Name: Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Öğrenin, fare kemik iliğinden yüksek saflıkta dendritik hücre izolasyonu için ekonomik ve verimli bir protokol. GM-CSF/IL-4 ile 7 günlük kültürde hücre bağışıklığı araştırmaları için yüksek verimli sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Tianjin Bilim ve Teknoloji Planı Programı (20JCQNJC00550), Tianjin Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Projesi (TJWJ202021QN033 ve TJWJ202021QN034) tarafından desteklenmiştir.

Tüm prosedürler Nanjing Tıp Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Kemik iliğinin izolasyonu ve BM hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>C57BL / 6 farelerini (18-22 g, 6-8 haftalık) CO2 boğulması yoluyla feda edin. Fareyi fare ameliyat masasına sabitleyin. Yüzeyleri% 70 etanol ile dezenfekte edin.</li>
	<li>Kasları ve femoral arteri açığa çıkarmak için bacağın derisini kesin. İki forseps kullanarak femoral arteri kelepçeleyin ve yırtın, ardından proksimal ucu karnına doğru çekin. NOT: Femoral arteri doğrudan kesmeyin. Aksi takdirde, aşırı kanamaya neden olur ve görüş alanını kirletir.</li>
	<li>Femur çevresindeki tüm kasları kesin.</li>
	<li>Kalça eklemi çıkığı sesi duyulana ve femur başı prolapsusu görülene kadar farenin alt uzuvlarını yavaşça dışa doğru gerin.</li>
	<li>Femur başının iç kısmı boyunca makas kullanarak alt ekstremiteleri vücuttan ayırın.</li>
	<li>Serbest ve eksiksiz bir femur elde etmek için arka bacakları diz ekleminin ucundan kesin.</li>
	<li>Gazlı bez kullanarak femura bağlı kasları çıkarın. NOT: Kasları doğrudan yırtmayın. Farelerin femuru hassastır, bütünlüğü korunmalıdır.</li>
	<li>Femuru 2-5 dakika boyunca% 75 alkole batırın.</li>
</ol>2. BMDC'nin indüksiyon kültürü
<ol><li>Artık alkolü PBS ile durulayın. Femurun orta ve alt kısmını sıkıştırmak için hemostatik forseps ve femur alt ucunu sıkıştırmak için başka bir set kullanın. Hemostatik forsepsler femura lateral olarak uygulanır ve femur epifizyel hattan ayrılır. NOT: Epifizyal çizgi, femur kırılana kadar kolayca görülemez. Bu ve sonraki adımların tümü steril bir ortamda gerçekleştirilir.</li>
	<li>Epifizyal çizgi kırılmasından kemik iliği boşluğuna nüfuz etmek için 1 mL'lik bir şırınga (iğne: 0.6 mm x 25 mm) kullanın ve femur kafasına ve kemik iliği boşluğuna nüfuz etmek için iğneyi döndürün. Kemik beyazlaşana kadar GM-CSF / IL-4 içeren tam ortamın 1 mL'sini kullanarak kemik iliği boşluğunu nabız atın ve yıkayın. NOT: Tam kültür ortamı: %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin, 55 μM β-Merkaptoetanol, 10 ng/mL GM-CSF ve 10 ng/mL IL-4.</li>
	<li>Tüm hücreleri 24 mL tam kültür ortamında (~ 5 x 105 hücre / mL) yeniden askıya alın. Karıştırdıktan sonra, tüm ortam 4 mL / kuyucuklu 6 delikli bir plakaya tohumlandı, daha sonra 2 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edildi. NOT: Eritrositlerin lize edilmesi gerekli değildir.</li>
	<li>2 gün sonra tüm ortamları GM-CSF / IL-47 içeren ortamla değiştirin. Dördüncü, altıncı ve sekizinci günlerde, ortamın yarısını 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 içeren tam ortamla değiştirin. NOT: Bu adımda, eritrositler ve lenfositler gibi askıda kalan hücreler çıkarılır.</li>
	<li>Hücre büyümesini kaydetmek için her gün fotoğraf çekin. Altıncı günden itibaren, hücre sayısını saymak ve CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonu 6,7'yi tespit etmek için günde bir kuyucuk hücre toplayın.</li>
</ol>3. CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonunun akış sitometrik tespiti
<ol><li>DC'leri PBS ile yıkadıktan sonra, 100 μL FACS tamponunda 1 x 106 hücreyi yeniden askıya alın, 0,5 μg anti-fare CD16/32 antikoru ekleyin ve spesifik olmayan antijen bölgelerini bloke etmek için buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>1 μg Percp/cy5.5-CD11c, 0.5 μg PE-CD80 ve 0.04 μg APC-MHC II antikorları ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>4 °C'de 3 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı çıkarın, 1 mL% 4 paraformaldehit ekleyin, 4 ° C'de 30 dakika sabitleyin ve 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Akış sitometrisi gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını ve açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

İnsanlar ve fareler, klasik DC'ler (cDC1'ler ve cDC2'ler dahil cDC'ler) plazmasitoid DC'ler (pDC'ler) ve monosit kaynaklı DC'ler (MoDC'ler) 9,10,11 dahil olmak üzere farklı DC alt kümelerine sahiptir. Genel olarak, cDC1'lerin hücre içi patojenlere ve kansere karşı sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını düzenlediği ve cDC2'lerin hücre dışı patojenlere, parazitlere ve alerjenlere karşı immün yanıtları düzenlediği kabul edilmekted...

Dendritik hücreler (DC'ler), naif T hücrelerini aktive etmek ve bulaşıcı hastalıklara, alerji hastalıklarına ve tümör hücrelerine karşı spesifik sitotoksik T lenfosit (CTL) yanıtlarını indüklemek için en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC'ler) 1,2,3. DC'ler doğuştan gelen bağışıklık ile adaptif immünite arasındaki birincil bağlantıdır ve immünolojik savunmada ve immün toleransın korunmasında önemli bir rol oynarlar. Son 40 yılda, birçok araştırmacı DC'lerin alt kümelerini ve inflamasyon ve bağışıklıktaki işlevlerini tanımlamaya çalışmıştır. Bu çalışmalara göre, DC'ler kemik iliği hücrelerinden miyeloid ve lenfoid soylar boyunca gelişir. Tümör aşıları son yıllarda önemli kilometre taşları kazanmıştır ve umut verici bir geleceğe sahiptir. Mekanik olarak, tümör aşıları immün yanıtı modüle eder ve tümör antijenlerini kullanarak sitotoksik T lenfositleri aktive ederek tümör büyümesini önler. DC'lere dayanan aşı, tümör immünoterapisinde önemli bir rol oynamaktadır ve en umut verici anti-tümör tedavilerinden biri olarak tanımlanmıştır 1,4. Ek olarak, DC'ler yeni moleküler hedefli ilaçların ve immün kontrol noktası inhibitörlerinin testinde yaygın olarak kullanılmaktadır5.
Araştırmacılar, DC'lerin rolünü daha fazla incelemek için acilen çok sayıda yüksek saflıkta DC'ye ihtiyaç duymaktadır. Bununla birlikte, DC'ler çeşitli dokularda ve kanda nadirdir ve insanlarda ve hayvanlarda kan hücrelerinin sadece% 1'ini oluşturur. Kemik iliği dendritik hücrelerinin in vitro kültürü (BMDC), büyük miktarlarda DC hücresi elde etmek için önemli bir yöntemdir. Bu arada, kemik iliğinden DC'ler üretmek için Lutz protokolü araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır6. Protokol DC hücrelerinin elde edilmesinde etkili olmasına rağmen, yüksek konsantrasyonlarda sitokinlerin eklenmesini ve kırmızı kan hücrelerinin lizisini içeren karmaşık ve pahalıdır.
Bu çalışmada, hemen hemen tüm kemik iliği hücrelerini fare kemik iliğinden (BM) izole etmek ve in vitro 7-9 günlük inkübasyondan sonra BMDC'ye farklılaşmayı indüklemek için daha düşük GM-CSF ve IL-4 konsantrasyonu ile bir yöntem sunulmuştur. Bu prosedür, neredeyse tüm kemik iliği hücrelerini hasat etmek ve bunları tam bir ortamda askıya almak için sadece 10 dakika sürer. Kısacası, bu araştırmada BMDC için verimli ve uygun maliyetli bir kültürleme yöntemi sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> PRMI-1640 Thermo <td>117327</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Fare IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (anti-fare CD16/32) Antikor</td><td>Biyoefsane</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

kemik İliği kaynaklı dendritik hücrelerin farelerden İzole edilmesi ve kültürlenmesi için ekonomik ve verimli protokol

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Dendritik hücrelere (DC'ler) olan talep, immünoloji araştırmaları ilerledikçe giderek artmaktadır. Bununla birlikte, DC'ler tüm dokularda nadirdir. DC'leri izole etmek için geleneksel yöntem öncelikle büyük dozlarda (>10 ng / mL) granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör / interlökin-4 (GM-CSF / IL-4) enjekte ederek kemik iliği (BM) farklılaşmasını DC'lere indüklemeyi içerir ve prosedürü karmaşık ve pahalı hale getirir. Bu protokolde, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ortamında kültürlenmiş tüm BM hücreleri kullanılarak, 3-4 yarı kültür değişiminden sonra, fare başına 2.7 x 107 CD11c + hücresi (DC) (iki femur) % 80 -% 95 saflıkta toplanmıştır. Kültürde 10 gün sonra, CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonu artarken, hücre sayısı azaldı. Hücre sayısı 7 günlük kültürden sonra zirveye ulaştı. Dahası, bu yöntemin tüm kemik iliği hücrelerini hasat etmesi sadece 10 dakika sürdü ve 1 haftalık kültürden sonra çok sayıda DC elde edildi.

1 x 10 7-1.7 x 107 hücreleri iki femurdan ekstrakte edildi ve 6 kuyucuklu bir plakaya ekilmeden önce 24 mL ortamda tekrar askıya alındı (Şekil 1A). 2 gün sonra, yapışkan olmayan hücreler kültür ortamını tamamen değiştirerek çıkarıldı. Ortamı değiştirmeden önce, önemli sayıda askıya alınmış hücre gözlendi (Şekil 1B). 3 günlük kültürden sonra küçük hücre kolonileri oluşmaya başladı. Altıncı günde, kolonilerin büyüklüğü ve sayısı önemli ölçüde...

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Fareden Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreleri İzole Etmenin ve Üretmenin Ekonomik ve Verimli Protokolü. Hayvan denekleri içeren prosedürler, Nanjing Tıp Üniversitesi Kurum Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır.One.Giriş. Tümör bağışıklık araştırmalarındaki artışla birlikte, DC hücrelerine olan talep giderek artmaktadır.Bununla birlikte, DC'ler tüm dokularda nadirdir. Esas olarak kemik iliğinin DC'lere farklılaşmasını indükleyen geleneksel yöntem karmaşık ve maliyetlidir. İki. Kemik iliğinin izolasyonu ve BM hücrelerinin hazırlanması Fareleri feda ediyoruz ve fare ameliyat masasına sabitliyoruz.Sol maruz kalan kasların ve femoral arterin derisini kesin. Femoral arteri doğrudan kesmeyin. Aksi takdirde, ağır kanamaya neden olur ve görüş alanını kirletir.Femur çevresindeki tüm kasları kesin. Femur başının prolapsusu gözlenene kadar farenin alt uzuvlarını yavaşça dışa doğru gerin. Alt ekstremiteleri vücuttan ayırın.Serbest ve eksiksiz bir femur elde etmek için arka bacağını kesin. Gazlı bez kullanarak kasları çıkarın. Kasları doğrudan yırtmayın.Farelerin femuru kırılgandır. Femuru iki ila beş dakika boyunca% 75 alkole yerleştirin. Üç. BMDC'nin enjeksiyon kültürü Artık alkolü PBS ile durulayın.Femurun orta ve alt kısmını hemostatik forseps ile kelepçeleyin ve femur alt ucunu başka bir hemostatik forseps ile kelepçeleyin. Hemostatik forseps tam anlamıyla femura uygulanır ve femur epifizyel hattan kopar. Kemik iliği boşluğunu epifizyal hattan delmek için bir ml şırınga kullanın.Tam orta iki parça kullanın, kemik beyazlaşana kadar kemik iliği boşluğunu yıkayın. Yıkama sıvılarını toplayın. GM CSF / IL-4 içeren tam ortamın 24ml ile desteklenmesi ve kuyucuk başına 4 ml'lik 6 delikli bir plakada tohumlanması. Dört.Sonuçlar.İki gün sonra, GM-CSF / IL-4 içeren tüm ortamları değiştirin. Yarısı dördüncü, altıncı ve sekizinci günde GM-CSF / IL-4 içeren komple ortamın yerini aldı. Hücre sayısı yedinci günde zirveye ulaştı ve daha sonra kademeli olarak azaldı.DC hücreleri, tipik bir olgun DC hücre morfolojisi gösteren çok sayıda sinaps oluşturdu. Akış alt metrik analizleri, CD11c oranının altıncı günde% 71'i empoze ettiğini, geniş oranın 10. günde% 96.1'e yükseldiğini göstermektedir. CD11c, CD80 ve MSC2'nin ekspresyonu, ekim süresinin artmasıyla birlikte giderek artmıştır. Beş.Sonuç.Kısacası, kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri farelerden izole etmek ve üretmek için ekonomik ve verimli bir protokol oluşturduk, bu da kemik iliği hücrelerini ayırmak için sadece 10 dakika sürüyor. Altı ila yedi günlük kültürden sonra ml başına 10ng, GM-CSF ve IL-4 ile çok sayıda yüksek saflıkta DC hasat edildi.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Bu videoda, yetişkin bir farenin kemik iliğinden dendritik hücrelerin (T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücreler) üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Öğrenin, fare kemik iliğinden yüksek saflıkta dendritik hücre izolasyonu için ekonomik ve verimli bir protokol. GM-CSF/IL-4 ile 7 günlük kültürde hücre bağışıklığı araştırmaları için yüksek verimli sonuçlar elde edin.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Daha fazla video keşfet