında değiştirin.</li>
	<li>Potaların ekipmanın gerektirdiği şekilde soğumasını bekleyin, odayı boşaltın ve altın kaplı cam kızakları dışarı çıkarın.</li>
	<li>Ekipman bakımı için odayı tekrar aşağı pompalayın. NOT: Çalışma detayları belirli bir E-ışınlı evaporatöre bağlı olabilir. İyi kontrol edilmiş, düşük titanyum biriktirme oranına sahip olmak önemlidir. Kalın bir titanyum tabakası, özellikle hücrelerin floresan görüntülemesi için genellikle zayıf görünürlüğe yol açar. Titanyum/altın kaplı cam slaytlar kaplamadan sonra oda sıcaklığında kuru vakum odasında en az 1 ay saklanabilir.</li>
</ol>3. Mikrokontakt baskı
<ol><li>İsterseniz titanyum/altın kaplı sürgüyü daha küçük parçalara ayırın. Tipik bir uygulama için 12 mm x 12 mm'lik kare bir şekil önerilir (Şekil 1B).</li>
	<li>Ezilmiş bir iz bırakmak için yüzey boyunca kaymak için bir cam kesici kullanın, ardından cam sürgüyü her iki tarafta tutun ve küçük mahallelere ayrılmak için göçükte bükün. Altın kaplı yüzeye dokunmaktan kaçının. NOT: Yanlışlıkla devrilme durumunda camın hangi tarafının kaplanmış yüzey olduğunu görsel olarak belirlemek için, ışığın her iki taraftaki yansımasını karşılaştırın. Altın kaplı yüzey daha parlak bir yansıma gösterirken, kaplanmamış taraf daha kısık bir yansımaya sahip olacaktır (camın diğer tarafındaki titanyum tabakasından). Alternatif bir yol, kızağın kenarlarını gözlemlemektir ve kaplama tarafı dikey kesme yüzeyinden belirlenebilir.</li>
	<li>Slaytları, bir Petri kabında% 100 etanol içine batırarak, altın tarafı yörüngesel bir çalkalayıcıda en az 10 dakika boyunca yukarı bakacak şekilde temizleyin. Etanolün aspire edilmesi, ardından her slaytın bir azot akımı ile üflenerek kurutulması.</li>
	<li>PDMS pullarını sabunlu su ve% 100 etanol ile temizleyin. Pulları azot gazı ile kurulayın.</li>
	<li>10 mL% 100 etanol içinde 5.74 mg C18 tozunu çözerek 2 mM oktadecanethiol (C18) çözeltisi hazırlayın. NOT: C18 solüsyonunu oda sıcaklığında kapatın ve saklayın. C18 ile baskı desenleri, fibronektin ve hücrelerin tercihen bağlanacağı yapışkan, kendinden montajlı bir tek katman oluşturur.</li>
	<li>PDMS damgalarını, desenli yüzeyi 10 sn boyunca aşağı bakacak şekilde C18 çözeltisine batırın ve 60 sn boyunca azot gazı ile hafifçe kurulayın. NOT: Kurutulurken, çoğu sıvı buharlaşana kadar akışı önce damgadan uzağa (yaklaşık 1 m) yerleştirin ve ardından damgayı tamamen kurutmak için akışı yavaşça yaklaştırın. Bu, C18 çözeltisinin damga üzerinde kuruması yerine üflenmesini önlemek içindir.</li>
	<li>Çıkarmadan önce damgayı 60 saniye boyunca altın slaytların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.</li>
	<li>Doğru damgalamayı sağlamak için, desenleri düzgün bir şekilde aktarmak üzere cımbızları yavaşça pulların üzerine dokunun. Çok sert bastırmayın ve cımbızın ağırlığı tipik olarak yeterlidir. NOT: Kılavuz çekme sırasında damganın görsel olarak incelenmesi, damganın ve cam sürgünün düzgün bir şekilde temas etmesini sağlayacaktır.</li>
	<li>Nem odaları hazırlayın.<ol>
<li>Pipet, ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına 1 mL% 70 etanol koyun ve yüzeyi örtmek için bir parça parafilm yerleştirin (yüzü yukarı bakacak şekilde örtülür).</li>
		<li>Kaldırmak için cımbız kullanın, hava kabarcığı olmadığından emin olmak için parafilm yerleştirin ve gerekirse fazla etanol çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>2 mM HS-(CH2)11-EG 3-OH (EG3) çözeltisi hazırlayın: 5 mL% 100 etanol içinde 5 μL stok çözeltisini seyreltin. NOT: Seyreltilmiş EG3 çözeltisi 4 °C'de kapatılabilir ve saklanabilir ve seyreltilmemiş EG3 stoğu -20 °C'de saklanmalıdır. EG3 işlemi, C18 içermeyen cam bölgesini hücrelere yapışkan olmayan hale getirmek için kullanılır.</li>
	<li>Her çeyrek cam için mikropipet 40 μL EG3 damlacıkları nem odasındaki parafilm üzerine kaydırılır ve damlacıklar arasında altın slaytların aralığını hesaba katmak için yeterli boşluk bırakır.</li>
	<li>C18 baskılı altın slaytları damlacıkların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek ve slaytların altında kabarcık olmadığından emin olmak için cımbız kullanın. Buharlaşmayı en aza indirmek için kızakları kaldırmadan yavaşça itin. NOT: Camın bir kenarının damlacığın yanına aşağı doğru kaymasını yerleştirin ve ardından camın diğer ucunu yavaşça aşağı doğru indirin. Bir kabarcık varsa, kabarcık artık mevcut olmayana kadar altın slaytı kaldırmadan itin.</li>
	<li>Petri kabını parafilm ile sıkıca kapatın ve oda sıcaklığında en az 3 saat bekletin. NOT: Kapsamlı inkübasyon isteniyorsa, Petri kabını çift kapatın ve 24 saate kadar bekletin.</li>
	<li>Bir biyogüvenlik dolabında, altın slaytları bir Petri kabına yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin, EG3'ü çıkarmak için% 70 etanolde 3 kez ıslatın ve durulayın, ardından sterilizasyon için 10 dakika boyunca etanolde bırakın.</li>
	<li>Etanol aspire edin ve steril PBS ile değiştirin.</li>
	<li>Adım 3.9'da açıklandığı gibi, etanol yerine PBS ile başka bir nem odası hazırlayın. NOT: Yüzey gerilimindeki fark nedeniyle, önce parafilm döşemek ve kabarcıkları çıkarmak için 4-5 mL PBS eklemek, ardından fazlalığı aspire etmek daha kolaydır.</li>
	<li>50 μg / mL fibronektin çözeltisini (istenirse diğer proteinler) steril PBS ve mikropipet içinde hazırlayın 50 μL fibronektin çözeltisi damlacıkları her çeyrek için parafilm üzerine kaydırın ve damlacıklar arasında biraz boşluk bırakın. NOT: Fibronektin kaplama, desenli yüzeylere hücre yapışmasını kolaylaştırır.</li>
	<li>Slaytları damlacıkların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirmek ve slaytların altında kabarcık olmadığından emin olmak için gofret cımbız kullanın. Slaytları kaldırmadan yavaşça itin. NOT: Slaytların işlenmesi için cam sürgü cımbız veya düz geniş uçlu gofret cımbız önerilir.</li>
	<li>Petri kabını biyogüvenlik kabininde 30 dakika bekletin.</li>
	<li>30 dakika sonra, altın slaytları 3 kez duruladıktan sonra PBS'ye yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. NOT: Fibronektin desenli slaytlar PBS'de 4 °C'de yaklaşık bir ay saklanabilir.</li>
</ol>4. Hücreleri mikro desenli slaytlara tohumlama
<ol><li>Hücre kültürü ortamını ve tripsini 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın. NOT: Aşağıdaki alt kültür açıklaması NIH/3T3 hücreleri içindir. Kültür koşulları hücre tiplerine bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>(İsteğe bağlı) Desenli slaytları kültür ortamında 12 delikli bir plakaya batırın, daha iyi hücre bağlantısı için hücrelerin tripsinizasyonundan önce bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ısıtın.</li>
	<li>Hücreleri tripsinize edin, FBS içeren ortamlarla nötralize edin, 3 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın ve ardından taze ortamlarla iyice karıştırarak yeniden askıya alın. NOT: Hücrelerin birbirinden tamamen ayrıştığından emin olun.</li>
	<li>Hücreleri sayın, 200.000 hücre / mL'ye seyreltin ve bir altın slayt içeren her bir kuyucuğa 0,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
	<li>Tek tip hücre tohumlaması için kuyu plakasını birkaç kez hafifçe çalkalayın ve hücre tutturmasına izin vermek için 15 dakika boyunca bir inkübatörde saklayın.</li>
	<li>15 dakika sonra, hücre bağlantısını mikroskop altında kontrol edin. Gerekirse ek süre tanıyın. NOT: Ekli hücreler görünür filopodyum veya düzleşme ile yüzeye yayılacak ve kuyu plakasına hafifçe dokunulduğunda veya hareket ettirildiğinde yüzeyden hareket etmeyecektir.</li>
	<li>Her bir kuyucuktan bağlanmamış hücreler içeren ortamı aspire edin ve 1 mL kültür ortamı ekleyin. İlaç tedavisi için, bu adımda kültür ortamına ek reaktifler ekleyin.</li>
	<li>İnkübatördeki hücreleri 24 saat boyunca kültürleyin ve kiralitenin oluşup oluşmadığını belirlemek için akıcılığı kontrol edin. NOT: Çoğu hücre tipi için% 75'in üzerinde akıcılık önerilir ve aşırı akıcılık kiralite karakterizasyonunu etkileyebilir.</li>
</ol>5. Görüntü toplama
<ol><li>Hücreleri akıcılık üzerine sabitleyin.<ol>
<li>Kültür ortamını kuyu plakasından çıkarın ve PBS ile bir kez durulayın.</li>
		<li>% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve ardından PBS ile 3 kez durulayın. NOT: Fiksasyon hücre morfolojisini önemli ölçüde değiştiriyorsa, fiksasyondan önce görüntüleme önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kamera işlevselliğine sahip bir faz kontrastı mikroskobu kullanın, slaytlardaki her halkayı yüksek çözünürlükte görüntüleyin (analiz için 10x nesne lensi yeterlidir).</li>
</ol>6. Hücre kiralite karakterizasyonu (Şekil 2)
<ol><li>Ek dosyalardan kiralite karakterizasyonu için MATLAB kod dosyalarını indirin (Ek Dosya 1). NOT: Kod, hem Windows hem de macOS sistemlerinde MATLAB_R2015b ve sonraki sürümlerle çalışacak şekilde test edilmiştir. Döngüsel istatistik araç kutusu, başvuru17'de bulunan dosyaları çalıştırmak için de gereklidir.</li>
	<li>Kod klasörünü ve alt klasörleri (içinde dairesel istatistik araç kutusu bulunan) MATLAB yoluna ekleyin ve "ROI_selection.m" dosyasını açın. 4. satırda, dizini istediğiniz veri klasörüne değiştirin (Windows kullanıcıları için, 4. ve 5. satırlarda "/" yerine "\" değiştirin).</li>
	<li>14. satırdaki görüntü boyutunu, ilk iki rakam halkanın iç daire boyutunu temsil ederken, diğer ikisi dışını temsil edecek şekilde değiştirin. NOT: Analiz edilecek bir klasördeki tüm görüntülerin boyutlarının aynı olduğundan emin olun.</li>
	<li>Faz kontrastlı görüntülerdeki ilgi alanını (ROI) belirlemek üzere "ROI_selection.m" MATLAB kodunu yürütmek için Çalıştır düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Halkaya sığması için seçim karesini manuel olarak sürükleyin, ardından seçimi onaylamak için resme çift tıklayın.</li>
	<li>Klasördeki her görüntü için bu adımı tekrarlayın (önceki bir görüntünün YG seçimini onayladıktan sonra bir sonraki görüntü otomatik olarak açılır); her görüntünün yatırım getirisi bilgilerini depolamak için bir ".mat" dosyası oluşturulur.</li>
	<li>"Analysis_batch.m" dosyasını açın ve adım 6.2 ile aynı klasörün dizinini değiştirin. (Pencere kullanıcıları için, ilk kez kullanım için, 5, 6, 124 ve 130. satırlarda "/" yerine "\" değiştirin)</li>
	<li>Birden fazla hücresel halka modelinin kiralitesini belirlemek üzere "Analysis_batch m" kodunu yürütmek için Çalıştır düğmesine tıklayın. Her halka için dairesel istatistiklerin yanı sıra saat yönünde, kiral olmayan ve saat yönünün tersine halkaların sayılarını içeren bir "datatoexcel.txt" dosyası oluşturulacaktır.</li>
</ol>

<ol><li>Wan, L. Q., Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+chirality%3A+emergence+of+asymmetry+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell chirality: emergence of asymmetry from cell culture.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371, 20150413(2016).</li>
<li>Rahman, T., Zhang, H., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+chirality+in+cardiovascular+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Cell chirality in cardiovascular development and disease.</a> APL Bioengineering. 4 (3), (2020).</li>
<li>Inaki, M., Liu, J., Matsuno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+chirality%3A+Its+origin+and+roles+in+left-right+asymmetric+development%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell chirality: Its origin and roles in left-right asymmetric development.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1710), 20150413(2016).</li>
<li>Utsunomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+with+broken+left-right+symmetry%3A+Roles+of+intrinsic+cell+chirality+in+left-right+asymmetric+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Symmetry%22%5BJournal%5D)">Cells with broken left-right symmetry: Roles of intrinsic cell chirality in left-right asymmetric epithelial morphogenesis.</a> Symmetry. 11 (4), 505(2019).</li>
<li>Tamada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+neuronal+motility%3A+The+missing+link+between+molecular+chirality+and+brain+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Symmetry%22%5BJournal%5D)">Chiral neuronal motility: The missing link between molecular chirality and brain asymmetry.</a> Symmetry. 11 (1), 102(2019).</li>
<li>Tee, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+chirality+arising+from+the+self-organization+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular chirality arising from the self-organization of the actin cytoskeleton.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 445-457 (2015).</li>
<li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+mammalian+cells+exhibit+phenotype-specific+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Micropatterned mammalian cells exhibit phenotype-specific left-right asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12295-12300 (2011).</li>
<li>Fan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+chirality+regulates+intercellular+junctions+and+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell chirality regulates intercellular junctions and endothelial permeability.</a> Science Advances. 4 (10), 2111(2018).</li>
<li>Singh, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+nanotube-induced+loss+of+multicellular+chirality+on+micropatterned+substrate+is+mediated+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Carbon nanotube-induced loss of multicellular chirality on micropatterned substrate is mediated by oxidative stress.</a> ACS Nano. 8 (3), 2196-2205 (2014).</li>
<li>Zhang, H., Fan, J., Zhao, Z., Wang, C., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Alzheimer%27s+disease-related+proteins+on+the+chirality+of+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effects of Alzheimer's disease-related proteins on the chirality of brain endothelial cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 14, 231-240 (2021).</li>
<li>Chen, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+symmetry+breaking+in+tissue+morphogenesis+via+cytoskeletal+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Left-right symmetry breaking in tissue morphogenesis via cytoskeletal mechanics.</a> Circulation Research. 110 (4), 551-559 (2012).</li>
<li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+cellular+chirality+regulates+left-right+symmetry+breaking+during+cardiac+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Intrinsic cellular chirality regulates left-right symmetry breaking during cardiac looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 11568-11577 (2018).</li>
<li>Fan, J., Zhang, H., Rahman, T., Stanton, D. N., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+organelle-based+analysis+of+cell+chirality%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+and+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell organelle-based analysis of cell chirality.</a> Communicative and Integrative Biology. 12 (1), 78-81 (2019).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanowire+magnetoscope+reveals+a+cellular+torque+with+left-right+bias%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Nanowire magnetoscope reveals a cellular torque with left-right bias.</a> ACS Nano. 10 (8), 7409-7417 (2016).</li>
<li>Wan, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+human+stem+cell+morphology+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Geometric control of human stem cell morphology and differentiation.</a> Integrative Biology. 2 (7-8), 346-353 (2010).</li>
<li>Circular Statistics Toolbox. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics">https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/10676-circular-statistics-toolbox-directional-statistics</a> (2021).</li>
<li>Chin, A. S., Worley, K. E., Ray, P., Kaur, G., Fan, J., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+chirality+revealed+by+three-dimensional+spontaneous+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell chirality revealed by three-dimensional spontaneous rotation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (48), 12188-12193 (2018).</li>
<li>Worley, K. E., Chin, A. S., Wan, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+chiral+biases+of+human+embryonic+stem+cells+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific chiral biases of human embryonic stem cells during differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 1848605(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Burada açıklanan halka şeklindeki modelleme testi, çok hücreli kiralitenin kantitatif karakterizasyonu için kullanımı kolay, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilen bir araç sağlar. Aynı tanımlanmış mikro ortamların hızlı bir şekilde oluşturulması ve tarafsız analiz, büyük boyutlu numunelerin otomatik olarak yüksek verimli bir şekilde işlenmesini sağlar. Bu protokol, halka mikro desenlerinin üretimini, hücre desenini ve önyargılı hücre hizalamasının ve yönlü hareketin otomatik analizini tartışır. Bu y...

Hücrenin sol-sağ (LR) asimetrisi, hücresel elverişlilik veya kiralite olarak da bilinir, LR eksenindeki hücre polaritesini tanımlar ve temel, korunmuş, biyofiziksel bir özellik olarak kabul edilir 1,2,3,4,5. Hücre kiralitesi hem in vivo hem de in vitro olarak çoklu ölçeklerde gözlenmiştir. Önceki bulgular, dairesel adalar 6'ya ekilen tek hücrelerde aktin sitoiskeletinin kiral dönüşünü, 7,8,9,10,11 sınırlı sınırlar içindeki hücrelerin önyargılı göçünü ve hizalanmasını ve tavuk ısı tüpünün asimetrik döngüsünü 12 ortaya koymuştur.
Çok hücreli düzeyde, hücre kiralitesi yönlü migrasyon veya hizalama, hücresel rotasyon, sitoiskelet dinamikleri ve hücre organeli konumlandırma 7,8,9,10,11,12,13 ile belirlenebilir. 7,8,9,10 yapışkan hücrelerin kiral yanlılığını etkili bir şekilde karakterize etmek için mikrosendikleme tabanlı 14 tahlil oluşturduk. Halka şeklindeki mikro desenlerin geometrik olarak hücre kümelerini sınırlamasıyla, hücreler toplu olarak yönlü göç ve önyargılı hizalama sergiler. Halkanın faz-kontrast görüntülerindeki hücre hizalamasını otomatik olarak tespit etmek ve ölçmek için bir MATLAB programı geliştirilmiştir. Yerel hücre hizalamasının yönü, çevresel yönden sapmasına bağlı olarak önyargılı bir açı ile ölçülür. İstatistiksel analizi takiben, hücrelerin halka paterni saat yönünün tersine (CCW) önyargılar veya saat yönünde (CW) önyargılar olarak belirlenir.
Bu tahlil, çoklu hücre fenotiplerinin kiralitesini karakterize etmek için kullanılmıştır (Tablo 1) ve hücrelerin LR asimetrisinin fenotipe özgü 7,11,15 olduğu bulunmuştur. Ayrıca, aktin dinamikleri ve morfolojisindeki bozulma, kiral önyargı 7,8'in tersine dönmesine neden olabilir ve oksidatif stres hücre kiralitesini de değiştirebilir9. Prosedürün basitliği ve 7,8,9,10 yaklaşımının sağlamlığı nedeniyle, bu 2D kiralite testi, in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek ve incelemek için etkili ve güvenilir bir araç sağlar.
Bu protokolün amacı, hücre kiralitesini karakterize etmek için bu yöntemin kullanımını göstermektir. Bu protokol, mikrokontakt baskı tekniği ile desenli hücresel dizilerin nasıl üretileceğini ve MATLAB programını kullanarak otomatik bir şekilde kiralite analizinin nasıl yapılacağını açıklar.

<table><tbody><tr><td>200 geçirmez etanol</td><td>Koptec</td><td>DSP-MD-43</td><td></td></tr><tr><td>BZX mikroskop sistemi</td><td>Keyence</td><td>BZX-600</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM), yüksek glikoz</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Elektron ışını evaporatörü</td><td>Temscal</td><td>BJD-1800</td><td>Altın-titanyum film kaplama</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>VWR</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Sığır plazmasından fibronektin</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Cam mikroskop slaytları</td><td>VWR</td><td>10024-048</td><td></td></tr><tr><td>Cam cımbız</td><td>Exelta</td><td>390BSAPI</td><td></td></tr><tr><td>Altın buharlaşma peletleri</td><td>Uluslararası Gelişmiş Malzemeler</td><td>AU18</td><td></td></tr><tr><td>HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m11.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>MATLAB_R2020b</td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>OAI temas hizalayıcı</td><td>OAI</td><td>200</td><td>UV fotolitografi</td></tr><tr><td>Oktadekanetiol (C18)</td><td>Sigma</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Araştırma ürünü uluslararası</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>DC4019862</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Gofret</td><td>Üniversitesi Gofret</td><td>Kimliği # 809</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050 fotorezist</td><td>MicroChem</td><td>Y311075 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>Titanyum buharlaşma peletleri</td><td>Uluslararası Gelişmiş Malzemeler</td>: <td>TI14</td><td></td></tr>, <tr><td>Şeffaflık maskesi (özellikli),</td> <td>Outputicity.com</td><td>N / A</td>, <td>Maske baskı hizmeti</td></tr>: <tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25),</td> <td>Thermo fisher scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre kiralitesini Ölçmek için bir mikrodesenleme testi

A Micropatterning Assay for Measuring Cell Chirality

Kiralite, asimetriyi hücrenin sol-sağ ekseni boyunca polarizasyon açısından gösteren içsel bir hücresel özelliktir. Bu eşsiz özellik, hem gelişim hem de hastalıktaki önemli rolleri nedeniyle artan bir dikkat çektiğinden, hücre kiralitesini karakterize etmek için standartlaştırılmış bir niceleme yöntemi, araştırmayı ve potansiyel uygulamaları ilerletecektir. Bu protokolde, mikrodesenli hücre dizilerini kullanan çok hücreli bir kiralite karakterizasyon testini tanımlıyoruz. Hücresel mikro desenler, mikrokontakt baskı yoluyla titanyum / altın kaplı cam slaytlar üzerinde üretilir. Geometrik olarak tanımlanmış (örneğin, halka şeklinde), protein kaplı adalarda tohumlamadan sonra, hücreler yönlü olarak göç eder ve özel olarak yazılmış bir MATLAB programı tarafından otomatik olarak analiz edilebilen ve ölçülebilen saat yönünde veya saat yönünün tersine doğru önyargılı bir hizalama oluşturur. Burada mikro desenli substratların üretimini, hücre tohumlamasını, görüntü toplamayı ve veri analizini ayrıntılı olarak açıklıyoruz ve NIH / 3T3 hücreleri kullanılarak elde edilen temsili sonuçları gösteriyoruz. Bu protokol daha önce yayınlanmış birçok çalışmada doğrulanmıştır ve in vitro hücre kiralitesini incelemek için etkili ve güvenilir bir araçtır.

NIH / 3T3 hücrelerinin tohumlanmasından on beş dakika sonra, halka paternindeki hücre yapışması, faz kontrastlı görüntüleme ile görsel olarak doğrulandı. Daha sonra 24 saatlik kültürden sonra, desenler üzerindeki hücreler birleşti ve saat yönüne doğru önyargılı, açıkça asimetrik hizalamalarla uzadı (Şekil 2). Bağlı hücrelerin yönlü göçü hızlandırılmış görüntüleme ile kaydedilir, hücre hareketliliği ve morfogenezi videonun daha ileri analizleriyle ölçülebilir. Kiralite analizi yapmak için, fi...

Mikrodesenleme tekniğini kullanarak in vitro çok hücreli kiraliteyi belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, çeşitli hücre tiplerinin sol-sağ önyargılarının otomatik olarak ölçülmesine izin verir ve tarama amacıyla kullanılabilir.

Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi

Chirality is an intrinsic cellular property, which depicts the asymmetry in terms of polarization along the left-right axis of the cell. As this unique ...

Mikrodesenleyici bast hücre kiralite testi, hastalığın gelişiminde çok hücreli kiral morfogenezi incelemek için güçlü bir araçtır. Hücre araştırmaları için de önemlidir. Bu makromodel sisteminin üretimi ve kullanımı kolaydır, son derece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar üretebilir ve ayrıca büyük numune boyutu için otomatik yüksek verimli işleme ile uyumludur.Titanyum altın kaplı slaytı yaklaşık 12 x 12 milimetrelik küçük kare parçalara bölerek başlayın. Bir cam kesici kullanarak, ezilmiş bir iz bırakmak için yüzey boyunca kaydırın, ardından cam slaytı her iki tarafta tutun ve küçük mahallelere ayrılmak için göçükte bükün. Slaytı temizlemek için, altın tarafıyla, yörüngesel bir çalkalayıcıdaki Petri kabında bulunan% 100 etanol içinde en az 10 dakika bekletin.Etanol aspire edildikten sonra, bir azot akımı ile üfleyerek slaytı kurulayın. Damgayı azot gazı ile kurutmadan önce polidimetilsiloksan veya PDMS damgalarını sabunlu suyla temizleyin. İki milimolar C18 çözeltisi yapmak için 5.74 miligram oktadecanethiol veya C18'i 10 mililitre 100% etanol içinde çözün, ardından PDMS damgalarını% 100 etanol ile temizleyin.PDMS damgasını, desen yüzeyi aşağı bakacak şekilde C18 çözeltisinde 1

a-micropatterning-assay-for-measuring-cell-chirality

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz, bir substrat üzerindeki istenilen noktada hücre yerleştirmek için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu yöntem desen hücreleri yüzeye hücreleri ile dolu mikro oyukların içeren bir silikon çip saygısız. Bu yöntem yayılabilir ve juxtacrine hücreleri arasındaki sinyal modüle etmek için yeni bir yol sağlar.

Bio Flip-Chip kullanarak Embriyonik Kök Hücreler, Desenlendirme

Hücresel mimarili normale Yapıştırıcı micropatterns, ilaç etkileri algılama duyarlılığını artırmak, tekrarlanabilirlik geliştirmek ve otomatik görüntü elde edilmesi ve analizi basitleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji, geleneksel hücre kültürleri destekleyen üzerinde gerçekleştirilen ve dolayısıyla aşırı hücre-hücre değişkenlik muzdarip ilaç / siRNA tarama testleri, fayda sağlayacaktır.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

Bu videoda, halka mikro modeli gibi sınırlı bir geometrik sınırdaki hücrelerin hizalama yanlılığını belirlemek için bir hücre kiralite testini açıklıyoruz. Kiralite, çoğu hücre tipinin doğal bir özelliğidir ve genetik ve çevresel faktörler tarafından belirlenir. Normal bir hücre popülasyonunun kiralitesini bilmek, ilaçla tedavi edilen hücrelerin taranmasına yardımcı olabilir.

Halka Şeklinde Mikro Modelleme Hücre Kiralite Deneyi: Halka Şeklindeki Mikro Desenlerde Hücre Hizalamasına Dayalı Çok Hücreli Kiraliteyi Belirlemek İçin İn Vitro Bir Teknik

Bu protokol, SiO 2 hücre modelleme için bir mikroimalat uyumlu bir yöntemi tarif etmektedir. Önceden tanımlanmış bir parylene C dizayn photolithographically SiO 2 gofret yazdırılır. Serum (veya başka bir etkinleştirme solüsyonu) ile inkübasyondan sonra hücreler için özel olarak uygun (ve uygun göre gelişir) SiO 2 bölgeleri ile püskürtüldü olmak iken esas parylene,-C,.

Photolithographically Tanımlı Parylene-C hücre Desenlendirme: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Yüzeyleri

Bu makalede, farklı patolojileri temsil eden farklı şekillerde kardiyak miyositlerin yetiştirilmesi ve morfolojilerine göre bu yapışık kardiyak miyositlerin tek hücre düzeyinde sıralanması için yöntemler yer alıyor. Önerilen platform kalp yetmezliği farklı türleri için yüksek iş ve ilaç tarama için yeni bir yaklaşım sağlar.

ŞekilBağımlı Transkripsiyonları Tek Hücre Düzeyinde Çalışma Yaklaşımı

Burada DNA programlı yapıştırma kullanarak mikropattern hücrelere tek hücreli çözünürlükte bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, cam bir slaytta DNA oligonükleotid desenleri oluşturmak için bir tezgah üstü fotolithografi platformu kullanır ve daha sonra hücre zarlarını ticari olarak mevcut tamamlayıcı oligonükleotidlerle etiketler. Oligoların hibridizasyonu programlanmış hücre yapıştırılması ilesonuçlanır.

DNA Kullanarak Hücrelerin Basit, Uygun Fiyatlı ve Modüler Deseni

Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.

Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Geleneksel olarak, hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamını in vivo olarak zayıf bir şekilde taklit eden düzlemsel substratlar üzerinde gerçekleştirilir. Burada, fizyolojik olarak ilgili kavisli geometrilere ve mikro desenli hücre dışı proteinlere sahip hücre kültürü substratları üretmek için bir yöntem tanımladık ve bu hücre dışı ipuçlarının hücresel olarak algılanmasına sistematik araştırmalara izin veriyoruz.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

Gömülü demir parçacıkları içeren ultra yumuşak bir silikon elastomer (polidimetilsiloksan, PDMS) kullanılarak üretilen dinamik ve geri dönüşümlü bir sertlik test platformu sunuyoruz. Bu yeni tahlil, temas rehberliği de dahil olmak üzere hücre fenotiplerinde ortaya çıkan zamana bağlı fiziksel değişiklikleri incelemek için uygundur. Burada, manyetikler kullanılarak matriks sertleşmesi üzerine yenidoğan sıçan kardiyomiyosit hizalamasını ölçüyoruz.

Kardiyomiyosit Hizalamasındaki Değişiklikleri Yönlendirmek için Mikro Desenli Manyeto-Reolojik Elastomerler

Öğrenin, mikrodesenleme tekniği kullanarak çok hücreli kiraliteyi in vitro olarak nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, farklı hücre türlerindeki sol-sağ asimetrileri otomatik olarak nicelendirmeyi sağlar.

Hücre Kiralitesini Ölçmek için Bir Mikrodesenleme Testi

Daha fazla video keşfet