Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol
1 Temmuz 2022
Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.
Fareden Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreleri İzole Etmenin ve Üretmenin Ekonomik ve Verimli Protokolü. Hayvan denekleri içeren prosedürler, Nanjing Tıp Üniversitesi Kurum Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır.One.Giriş. Tümör bağışıklık araştırmalarındaki artışla birlikte, DC hücrelerine olan talep giderek artmaktadır.
Bununla birlikte, DC'ler tüm dokularda nadirdir. Esas olarak kemik iliğinin DC'lere farklılaşmasını indükleyen geleneksel yöntem karmaşık ve maliyetlidir. İki. Kemik iliğinin izolasyonu ve BM hücrelerinin hazırlanması Fareleri feda ediyoruz ve fare ameliyat masasına sabitliyoruz.
Sol maruz kalan kasların ve femoral arterin derisini kesin. Femoral arteri doğrudan kesmeyin. Aksi takdirde, ağır kanamaya neden olur ve görüş alanını kirletir.
Femur çevresindeki tüm kasları kesin. Femur başının prolapsusu gözlenene kadar farenin alt uzuvlarını yavaşça dışa doğru gerin. Alt ekstremiteleri vücuttan ayırın.
Serbest ve eksiksiz bir femur elde etmek için arka bacağını kesin. Gazlı bez kullanarak kasları çıkarın. Kasları doğrudan yırtmayın.
Farelerin femuru kırılgandır. Femuru iki ila beş dakika boyunca% 75 alkole yerleştirin. Üç. BMDC'nin enjeksiyon kültürü Artık alkolü PBS ile durulayın.
Femurun orta ve alt kısmını hemostatik forseps ile kelepçeleyin ve femur alt ucunu başka bir hemostatik forseps ile kelepçeleyin. Hemostatik forseps tam anlamıyla femura uygulanır ve femur epifizyel hattan kopar. Kemik iliği boşluğunu epifizyal hattan delmek için bir ml şırınga kullanın.
Tam orta iki parça kullanın, kemik beyazlaşana kadar kemik iliği boşluğunu yıkayın. Yıkama sıvılarını toplayın. GM CSF / IL-4 içeren tam ortamın 24ml ile desteklenmesi ve kuyucuk başına 4 ml'lik 6 delikli bir plakada tohumlanması. Dört.Sonuçlar.
İki gün sonra, GM-CSF / IL-4 içeren tüm ortamları değiştirin. Yarısı dördüncü, altıncı ve sekizinci günde GM-CSF / IL-4 içeren komple ortamın yerini aldı. Hücre sayısı yedinci günde zirveye ulaştı ve daha sonra kademeli olarak azaldı.
DC hücreleri, tipik bir olgun DC hücre morfolojisi gösteren çok sayıda sinaps oluşturdu. Akış alt metrik analizleri, CD11c oranının altıncı günde% 71'i empoze ettiğini, geniş oranın 10. günde% 96.1'e yükseldiğini göstermektedir. CD11c, CD80 ve MSC2'nin ekspresyonu, ekim süresinin artmasıyla birlikte giderek artmıştır. Beş.Sonuç.
Kısacası, kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri farelerden izole etmek ve üretmek için ekonomik ve verimli bir protokol oluşturduk, bu da kemik iliği hücrelerini ayırmak için sadece 10 dakika sürüyor. Altı ila yedi günlük kültürden sonra ml başına 10ng, GM-CSF ve IL-4 ile çok sayıda yüksek saflıkta DC hasat edildi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin izole edilmesi ve üretilmesi için ekonomik ve verimli bir yöntem sunmaktadır. Protokol, GM-CSF/IL-4 ile 7 günlük bir kültürü içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İmmünoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Dendritik hücreler (DC'ler), tümör immünitesi araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- DC'ler dokularda nadir bulunur, bu da izolasyonlarını zorlaştırır.
- DC farklılaşması için kullanılan geleneksel yöntemler karmaşık ve maliyetlidir.
- Bu çalışma, kemik iliğinden DC üretme sürecini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- DC'lerin izole edilmesi için maliyet etkin bir yöntem geliştirmek.
- Fare kemik iliğinden DC üretim verimliliğini artırmak.
- Yüksek saflıkta DC'ler sağlayarak tümör immünitesi araştırmalarını desteklemek.
Kullanılan Yöntemler
- Farelerden kemik iliğinin izolasyonu.
- Kemik iliği hücrelerinin GM-CSF/IL-4 ile kültürü.
- Hücre saflığının ve canlılığının değerlendirilmesi.
- Kurumsal Hayvan Etik Kurulu onayı.
Temel Sonuçlar
- Yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı DC'lerin başarılı izolasyonu.
- Yeni protokolün kanıtlanmış verimliliği.
- Tümör immünitesi araştırmalarında daha geniş uygulama potansiyeli.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla zaman ve maliyet azalması.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, DC üretimi için uygulanabilir bir alternatiftir.
- Bu yaklaşım, immünoloji alanındaki ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, çeşitli terapötik bağlamlardaki uygulamaları araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin izolasyonu için ekonomik ve yüksek verimli bir yöntem sunarak immünoloji ve tümör immünitesi araştırmalarındaki dendritik hücre tedarik darboğazını gidermektedir. Azaltılmış reaktif tüketimi ve uygulama süresi ile fenotipik olarak karakterize edilmiş DC'lerin ölçeklenebilir şekilde üretilmesine olanak tanıyarak, immünoterapi süreçlerindeki erken evre hedef doğrulama ve mekanistik çalışmaları destekler. Bu yaklaşım, immün modülasyonu değerlendirmek için tekrarlanabilir ve hastalıkla ilişkili bir sistem sağlayarak preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Antijen sunumu ve T-hücresi aktivasyon yollarında dendritik hücre fonksiyonlarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış GM-CSF/IL-4 diferansiyasyonu kullanarak DC üretiminin maliyetini ve karmaşıklığını azaltır.
- Bilimsel Değer: Zaman içindeki CD11c, CD80 ve MHC II ekspresyonunun fenotipik karakterizasyonu yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
Tarama & Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Standartlaştırılmış immün analizler için uygun, yüksek saflıkta dendritik hücre popülasyonları (%80-%95 CD11c+) üretir.
- Operasyonel Değer: Fare başına 2,7 x 107 hücreye kadar verim sağlayarak yüksek kapasiteli tarama formatlarına olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Bileşiklerin dendritik hücre olgunlaşması ve immün fonksiyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tutarlı bir biyolojik sistem sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Tümör immünitesi bağlamlarında dendritik hücre yanıtlarını modellemek için hastalıkla ilişkili bir sistem oluşturur.
- Operasyonel Değer: Belirlenmiş hücresel girdilerle immünomodülatör ajanların preklinik değerlendirmesini destekler.
- Bilimsel Değer: Ko-kültür sistemlerinde dendritik hücre fenotipini fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirerek mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, bağışıklık odaklı analizler için yenilenebilir bir dendritik hücre kaynağı sunar.
- Keşif Biyolojisi: Dendritik hücreye bağımlı immün yolaklar ve hedef etkileşimi üzerindeki hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İmmünomodülatör aktiviteyi değerlendirmek için tekrarlanabilir, kantitatif hücresel çıktılar sağlar.
- Analitikler: Olgunlaşma çıktıları olarak CD11c, CD80 ve MHC II'nin akış sitometrisi tabanlı ölçümüne olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: In vitro dendritik hücre üretimini, immün aktivasyon ve toleransın preklinik modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: İmmünoloji projeleri genelinde dendritik hücre üretimi için standartlaştırılmış, ölçeklenebilir bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fenotipik olarak tanımlanmış dendritik hücre girdileri aracılığıyla hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: 10 dakikalık kemik iliği hasadı ve düşük sitokin dozajı (10 ng/mL GM-CSF/IL-4) ile zaman ve maliyetten tasarruf sağlar.
- Stratejik Değer: İmmünoterapi taraması için güvenilir dendritik hücre modelleri sağlayarak devam/durdur (go/no-go) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Standartlaştırılmış immün efektör hücreler kullanarak immünomodülatör adayların risk ayarlı önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare kemik iliği izolasyonu ve aseptik hücre kültürü teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- 6 kuyucuklu plakalara, hemolitik penslere ve fenotipik doğrulama için akış sitometrisine erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar arasında sitokin konsantrasyonunun ve besiyeri değişim takviminin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer fare suşlarına veya genetik arka planlara uyarlanırken adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- 7–10 günlük kültür penceresi ve zirve sonrası hücre canlılığındaki ilgili düşüş ile sınırlıdır.
