Name: İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Keşfedin kan-beyin bariyeri modellemesi için üçlü hücre kültürü yöntemini. Endotelyal hücreler, perisitler ve astrositler kullanılarak nanopartikül taşınımı ve ilaç teslimatı mekanizmaları incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı tarafından, Marie Skłodowska-Curie Yenilikçi Eğitim Ağı (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi) olan NANOSTEM projesinin bir parçası olarak, 764958 No'lu hibe anlaşması kapsamında verilmektedir. Bu çalışma 'Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais' (Clémence Deligne Bursu), "Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l'Enfant et de l'adolescent" (SFCE), "l'étoile de Martin" Derneği ve Dernek"Cassandra contre la leucémie" tarafından verilmektedir.

Protokol, Fransız Yüksek Öğretim ve Araştırma Bakanlığı (referans: CODECOH DC2011-1321) ve yerel araştırma inceleme kurulu (Béthune Doğum Hastanesi, Beuvry, Fransa) tarafından onaylanmıştır. Endotel hücrelerinin (ECs) elde edilmesi için, Fransız Mevzuatına uygun olarak, göbek kordon kanı toplamak için donörün ebeveynlerinden yazılı ve bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Perisitler, Referans19'a göre izole edilen Profesör Takashi Kanda (Yamaguchi Üniversitesi Tıp Enstitüsü, Ube, Japonya) tarafından Nöroloji ve Klinik Sinirbilim Bölümü) tarafından sağlanmaktadır. Birincil insan beyni korteks astrositleri ticari bir sağlayıcıdan satın alınır (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Hücre kültürü
<ol><li>Endotel hücrelerinin kültürlenmesi NOT: Endotel hücreleri (ECs), Pedroso ve ark.20 tarafından açıklanan yönteme göre, insan göbek kordon kanından izole edilen CD34 + hematopoetik kök hücrelerden türetilmiştir. ECS'nin endotel fenotipi Pedroso ve ark.20'de tanımlanmıştır.
	<ol><li>İnsan EC'lerini, fetal buzağı serumunun% 5'i (FCS),% 0.5'i gentamisin ve% 1'i endotel hücresi büyüme takviyesi (ECM) ile desteklenmiş endotel hücre ortamı kullanarak geliştirin (bkz.</li>
		<li>Alt kültürleme EC'leri için, modelin ayarlanmasından iki gün önce, bir tabağı 37 ° C'de 15 dakika boyunca 10 mL% 2 jelatin ile kaplayın ve ardından 20 mL sıcak ECM ile değiştirin. Önceden kaplanmış hücre kültürü kabında 1 milyon hücre içeren bir şişe EC'yi (hücreler, hücre donmadan önce adım 2.3.3'te açıklandığı gibi manuel olarak sayılmıştır) çözün.</li>
		<li>37 ° C'de 3 saat sonra, ortamı yenileyin ve trikültürün nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 ° C'de bir inkübatörün içinde ayarlanana kadar hücreleri koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Perisitlerin kültürlenmesi NOT: Perisitler, Shimizu ve ark.19 tarafından yayınlanan protokole göre insan beyninden izole edilir, izolasyon prosedürü Kanda ve ark.21 tarafından modifikasyonlarla yayınlanan yöntemi izler.<ol><li>Dulbecco'nun 4.5 g / L glikoz (DMEM HG), FCS'nin% 10'u,% 1 de penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile desteklenmiş modifiye Eagle ortamını kullanarak perisitleri yetiştirin (bkz.</li>
		<li>Perisit alt kültürlemesi için, modelin ayarlanmasından beş gün önce, oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca 0.02 N asetik asit içinde 8 mL / çanak 100 μg / mL kollajen tip I çözeltisi ile iki kabı kaplayın ve ardından RT DMEM HG ile iki kez yıkayın. 10 mL ılık ortam içeren konik bir tüp içinde 1 milyon hücre içeren bir şişe perisiti çözün ve süspansiyonu 20 ° C'de 190 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.</li>
		<li>Peleti 10 mL ılık ortamda ve tohumu 15 mL ılık ortam / tabak ile önceden doldurulmuş önceden kaplanmış hücre kültürü kaplarında yeniden askıya alın. Ortam 3 gün sonra yenilenir ve hücreler, trikültürün nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 ° C'de ayarlanmasına kadarkorunur.</li>
	</ol></li>
	<li>Astrositlerin kültürlenmesi<ol><li>Astrositleri, FCS'nin% 20'si, astrosit büyüme takviyesinin% 1'i ve% 1'i penisilin / streptomisin çözeltisi () ile desteklenmiş bir astrosit ortamı kullanarak yetiştirin (bkz.</li>
		<li>Astrositlerin alt kültürlenmesi için, modelin ayarlanmasından bir hafta önce, bir T75 hücre kültürü şişesini 37 ° C'de 1 saat boyunca 10 mL 2 μg /cm2 poli-L-lizin (PLL) ile kaplayın ve RT steril suyla iki kez yıkayın. 20 mL ılık ortamda 1 milyon hücre içeren bir şişe astrositi ve önceden kaplanmış T75 hücre kültürü şişesinde tohumu çözün. NOT: Ticari olarak elde edilen hücre şişeleri ~ 1 milyon hücrenin varlığını doğrulamaktadır, bu nedenle hücrelerin sayımı burada yapılmamıştır.</li>
		<li>Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO 2 ve%21 O2 altında tutun. Ortam 24 saat sonra ve daha sonra trikültürün ayarlanmasına kadar her 2 günde bir yenilenir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Üçlü kültür modeli ayarı
NOT: Üç hücre tipinin montajı aynı gün içinde gerçekleştirilir. Trikültürün ayarlanmasından bir gün önce, geri döndürülmüş kesici uç filtreler üzerinde kollajen tip I kaplamayı gerçekleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve astrositleri 12 kuyucuklu bir plakanın PLL ön kaplamalı kuyucuklarına tohumlayın.
<ol><li>Astrositlerin kuyulara ekilmesi<ol><li>Kuyucukları, adım 1.3.2'de açıklandığı gibi 500 μL 2 μg/cm2 PLL çözeltisi ile kaplayın.</li>
		<li>Hücreleri 10 mL ılık fosfat tampon salin - kalsiyum ve magnezyum içermeyen 1X (1X PBS-CMF) (tablo 1) ile bir kez yıkayın, ardından 10 mL sıcak% 20 tripsin / EDTA (T / E) çözeltisi ile 37 ° C'de 3 dakika kuluçkaya yatırın ve hücreleri şişeden mekanik olarak ayırın. Süspansiyonu, 5 mL sıcak seyreltilmemiş FCS içeren konik bir tüpe aktarın. NOT: Sağlayıcının protokol22'sine göre, astrositlerin toplanması, şişeyi inkübatöre 1 dakika boyunca yerleştirerek ve ayrılmanın tamamlanmasına yardımcı olmak için şişeye dokunarak optimize edilebilir. Kalan hücreler 5 mL T/E nötralizasyon çözeltisi ile toplanmalı ve FCS içeren konik tüpe yerleştirilmelidir.</li>
		<li>Süspansiyonu 190 x g'de 20 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
		<li>Hücre peletini 5 mL ılık'de yeniden askıya alın. Mikroskop altında manuel bir sayma odası kullanarak hücre süspansiyonunun 20 μL'sini 80 μL 1X PBS-CMF'de seyrelterek hücreleri sayın (bkz. Her PLL'de yaklaşık 40.000 hücre /cm2 plaka, 1.5 mL sıcak hacminde önceden kaplanmış kuyuda.</li>
	</ol></li>
	<li>Geri döndürülen kesici uç filtrelerde perisitlerin tohumlanması<ol><li>Geri döndürülmüş kesici uç filtrelerine, steril cımbız kullanılarak 25 mm yüksekliğinde kapalı bir kabın çevresine yerleştirilmiş 250 μL kollajen tip I çözeltisi (100 μg/mL) ekleyin. Steril koşullar altında kaplamayı RT'de 1 saat bekletin. NOT: Kullanılan çanağın, davlumbazın dışındayken sterilitenin korunmasını sağlamak ve geri döndürülen filtredeki çözeltiler ile kabın kapağı arasındaki teması önlemek için yeterince yüksek olması gerekir.</li>
		<li>Kollajen tip I solüsyonunu, aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipetle dikkatlice çıkarın. 250 μL RT DMEM HG ile iki kez yıkayın ve ardından tüm çözeltiyi kesici uç filtrelerinden dikkatlice çıkarın. Kaplanmış kesici uç filtreleri, hücrelerin tohumlanmasına kadar steril koşullar altında RT'de bırakın. NOT: Kaplama prosedürü sırasında, membran hasarını önlemek için filtreye dokunmamaya dikkat edin. Kollajen tip I ile kaplandıktan sonra, kesici uç filtreleri RT'de gece boyunca saklanabilir.</li>
		<li>Trikültür ayarının yapıldığı gün, perisitleri 10 mL ılık 1X PBS-CMF ile iki kez yıkayın ve hücreleri 2 mL ılık tripsin ile inkübe edin. Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyerek tripsinin etkisini izleyin. Hücreler ayrılmaya başladığında, tripsini çıkarın ve mekanik ayrışmadan önce 5 mL sıcak ECM ekleyin.</li>
		<li>Mikroskop altında manuel bir sayım odası kullanarak hücre süspansiyonunun 20 μL'sini 80 μL 1X PBS-CMF'de seyrelterek hücreleri sayın ve önceden kaplanmış geri döndürülmüş kesici uç filtrelere250 μL'lik bir hacimde 44.500 hücre/cm2 tohumlayın.</li>
		<li>1,5 mL sıcak ECM/kuyucuk içeren 12 delikli bir plakada steril cımbız kullanarak kesici uç filtrelerini dikkatlice geri döndürün. Kesici uç filtreleri artık diğer taraftan kaplanmaya hazırdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Endotel hücrelerinin kesici uç filtreler üzerine tohumlanması<ol><li>Kesici uç filtrelerinin üst tarafını 500 μL hücre dışı matris bazlı hidrojel (1/48 v/v) ile kaplayın (bkz. 1 saat sonra, nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 °C'de, 500 μL RT DMEM HG ile bir kez yıkayın.</li>
		<li>10 mL ılık 1X PBS-CMF ile bir kez yıkayın ve hücreleri 2 mL ılık tripsin ile inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladığında, tripsini çıkarın ve mekanik ayrışmadan önce 5 mL sıcak ECM ekleyin.</li>
		<li>Mikroskop altında manuel bir sayım odası kullanarak hücre süspansiyonunun 20 μL'sini 80 μL 1X PBS-CMF'de seyrelterek hücreleri sayın ve ECs'yi 500 μL sıcak ECM hacminde önceden kaplanmış kesici uç filtreler üzerinde 71.500 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlayın.</li>
		<li>'yi 1,5 mL sıcak ECM/kuyucuk ile değiştirin ve ardından tohumlanmış kesici uç filtrelerini (ECs + perisitler) astrositleri içeren kuyucuklara aktarın.</li>
		<li>Trikültür hücre sistemlerini nemlendirilmiş bir inkübatöre 37 °C'de% 5 CO 2 ve%21 O2 altında yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>BBB özelliklerinin indüksiyonu için üçlü hücre kültürünün korunması NOT: ECs'deki BBB özelliklerinin indüksiyonu için 6 günlük üçlü kültür gereklidir.<ol><li>Ortamı 6. güne kadar her gün yenileyin, bir aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipet kullanarak ortamı üst ve alt bölmeden dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Üst bölmede 500 μL ve alt bölmede 1,5 mL'lik bir hacimde sıcak ECM ile hızlı bir şekilde değiştirin ve hücreleri% 5 CO 2 ve%21 O2 altında 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre gerikoyun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. BBB fenotip doğrulaması
NOT: 6 günlük üçlü kültürden sonra, ECs'de BBB fenotipini indüklemek için gereken süre, insan BBB modeli deneyler için hazırdır. Beyin benzeri endotel hücrelerinin (BLEC'ler) fiziksel bütünlüğü, BBB bütünlük belirteçlerine geçirgenlik testi kullanılarak değerlendirilen TJ proteinlerinin immünofloresan boyaması ile görselleştirilir. BBB fenotip doğrulaması, Deligne ve ark.,23'te açıklanan prosedüre göre genler / proteinler ekspresyon analizi ve efflux pompaları işlevselliğini de içerir. Perisitler ve astrositler, Deligne ve ark.'da açıklanan prosedüre göre ilgili boyama belirteçleri tarafından görselleştirilir. 202023.
<ol><li>İmmünofloresan boyama<ol><li>Kesici uç filtrelerini ve astrositleri buz gibi soğuk metanol/aseton (50/50 v/v) içinde 1 dakika sabitleyin ve RT 1X PBS-CMF ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>Membranı bir neşter kullanarak keserek filtreyi kesici uçtan dikkatlice ayırın. Deligne ve ark.23'e göre membran ve alt kuyucuklar üzerinde immünositokimya yapın. NOT: Engelleme adımı için, RT'de 30 dakika boyunca 250 μL SEA BLOCK Engelleme tamponu kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	</ol></li>
	<li>BBB bütünlük testi<ol><li>BLEC'lerin fiziksel bütünlüğünü, Sodyum floresein (NaF) ve 20 kDa Dextran (FD20) gibi farklı moleküler ağırlıklara sahip BBB bütünlük belirteçlerini kullanarak bir geçirgenlik testi ile değerlendirin (bkz. NOT: Deney, Deligne ve ark.23'te açıklanan prosedüre göre gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Efflux pompa işlevselliği<ol><li>Bir P-gp ve BCRP inhibitörü olan Elacridar ile ve Elacridar olmadan Rhodamine 123'ün (R123) hücre içi birikimini ölçerek P-glikoprotein (P-gp) ve meme kanseri direnç proteininin (BCRP) işlevselliğini değerlendirin (bkz. NOT: Deney, Deligne ve ark.23'te açıklanan prosedüre göre gerçekleştirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Gen ve protein ifadeleri<ol><li>Hücrelerin soğuk Ringer HEPES (RH) (Tablo 1) ile hızlı bir yıkamadan sonra buz üzerinde gen ve protein örneği toplama işlemini gerçekleştirin. EC numune toplamadan önce, ters çevrilmiş kesici uç filtreleri20'den perisitleri kazıyın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Nanojel taşıma
NOT: Polimerik nanojellerin (NG'ler) luminalden trikültür BLEC modelinin abluminal bölmesine geçişini tahmin etmek için, 6. günde 24 saat boyunca luminal bölmeye 0.1 mg / mL NG çözeltisi eklenmiştir. İncelenen NG'ler, ortalama 8-10 nm büyüklüğünde floresan olarak etiketlenmiş N-İzopropilakrilamit (NIPAM ) bazlı hidrojellerdi (bkz.
<ol><li>Nanojel tozunu tartın ve ECM'de 1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda çözündürün. Çözümü 10 dakika boyunca sonikleştirin ve 0.2 μm PTFE filtresi kullanarak filtreleyin. NOT: Deney günü yeni bir NG çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Luminal bölmedeki ortamı değiştirin ve 0.1 mg / mL'lik son konsantrasyon için üst bölmeye 50 μL NG çözeltisi ekleyin. NOT: Orijinal çözeltiden 1:10'luk bir seyreltme gerçekleştirin.</li>
	<li>24 saatlik inkübasyondan sonra, luminal (20 μL) ve abluminal (200 μL) bölmelerden alikotları toplayın ve bunları siyah bir 96 delikli plakaya yerleştirin.</li>
	<li>477/540 nm'de uyarma/emisyon dalga boylarının ayarlanmasını kullanarak floresanı bir floresan çok plakalı okuyucu (bkz. Malzeme Tablosu) ile siyah 96 delikli bir plaka kullanarak ölçün. Zamanında eklenen ilk çalışma çözümüne atıfta bulunulan geçiş yüzdesini hesaplayın = 0 h (t0)6,15. NOT: 96 delikli plakayı floresan ölçümüne hazırlamak için, abluminal bölmeden 200 μL çözelti ve luminal bölmeden ve t0 preparasyonundan 20 μL çözelti ekleyin (200 μL'lik son hacme ulaşmak için 180 μL ECM ekleyin). Ayrıca bir kalibrasyon eğrisi ve okuma plakasına bir boşluk ekleyin. Enstrümantal parametreler: Algılama yöntemi - Floresan, Optik Konum - Üst, Okuma Tipi - Son nokta, Uyarma dalga boyu - 477 nm, Emisyon dalga boyu - 540 nm, Hassasiyet - 100, Sarsıntı - 5 s için Çift Orbital.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37, 13-25 (2010).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> The Journal of Experimental Medicine. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inherited+Metabolic+Disease%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (3), 437-449 (2013).</li>
<li>Kreuter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+central+nervous+system+by+polymeric+nanoparticles%3A+What+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 71, 2-14 (2014).</li>
<li>Zhang, W., Mehta, A., Tong, Z., Esser, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+W+%22L.Advanced+science%22">L.Advanced science</a>. 8 (10), Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany. 2003937(2021).</li>
<li>Vashist, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogels+as+potential+drug+nanocarriers+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Nanogels as potential drug nanocarriers for CNS drug delivery.</a> Drug Discovery Today. 23 (7), 1436-1443 (2018).</li>
<li>Lombardo, S. M., Schneider, M., Türeli, A. E., Günday Türeli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+for+crossing+the+BBB+with+nanoparticles%3A+The+rational+design%5BTitle%5D)+AND+%22Beilstein+Journal+of+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Key for crossing the BBB with nanoparticles: The rational design.</a> Beilstein Journal of Nanotechnology. 11, 866-883 (2020).</li>
<li>Bernardo-Castro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+nanoparticles+for+the+different+phases+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Therapeutic nanoparticles for the different phases of ischemic stroke.</a> Life. 11 (6), Basel, Switzerland. 482(2021).</li>
<li>Salinas, Y., Castilla, A. M., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+L-proline+based+thermoresponsive+and+pH-switchable+nanogel+as+a+drug+delivery+vehicle%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An L-proline based thermoresponsive and pH-switchable nanogel as a drug delivery vehicle.</a> Polymer Chemistry. 9 (17), 2271-2280 (2018).</li>
<li>Liu, P., Pearce, C. M., Anastasiadi, R. M., Resmini, M., Castilla, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+crosslinked+nanogels%3A+An+NMR+study+of+the+effect+of+monomer+reactivity+on+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Covalently crosslinked nanogels: An NMR study of the effect of monomer reactivity on composition and structure.</a> Polymers. 11 (2), 353(2019).</li>
<li>Preman, N. K., Jain, S., Johnson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%E2%80%9DSmart%E2%80%9D+polymer+nanogels+as+pharmaceutical+carriers%3A+A+versatile+platform+for+programmed+delivery+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">”Smart” polymer nanogels as pharmaceutical carriers: A versatile platform for programmed delivery and diagnostics.</a> ACS Omega. 6 (8), 5075-5090 (2021).</li>
<li>Cuggino, J. C., Blanco, E. R. O., Gugliotta, L. M., Alvarez Igarzabal, C. I., Calderón, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossing+biological+barriers+with+nanogels+to+improve+drug+delivery+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Crossing biological barriers with nanogels to improve drug delivery performance.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. 307, 221-246 (2019).</li>
<li>Basso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-based+drug+delivery+nanosystems+for+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-based drug delivery nanosystems for the treatment of brain tumors.</a> Gels. 4 (3), Basel, Switzerland. 62(2018).</li>
<li>Harilal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+blood-brain+barrier%3A+A+hard+nut+to+crack+in+the+transportation+of+drug+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Revisiting the blood-brain barrier: A hard nut to crack in the transportation of drug molecules.</a> Brain Research Bulletin. 160, 121-140 (2020).</li>
<li>Papadimitriou, S. A., Robin, M. P., Ceric, D., O'Reilly, R. K., Marino, S., Resmini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+polymeric+nanovehicles+for+neural+stem+cell+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Fluorescent polymeric nanovehicles for neural stem cell modulation.</a> Nanoscale. 8 (39), 17340-17349 (2016).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+blood-brain+barrier+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).</li>
<li>Reichel, A., Begley, D. J., Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+in+vitro+techniques+for+blood-brain+barrier+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An overview of in vitro techniques for blood-brain barrier studies.</a> Methods in Molecular Medicine. 89, 307-324 (2003).</li>
<li>Shimizu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+pericytes+modify+the+blood-nerve+barrier+function+and+tight+junctional+molecules+through+the+secretion+of+various+soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve pericytes modify the blood-nerve barrier function and tight junctional molecules through the secretion of various soluble factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 226 (1), 255-266 (2011).</li>
<li>Pedroso, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival%2C+vascular+differentiation+and+wound+healing+potential+of+stem+cells+co-cultured+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells.</a> PLoS One. 6 (1), 16114(2011).</li>
<li>Kanda, T., Iwasaki, T., Yamawaki, M., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+bovine+endothelial+cells+of+endoneurial+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of bovine endothelial cells of endoneurial origin.</a> Journal of Neuroscience Research. 49 (6), 769-777 (1997).</li>
<li>Data sheet on human astrocytes culture. Technical resources from ScienCell. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources">https://www.sciencellonline.com/human-astrocytes.html#product_tabs_technicalresources</a> (2021).</li>
<li>Deligne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+in+vitro+blood-brain+tumor+barrier+model+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+to+better+understand+the+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Development of a human in vitro blood-brain tumor barrier model of diffuse intrinsic pontine glioma to better understand the chemoresistance.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 37(2020).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), 99733(2014).</li>
<li>Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier%3A+From+physiology+to+disease+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier: From physiology to disease and back.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+studies+on+in+vitro+blood-brain+barrier+models%3A+Physiology%2C+pathology%2C+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).</li>
<li>Heymans, M., Figueiredo, R., Dehouck, L., Francisco, D., Sano, Y., Shimizu, F., Kanda, T., Bruggmann, R., Engelhardt, B., Winter, P., Gosselet, F., Maxime, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+brain+pericytes+in+blood-brain+barrier+formation+and+maintenance%3A+A+transcriptomic+study+of+co-cultured+human+endothelial+cells+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Contribution of brain pericytes in blood-brain barrier formation and maintenance: A transcriptomic study of co-cultured human endothelial cells derived from hematopoietic stem cells.</a> Fluids Barriers CNS. 17, 48(2020).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , (1959).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Models+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Models of the Blood-Brain Barrier.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 265, 75-110 (2021).</li>
<li>Hoheisel, D., Nitz, T., Franke, H., Wegener, J., Hakvoort, A., Tilling, T., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+reinforces+the+blood-brain+properties+in+a+serum+free+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247 (2), 312-315 (1998).</li>
<li>Drolez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+relevant+in+vitro+blood-brain+barrier+model+to+investigate+pro-metastatic+features+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Selection of a relevant in vitro blood-brain barrier model to investigate pro-metastatic features of human breast cancer cell lines.</a> PloS One. 11 (3), 0151155(2016).</li>
<li>Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Förster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+astrocytes+in+an+in+vitro+stroke+model+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352(2014).</li>
<li>Mysiorek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-%CE%B1+activation+protects+brain+capillary+endothelial+cells+from+oxygen-glucose+deprivation-induced+hyperpermeability+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-α activation protects brain capillary endothelial cells from oxygen-glucose deprivation-induced hyperpermeability in the blood-brain barrier.</a> Current Neurovascular Research. 6 (3), 181-193 (2009).</li>
<li>Culot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+protection+as+a+possible+mechanism+for+the+protective+effects+of+NXY-059+in+preclinical+models%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular protection as a possible mechanism for the protective effects of NXY-059 in preclinical models: An in vitro study.</a> Brain Research. 1294, 144-152 (2009).</li>
<li>Vandenhaute, E., Drolez, A., Sevin, E., Gosselet, F., Mysiorek, C., Dehouck, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+co-culture+in+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier+for+use+in+cancer+research%3A+Maintaining+an+appropriate+endothelial+monolayer+for+the+assessment+of+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adapting co-culture in vitro models of the blood-brain barrier for use in cancer research: Maintaining an appropriate endothelial monolayer for the assessment of transendothelial migration.</a> Laboratory Investigation. 96 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+shear+stress+in+Blood-Brain+Barrier+endothelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology.</a> BMC Neuroscience. 12, 40(2011).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Beyin hastalıklarının tedavisi, ilaçların beyin parankimindeki hücresel ve moleküler hedeflerine ulaşmak için BBB'yi engelleme zorluğu göz önüne alındığında bir zorluk olmaya devam etmektedir.
Beyin hastalıkları için ilaç geliştirme şu anda düşük bir başarı oranı sergilemektedir, çünkü klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar veren ilaçların çoğu klinikte kullanıldığında herhangi bir fayda göstermemektedir. Deney için kullanılan hayvan sayısını azaltmayı amaçlayan "3R kuralını" takiben, beyin patolojilerini incelemek ve ilaçların beyin penetrasyonunu tahmin etmek için BBB'nin in vitro modelleri geliştirilmiştir29. BBB'nin in vitro modelleri esas olarak hayvan hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir ve elde edilen sonuçların alaka düzeyini artırmak için daha sofistike hale gelmiştir16. İnsan hücrelerinin kullanımındaki önemli gelişmelerden biri, insan hastalık mekanizmalarını incelemek için hücresel ve moleküler düzeylerde inkar edilemez yeni bir anlayış ve daha fazla özgüllük getiriyor16. Bununla birlikte, ilgili modellerin geliştirilmesi, BBB in vitro model ayarlarının iyileştirilmesini ve hayvan modelleri sayesinde ortaya çıkan bilginin dikkate alınmasını gerektirir. Bu nedenle, BBB mimarisinin karmaşıklığını ve BBB'yi fizyolojik ve patolojik koşullar altında incelemek için hücre-hücre iletişiminin önemini göz önünde bulundurması gerekir30.
Burada sunulan protokol, beyin dokusuna erişim sınırlaması olmaksızın, BBB'nin üç ana hücre tipini içeren tam bir insan BBB in vitro modeli kurmak için bir yöntem tanımlamaktadır. Çoklu hücre sistemi olarak, sıkma bileşiklerinin yapay kullanımı olmadan, ancak bunun yerine hücre-hücre iletişimi tarafından indüklenen BBB özelliklerinin indüksiyonu ve korunması, fizyolojik olarak daha alakalı ve BBB özelliklerinin in vivo indüksiyonu ile uyumludur31. Bu nedenle, protokolün kronolojisine saygı gösterilmesi, protokolün başarısı için çok önemlidir. Ayrıca, üçlü kültürün ayarlanması sırasında ve üç hücre tipi bir araya getirildikten sonra kuluçka süreleri, protokolün ana kritik adımlarını temsil eder.
EC'lerdeki BBB özellikleri, ortak kültür modeli24 için açıklandığı gibi, perisitlerle ortak kültür tarafından indüklenir. Bu nedenle, kesici uç filtresinin arka tarafındaki perisitlerin kültürü en kritik noktadır ve BBB özelliklerinin indüksiyonu için yeterli perisitlere sahip olmama riski altında protokolün sıkı bir şekilde takip edilmesini gerektirir. Her şeyden önce, kaplama prosedürü ve ayrıca hücre tohumlaması sırasında, filtrenin iyi bir şekilde kaplanmasını sağlamak ve hücreleri kaybetmemek için Petri kabının kapağının kaplama ile temas etmemesine ve ayrıca hücreler tohumlandıktan sonra ortama dikkat edilmelidir (adım 2.2.1 ve 2.2.4). Ayrıca, perisitler tohumlandıktan sonra, diğer taraftaki EC'lerin kaplanması ve tohumlanması için kesici uç filtresini geri döndürmeden önce perisitlerin bağlanması için belirtilen süreyi beklemek önemlidir (adım 2.2.4) (adım 2.2.5 ve 2.3). Tohumlandıktan sonra, hücre-hücre iletişimi yoluyla BBB özelliklerini indüklemek için altı gün gerekir (adım 2.4).
Model, sınırlı geçirgenlik açısından doğrulanmıştır (sıkı bağlantıların ayarlanmasıyla ilişkili), çünkü üçlü kültür modelinin EC'leri, doğrulanmış ortak kültür modeline benzer BBB bütünlük belirteçlerine geçirgenlik değerleri gösterir ve ayrıca doğrulanmış hayvan veya insan modellerinde ölçülür 16,27,32. Ayrıca, bir in vitro BBB modelinin doğrulanması, sınırlı geçirgenliğe ek olarak, NVU'nun diğer hücre tiplerine yanıt vermeyi ve fonksiyonel reseptörlerin ve taşıyıcıların ekspresyonunu gerektirir16. Ek olarak, model tekrarlanabilir ve bir hücre sıralama yöntemi gerektirmeden her hücre tipi üzerinde ayrı ayrı çok sayıda analiz (gen ve protein ekspresyonu, floresan boyama, toksisite testleri) gerçekleştirmek için birden fazla kesici uç filtresi ve kuyucuk üretir.
Model, kesici uç filtresinin her iki tarafında bir hücre tipine sahip olmak için 0,4 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanılarak geliştirilmiştir. Kesici uç filtre sistemi, hücre-hücre iletişiminin fizyolojik koşullarda, iyi içeren astrositler üzerine aktarılarak incelenmesine izin verdi. Sistemdeki astrositlerin varlığı, in vitro model 24'teki ilk ortak kültüre kıyasla artı bir değeri temsil eder. Gerçekten de, astrositlerin BBB fizyolojisindeki önemi göz önüne alındığında, bu üçüncü hücre tipi, BBB içindeki hücre-hücre iletişiminin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Ayrıca, üçlü hücre kültürü sistemi, astrositlerin önemli bir rol oynadığı inme gibi patolojik durumlarda da incelenebilir33,34,35. Ek olarak, kesici uç filtresinin her iki tarafındaki BLEC'lerin / perisitlerin tasarımı, beyin kanseri23 gibi patolojik durumları taklit etmek için diğer hücre tiplerine kolayca yerleştirilebilir.
Kesici uç filtresinin gözenek boyutu, BBB genelinde hücre geçişi gibi bazı deneylerle sınırlamalar getirebilir. Bununla birlikte, modelin daha büyük bir gözenek boyutuna sahip gelişimi, BBB36'yı taklit etmek için fizyolojik olarak ilgili olmayan çoklu katmanların değil, fizyolojik bir tek katmanlı ECs oluşumunun sağlanmasını sağlamak için protokolün uyarlanmasını gerektirir.
Modelin uygulanabilirliği, çok hücreli bir sistem kullanarak taşıma deneyi yapma olasılığını sergileyen NG'lerin taşıma deneyi kullanılarak gösterilmiştir. Bununla birlikte, taşıma deneyi için bir kontrol bileşiğine veya molekülüne sahip olmanın zorluklarının farkında olunmalı, her nanoyapı benzersiz bir özellik kümesi (moleküler ağırlık, yük, şekil, fiziksel özellikler, protein korona oluşumu) sergilediğinden, NG'lerle karşılaştırılabilir özellikleri paylaşmalıdır.
Modelin bir sınırlaması, EC'lerin farklılaşmasını ve TJ proteinlerinin ekspresyonunu etkilediği gösterilen kesme gerilmesinin olmamasıdır37. Bununla birlikte, beyin kılcal damarını taklit eden akışkan bir sistem geliştirmek, çoklu hücre sistemine belirli bir cihaz gerektiren akışkan bir parça eklemenin karmaşıklığı göz önüne alındığında zordur. Dahası, belirli bir cihaz genellikle ticari olarak temin edilemez ve birçok kopyaya izin vermez, böylece akışkan sistemleri yüksek verimli kullanım için daha az uyarlanmış hale getirir.
Özetle, insan hücrelerinden oluşan bu üçlü kültür sistemi, BBB'nin mimarisini in vitro olarak yeniden üretir. Bileşiklerin kapsamlı bir şekilde taranması için kullanılabilecek birçok kesici ucun üretilmesini sağlar.

Beyin kılcal endotel hücreleri (ECs) düzeyinde lokalize olan BBB, beyin homeostazını ve sinir hücrelerinin işlevini korumak için çok önemli olan beyin parankimine erişimi kontrol eder ve düzenler 1,2. Bununla birlikte, beyin patolojisi durumunda, beyin parankimine erişim eksikliği, terapötik stratejilerin geliştirilmesinde gerçek bir engel teşkil etmektedir.
BBB ECs, hücreler arası alanı kapatan, hücreler arası yolu 1,2,3 kontrol eden bir efflux pompaları, spesifik taşıyıcılar ve reseptörler sistemi ile ilişkili sıkı bağlantı (TJ) proteinleri de dahil olmak üzere karmaşık bir dizi özelliğe sahiptir. Dahası, tüm bu özellikler, BBB EC bazal membranına gömülü perisitler ve uç ayakları beyin kılcal damarlarını çevreleyen astrositlerle iletişim sayesinde indüklenir ve korunur 1,2,3. Bu nedenle, BBB'nin in vitro olarak incelenmesi, mimarisinin karmaşıklığı ve nörovasküler birimi (NVU) oluşturan farklı hücre tipleri arasındaki iletişim göz önüne alındığında bir zorluktur2. Dahası, farklı hücre tipleri BBB özelliklerinin indüksiyonu ve bakımı için çok önemlidir ve sonuç olarak BBB'den geçişin tahminini etkiler. Beyne ilaç dağıtımı için farklı stratejiler, BBB kısıtlı özelliklerini atlamak için büyük bir taktik paneli kullanılarak test edildi4. Daha yakın zamanlarda, nanoteknolojilerin ilerlemesiyle birlikte, ilaç taşıyıcıları 5,6 gibi uygulamalar için yeni malzemeler geliştirilmektedir. Daha yüksek yüklerine, azaltılmış toksisitelerine ve artan ilaçların biyoyararlanımına ek olarak, bu yeni nanomalzemeler, BBB'yi geçmek ve özellikle parankimdeki hücreleri hedeflemek için bir Truva atı stratejisi için işlevselleştirilebilir 5,6. Değerlendirilen farklı nanomalzeme türleri arasında, nanojeller, esas olarak kolloidal özellikleri ve kimyasal yapıyı uyaranlara duyarlı özellikleri 7,8,9,10,11,12,13,14,15 tanıtmak için uyarlama yetenekleri nedeniyle oldukça dikkat çekmiştir.
İn vitro modeller, ilaçların beyin penetrasyonunu tahmin etmek için insan hücrelerini kullanan preklinik çalışmalar için geliştirilmiştir16. Bu modellerin farklı ayarları mevcuttur, beyin EC'lerinin tek katmanlarından çoklu hücre sistemlerine kadar16. NVU hücrelerinin BBB indüksiyonu ve bakımındaki önemi ve patolojik ortama koordineli yanıt göz önüne alındığında, BBB in vitro modellerinin,tahminin alaka düzeyini artırmak için tüm bu kahramanları göz önünde bulundurması gerekir 2,17.
Mevcut yöntem, belirli hücresel ve insan moleküler mekanizmalarını incelemek için insan hücreleriyle tamamen geliştirilen insan BBB'sinin üçlü bir kültür in vitro modelinin kurulmasını açıklamaktadır. Fizyolojik olarak alakalı olmak için, model, BBB özelliklerini indüklemek ve sürdürmek için gerekli olan BBB'nin ana üç hücresel aktöründen (ECs, perisitler ve astrositler), sıkılaştırıcı bileşikler kullanılmadan ve in vitro BBB model16,18 olarak kabul edilmesi gereken bir dizi özellik göstermeden oluşur. Model, beyin penetrasyonunu tahmin etmek için ilaç ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi çalışmaları için uygun, kan ve beyin bölmesini sınırlayan bir konfigürasyonda kurulmuştur. Modelin kullanışlılığı, polimerik nanojellerin taşınmasını ölçerek gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hücre Kültürü</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Astosit Ortamı ()</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrosit Büyüme Takviyesi</td><td>ScienCell&nbsp;</td>setinde <td>1852</td><td>Astrosit Büyüme Takviyesi sağlanır.</td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı 100 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430293</td><td>100 mm x 20 mm; trikültür ayarından önce EC'lerin ve PC'lerin çözülmesi için kullanılan çanak</td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı 150 mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430599</td><td>Bu tabakların yüksekliği (25 mm), trikültür modelinin ayarlanması için geri döndürülmüş ekte PC'lerin tohumlanmasına izin verir.</td></tr><tr><td>Kollajen I&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Sıçan kuyruğu&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1051</td><td>Endotel Hücre Büyüme Takviyesi, ECM setinde sağlanır.</td></tr><tr><td>Endotel Hücre Ortamı (ECM)</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Baldır Serumu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G2500</td><td>PBS-CMF</td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>BiochromA6</td><td>A-2712</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>Toz</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Merck</td><td>1002891000</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Beyni Korteks Astrositleri</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>1800-SC</td><td></td></tr><tr><td>Malassez hücre sayım odası</td><td>vWR</td><td>HECH40453702</td><td>Sayım manuel olarak yapıldı.</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Hücre dışı matris bazlı hidrojel</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0503</td><td>Penisilin / Streptomisin çözeltisi ECM ve setlerinde sağlanır.</td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Steritop</td><td>Kırlangıç Sistemi</td><td>SCGPT0SRE</td><td>0.22 & m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>Transwell insert&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>0.4 ve mikro; M Gözenekli Polikarbonat Filtre&nbsp;</td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA nötralizasyon çözeltisi</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0113</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA çözeltisi</td><td>ScienCell&nbsp;</td><td>0103</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > İmmünositokimya< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DENİZ BLOĞU engelleme tamponu</td><td>ThermoScientific</td><td>37527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-Fare ikincil antikoru</td><td>Thermofisher</td><td>A11031</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-Tavşan ikincil antikoru</td><td>Thermofisher</td><td>A11036</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 primer antikoru</td><td>InVitrogen</td><td>34-1600</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Anti-Desmin primer antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab6322</td><td>Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>Anti-glial Fibriler asidik protein primer antikoru</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü-&beta; birincil antikor</td><td>Abcam</td><td>ab51090</td><td>Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>Anti-VE-kaderin primer antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Zona Oklüdens-1 primer antikor</td><td>InVitrogen</td><td>61-7300</td><td>Seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>Normal Keçi</td><td>Serumu Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>ProLong DAPI Invitrogen ile Elmas Antifade Mountant</td><td>&nbsp;</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Gen ekspresyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,933,250</td><td></td></tr><tr><td>96 çok plakalı kuyu</td><td>Biorad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>iSCRIPT</td><td>Biorad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>Mühürleyici levha&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Protein ekspresyonu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Laemli Numune Tamponu</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td>50 & mikro ekleyin; L bMerkaptoetanol 950 & mikro; L Laemmli Tamponu ve -20 ° C'de saklayın. Test için protein numunesi ile 1: 1 oranında seyreltin.</td></tr><tr><td>Anti-Meme Kanseri Direnci Protein primer antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab207732</td><td>Ön tedavi Ajitasyon altında RT'de 15 dakika; seyreltme 1: 1000, ANN 4 ° C'de; C</td></tr><tr><td>Anti-Claudin-5 primer antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>Ön tedavi 95 ° C'de 5 dakika; C; seyreltme 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Glikoz Taşıyıcı 1 primer antikor</td><td>Millipore</td><td>07-1401</td><td>Ön tedavi 95 ° C'de 5 dakika; C; seyreltme 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Fare ikincil antikoru</td><td>Dako</td><td>P0447</td> TBS-Tween Anti-P-glikoprotein birincil antikoru <td>Genetex'te 1:5000 seyreltme</td></tr><tr><td></td><td></td><td>GTX23364</td><td>Ajitasyon altında RT'de 15 dakika ön tedavi; seyreltme 1:400, RT</td></tr><tr><td>Anti-Tavşan ikincil antikoru</td><td>Dako</td><td>P0448'de</td> 3 saat <td>Seyreltme 1:8000 TBS-Tween</td></tr><tr><td>Anti-Transferrin Reseptörü birincil antikoru</td><td>Abcam'da</td> seyreltme<td>ab84036</td><td>Ön arıtma 95 ° C'de 5 dakika; C; seyreltme 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Zona okcludens-1 primer antikor</td><td>Abcam</td><td>ab216880</td><td>Ön tedavi 95 ° C'de 5 dakika; C; seyreltme 1:1000, O.N. 4&deg; C</td></tr><tr><td>Kriteri TGX Jel&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>5678083</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Çözümü</td><td>Amersham&nbsp;</td><td>RPN2236</td><td>Karanlıkta tutmak için vahiy çözümü</td></tr><tr><td>Fosspataz inhibitör kokteyli 2</td><td>Sigma</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>Fospataz inhibitörü kokteyli 3</td><td>Sigma</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Protein Standartları</td><td>Biorad</td><td>161-0373</td><td>Moleküler ağırlık belirteçleri</td></tr><tr><td>RIPA 10x</td><td>Millipore</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>Biorad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-Glisin</td><td>Biorad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>BBB bütünlük testi< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Floresein</td><td>Ampresco</td><td>0681</td> <td>& lambda; ör= 490 nm; &lambda; em= 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elacridar</td><td>Sigma</td><td>SML0486</td><td>GF120918</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20 kDa</td><td>Sigma</td><td>FD-20S</td> <td>& lambda; ör= 490 nm; &lambda; em=&nbsp; 525 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma</td><td>R8004</td> <td>ve lambda; ör= 501 nm; &lambda; EM= 538 nm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>SinerjiTM H1&nbsp;</td><td>BioTek Instruments</td><td></td><td>Floresan çoklu plaka okuyucu</td></tr><tr><td><güçlü>Nanojel Taşıma</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Şırınga</td><td>Terumo</td><td>SS + 01T1</td><td>1 mL şırınga ve nbsp;</td></tr><tr><td>Filtre</td><td>FisherScientific</td><td>15161499</td><td>0.2 & mikro; m PTFE membran filtre, 15 mm çapında</td></tr><tr><td>N-İzopropilakrilamid (NIPAM) bazlı hidrojeller&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Çalışmada kullanılan nanojeller (NG'ler), Londra Queen Mary Üniversitesi Kimya Bölümü'ndeki işbirlikçimiz tarafından sağlanmaktadır. NG'ler kovalent olarak bir floresan molekülü (&lambda; ör= 477 nm; &lambda; EM= 540 nm). NG'ler dondurularak kurutulur ve toz halinde sevk edilir, bu durumda oda sıcaklığında uzun süre stabil kalırlar.</td></tr></tbody></table>

İnsan kan-beyin bariyerini modelleyen Üçlü kültür hücre sistemi

A Triple Culture Cell System Modeling the Human Blood-Brain Barrier

İlaçların beyne verilmesi, beyin parankimine erişimi kontrol eden ve kısıtlayan kan-beyin bariyerinin (BBB) son derece spesifik ve kısıtlayıcı özellikleri nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, nanoteknolojilerin gelişmesiyle birlikte, ilaç dağıtımını iyileştirmek için yeni nanomalzemelerden oluşan büyük paneller geliştirildi ve klinik öncesi tahliller çerçevesinde beyin penetrasyonunu tahmin etmek için güvenilir in vitro mikrosistemlere duyulan ihtiyacı vurguladı. İşte BBB'yi yalnızca insan hücrelerini kullanarak modellemek için mikrofizyolojik bir sistem kurmak için basit bir yöntem. Konfigürasyonunda, model, beyin benzeri endotel hücreleri (BLEC'ler), perisitler ve astrositler, BBB özelliklerini sıkılaştırma bileşiklerine ihtiyaç duymadan daha fizyolojik bir şekilde indüklemek ve düzenlemek için gerekli üç ana BBB hücresel aktörü içeren üçlü bir kültürden oluşur. 6 günlük üçlü kültürden sonra hazır olan 12 delikli plaka formatında geliştirilen model, fiziksel özellikler, gen ve protein ifadelerinde karakterize edilir ve polimerik nanojel taşıma ölçümü için kullanılır. Model, sağlıklı ve patolojik koşullarda çok çeşitli deneyler için kullanılabilir ve molekül ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi değerlendirmelerinin yanı sıra hücreler arası ve hücre içi kaçakçılık için değerli bir araçtır.

İnsan üçlü kültürü BBB modelinin ayarlanması İnsan BBB in vitro modelinin ayarlanması için gerekli protokol Şekil 1'de açıklanmıştır ve sırasına kesinlikle uyulması gereken ardışık adımları içerir. İlk olarak, üç hücre tipi, bir kesici uç filtre sistemine monte edilmeden önce hücre kültürü kaplarında (Şekil 1A) ayrı ayrı yetiştirilir. Üçlü kültür ayarı, ilk hücre tipi olan astrositlerin önceden kaplanmış alt kuyuya tohumlanmasıyla başlar. Ertesi gün, perisitler ve EC'ler sırasıyla kesici uç filtresinin önceden kaplanmış abluminal ve luminal yüzeylerine tohumlanır. Kesici uç filtresi daha sonra astrositlerin üzerine aktarılır. Model, ECs'deki BBB özelliklerini indüklemek için gereken süre olan 6 gün boyunca kültürde tutulur ve patentli ortak kültür modeli24'e göre her geçen gün bir ortam yenilenir. EC'ler daha sonra BLEC'ler olarak yeniden adlandırılır (Şekil 1B).
İnsan BBB modelinin karakterizasyonu Üçlü hücre kültürü modeli, bir dizi BBB'ye özgü özelliğin varlığı ile karakterize edilmiştir. Her şeyden önce, immünositokimya verileri, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β (PDGFR-β) 25,26 ve perisitler için desmin ve astrositler için glial fibriler asidik protein (GFAP)26 gibi konvansiyonel belirteçlerin ekspresyonunu doğruladı (Şekil 2A). Bu nedenle, perisitler ve astrositlerle yapılan 6 günlük kültürden sonra, BLEC'lerin tek katmanı, VE-Kadherin'in yapışkan birleşim boyaması ile görselleştirilerek, hücre sınırlarında TJ proteinlerinin, Claudin-5 ve ZO-1'in sürekli bir lokalizasyonunu gösterir (Şekil 2A). TJ'lerin kurulumu, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, düşük moleküler ağırlıklı BBB bütünlük belirteçleri, yani NaF (376 Da)16,27 ve yüksek moleküler ağırlık, yani FD20 (20 kDa)27 kullanılarak ölçülen düşük parasellüler geçirgenlik katsayıları ile ilişkilidir. Ölçülen değerler, ECs23,24,28'in tam kaynağını kullanan doğrulanmış BBB in vitro modellerle karşılaştırılabilir. Toplamda, bu sonuçlar, in vivo BBB'nin karakteristiği olan üçlü kültür BLEC monolayer'ın düşük parasellüler geçirgenliğini vurgulamaktadır. Ek olarak, BLEC'lerde R123 hücre içi birikim, efflux pompa inhibitörü Elacridar23,24'ün varlığında, yokluğu ile kontrol durumuna kıyasla anlamlı bir artış göstermiştir (Şekil 2C). Bu, BLEC'lerde aktif efflux pompa moleküllerinin, yani P-gp ve BCRP'nin varlığını gösterir.
BLEC'leri daha da karakterize etmek için, anahtar BBB özelliklerinin gen ekspresyonu ve protein seviyesi incelenmiştir (Şekil 3). Üçlü kültür modeli ile elde edilen veriler, kontrol modeli olarak kullanılan ECs ve perisitler24'ten oluşan doğrulanmış ve patentli ko-kültür modeli ile karşılaştırılmıştır. Astrositler, üçlü kültür modelinde ilk ko-kültür modeline eklenen üçüncü hücre tipini temsil eder. Bu nedenle, üçlü kültür BLEC'lerinin gen ekspresyon analizi (Şekil 3A), ko-kültür BLEC'leri ile karşılaştırıldığında, TJ proteinleri (claudin-5 ve zonula oklüdenleri-1) ve efflux pompaları (P-gp ve BCRP) gibi temel BBB özelliklerinin ekspresyonunun sürdürülmesini ve en çok çalışılan BBB taşıyıcılarının (glikoz taşıyıcı 1) ve reseptörlerin (transferrin reseptörü) yukarı regülasyonunu göstermiştir. Protein nicelleştirme verilerinin (Şekil 3B) transkripsiyonel sonuçlarla uyumlu olduğu bulunmuştur. Genel olarak, bu veriler, doğrulanmış ortak kültür modeline benzer şekilde üçlü kültür BLEC katmanında BBB özelliklerinin pozitif indüksiyonunu desteklemektedir. Toplamda, üçlü kültür modeli, in vitro mikrofizyolojik bir sistemin BBB'yi modellemesi için gerekli fiziksel ve metabolik özellikleri gösterir.
İlaç dağıtım stratejilerine uygulanabilirlik - nanojel taşınmasının ölçülmesi Yeni beyin dağıtım stratejilerini incelemek için üçlü kültür modelini kullanma olasılığını değerlendirmek için, floresan etiketli NIPAM tabanlı nötr NG'lerin taşınması 6,15 olarak değerlendirildi. 0 zamanında, NG'ler luminal bölmeye 0.1 mg / mL'lik bir konsantrasyonda yerleştirildi (Şekil 4A). 24 saatlik inkübasyondan sonra, NG'lerin% 5.82'si abluminal bölmede bulundu (Şekil 4B), BLEC'leri geçme yeteneklerini kanıtladı.
Sonuçlar, bütünlük belirteçlerinde açıklandığı gibi küçük ve büyük bileşiklerin geçirgenliğini ölçmek ve polimerik NG'ler gibi nanomalzemelerin taşınmasını değerlendirmek için modelin uygunluğunu göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig01.jpg"> Şekil 1: İnsan BBB'sinin in vitro üçlü kültür modelinin ayarlanması için kritik adımların temsili. (A) BBB modelinin üç hücre bileşeninin faz-kontrast görüntüleri: endotel hücreleri (EC), perisitler (PC) ve astrositler (AC). Ölçek çubuğu = 250 μm. (B) Üçlü kültür insan BBB in vitro modelinin ayarlanması için şematik ve açıklayıcı zaman çizelgesi. Vurgulanan kutu, ters çevrilmiş kesici uç filtresinin kaplama prosedürünü temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig02.jpg"> Şekil 2: Üçlü kültür BBB modelinin özelliklerinin değerlendirilmesi. (A) BLEC'ler (Claudin-5: CLD5, Zona Occludens-1: ZO1 ve VE-Cadherin: Ve-Cadh), perisitler (Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü Reseptörü-β: PDGFR-β ve desmin) ve astrositler (Glial Fibriler Asidik Protein: GFAP) için ayırt edici belirteçlerin temsili immünoboyama görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) BLEC'lerin floresan BBB bütünlük belirteçlerine, Sodyum Floreseine (NaF, 376 Da, Pe: 0,61 ± 0,062) ve FITC-Dextran'a (FD20, 20 kDa, Pe: 0,04 ± 0,005) parasellüler geçirgenliği. N = 3; n = 9. ECS'de SEM (C) P-gp ve BCRP işlevselliğinin ortalama ±, hücre içi R123'ün Elacridar ile (% 124.2 ±% 3.39) ve Elacridar olmadan (% 100 ±% 8.79) ölçülmesiyle değerlendirildi. N = 4; n = 12. Ortalama ± SEM. p = eşlenmemiş bir t-testi kullanılarak 0.017. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig03.jpg"> Şekil 3: Üçlü kültür modelinde ayırt edici belirteçlerin BLEC gen ekspresyonu ve protein düzeyinin ko-kültür BBB modeline göre değerlendirilmesi. (A) RPLP0 ekspresyonu ile normalleştirilen sıkı bağlantı proteinlerinin (Claudin-5: CLD5 ve Zona Occludens-1: ZO1), taşıyıcıların (Glikoz Taşıyıcı-1: GLUT1, P-glikoprotein: PGP ve Meme Kanseri Direnç Proteini: BCRP) ve büyük molekül reseptörlerinin (Transferrin Reseptörü: TRFR) gen ekspresyonu. N = 3; n = 9. (B) β-aktin ekspresyonu ile normalleştirilen sıkı bağlantı proteinlerinin (CLD5 ve ZO1), taşıyıcıların (GLUT1, PGP ve BCRP) ve büyük molekül reseptörlerinin (TRFR) protein seviyesi. N = 3; n = 9. Sem'± ortalama. (A) ve (B) için, değerler&gt;1, üçlü kültür modelinde daha yüksek gen ekspresyonuna veya protein seviyelerine karşılık gelir. Kırmızı çizgi, iki modelin ekspresyon seviyesinin (genler veya proteinler) eşdeğer olduğu 1 değerine karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63134/63134fig04.jpg"> Şekil 4: Üçlü kültür modelinde nanojel taşınmasının ölçülmesi. (A) Nanojel taşıma testinin şematik gösterimi. (B) Üçlü kültür modelinde 24 saatlik inkübasyondan sonra nanojel taşıma yüzdesi (% 5.82 ±% 0.09). N = 2; n = 6. Ortalama ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63134/63134fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2" rowspan="2">Arabelleğin adı</td>
			<td colspan="3">Kompozisyon</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">Not</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td>Moleküler Ağırlık</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fosfat Tampon Salin, Kalsiyum Magnezyum İçermez</td>
			<td rowspan="5">PBS-CMF</td>
			<td>Arjantin</td>
			<td>8 g/L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="5">Tüm bileşiği steril suya ekleyin ve tam çözünmeyi bekleyin. Elde edilen çözeltinin pH'ı 7.3-7.4 aralığında olmalıdır. 0,22 μm'lik bir membran kullanarak çözeltiyi filtlatın ve steril çözeltiyi 4 °C'de saklayın.</td>
		</tr><tr><td>Kartal</td>
			<td>0,2 g/B</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>KH2PO4</td>
			<td>0,2 g/B</td>
			<td>136.09</td>
		</tr><tr><td>NaHPO4-12 H2O</td>
			<td>2,87 g/L</td>
			<td>358.14</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td rowspan="8">Zil HEPES</td>
			<td rowspan="8">RH</td>
			<td>Arjantin</td>
			<td>8,8 g/L</td>
			<td>58.4</td>
			<td colspan="2" rowspan="8">Tüm bileşiği steril suya ekleyin ve tam çözünmeyi bekleyin. PH'ı 7,4'e ayarlayın (başlangıç çözeltisi pH'ı 6,8 civarındadır). 0,22 μm'lik bir membran kullanarak çözeltiyi filtlatın ve steril çözeltiyi 4 °C'de saklayın.</td>
		</tr><tr><td>Kartal</td>
			<td>0.387 g/L</td>
			<td>74.55</td>
		</tr><tr><td>CaCl2</td>
			<td>0,244 g/L</td>
			<td>110.99</td>
		</tr><tr><td>MgCl 2 6H2 O</td>
			<td>0.0406 g/L</td>
			<td>203.3</td>
		</tr><tr><td>NaHCO3</td>
			<td>0,504 g/L</td>
			<td>84.1</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>1,19 g/L</td>
			<td>238.3</td>
		</tr><tr><td>Glikoz</td>
			<td>0,504 g/L</td>
			<td>180.16</td>
		</tr><tr><td>Su</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Protokolde kullanılan farklı tamponların bileşimi.

Bu protokol, in vitro model bir insan kan-beyin bariyeri (BBB) oluşturmak için bir yöntem açıklar. Endotel hücreleri ve perisitler bir kesici uç filtrenin (kan bölmesi) her iki tarafına ekilir ve astrositler alt kuyucuğa (beyin bölmesi) ekilir. Karakterize edilen model, nanopartikül taşıma deneyleri için kullanılmıştır.

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

The delivery of drugs to the brain remains a challenge due to the blood-brain barrier's (BBB) highly specific and restrictive properties, which controls ...

Beyne ilaç dağıtımı bir zorluk olmaya devam etti. Beyne teslimatı iyileştirmek için yeni nanomalzemelerden oluşan büyük panellerin geliştirilmesi, klinik öncesi tahliller çerçevesinde beyin penetrasyonunu tahmin etmek için gerçek in vitro mikrosisteme duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, kan beyin bariyeri fenotipinin indüksiyonu için gerekli olan hücre hücresi iletişimine izin veren aynı sistem içindeki kan beyin bariyerinin serbest ağrı hücresel gerçeklerini buzlamaktır.Ayrıca, her hücre tipi daha ileri moleküler analiz için ayrı ayrı izole edilebilir. Model, sağlıklı ve patolojik koşullarda çok çeşitli deneyler için kullanılabilir ve molekül ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi değerlendirmelerinin yanı sıra hücreler arası ve hücre içi kaçakçılık için değerli bir araçtır. Prosedürü gösteren Dr. Clemence Deligne ve Dr. Eleonora Rizzi olacak.Kuyucukları santimetre kare başına 500 mikrolitre iki mikrogram Poli-L-Lizin çözeltisi ile kodlayarak başlayın. Gece boyunca veya 37 santigrat derecede en az bir saat boyunca inkübe edin ve Poli-L-Lizin çözeltisini, aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipetle dikkatlice çıkarın. Daha sonra steril su ile iki kez durulayın.Astrositleri toplamak için, önce astrositleri bir kez 10 mililitre ılık 1X PBS CMF ile yıkayın. Bunları% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede 10 mililitre sıcak% 20 Tripsin EDTA çözeltisi ile üç dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri şişeden mekanik olarak ayırın ve süspansiyonu beş mililitre sıcak seyreltilmemiş FCS içeren konik bir tüpe aktarın.Süspansiyonu 20 santigrat derecede beş dakika boyunca 190 kez G'de santrifüj yapın. Hücre peletini beş mililitre ılık astrosit ortamında tekrar askıya alın, ardından hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini 80 mikrolitre 1X PBS CMF ile seyreltin. Mikroskop altında manuel bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.Her Poli-L-Lizin santimetre kare başına yaklaşık 40.000 hücre, 1.5 mililitre sıcak astrosit ortamı hacminde önceden kodlanmıştır. Geri döndürülmüş kesici uç filtrelerini 25 milimetre yüksekliğindeki kapalı bir kabağın çevresine yerleştirin ve kesici uç filtrelerine 250 mikrolitre kolajen tip bir çözelti ekleyin. Bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.Ardından, aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipetle kollajen tip bir çözeltiyi dikkatlice çıkarın. Oda sıcaklığında 250 mikrolitre DMEM yüksek glikoz ile iki kez yıkayın ve tüm çözeltiyi kesici uç filtrelerinden dikkatlice çıkarın. Perisitleri 10 mililitre ılık 1X PBS CMF ile iki kez yıkayın ve hücreleri iki mililitre ılık Tripsin ile inkübe edin.Tripsin'in etkisini izlemek için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Hücreler ayrılmaya başladığında, Tripsin'i çıkarın, ardından hücrelere beş mililitre sıcak endotel hücresi bazal ortamı veya ECM ekleyin ve mekanik ayrışmaya başlayın. Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini 80 mikrolitre 1X PBS CMF ile seyreltin ve daha önce gösterildiği gibi mikroskop altında manuel bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.Tohum 44, santimetre kare başına 500 hücre üzerinde önceden kodlanmış ters çevrilmiş insert filtreler hacminde 250 mikrolitredir. Kesici uç filtrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ve %21 oksijen altında üç saat boyunca 37 santigrat derecede tutun. Kesici uç filtrelerini kuyu başına 1,5 mililitre sıcak ECM içeren 12 kuyucuklu bir plakaya dikkatlice geri döndürmek için steril cımbız kullanın.Kesici uç filtreleri artık diğer taraftan kaplanmaya hazırdır. Üst tarafı ve kesici uç filtrelerini 500 mikrolitre hücre dışı matris bazlı hidrojel ile kaplayın. Kesici uç filtrelerini nemlendirilmiş bir inkübatöre bir saat boyunca% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede yerleştirin.Oda sıcaklığında 500 mikrolitre DMEM yüksek glikoz ile bir kez yıkayın. Endotel hücre kültürünü bir kez 10 mililitre ılık 1X PBS CMF ile yıkayın ve hücreleri iki mililitre ılık Tripsin ile inkübe edin. Hücreler ayrılmaya başladığında tripsin çıkarın, ardından beş mililitre sıcak ECM ekleyin ve mekanik ayrışmaya başlayın.Hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini 80 mikrolitre 1X PBS CMF ile seyreltin ve manuel bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Endotel hücrelerini, 500 mikrolitre sıcak ECM hacminde önceden kodlanmış kesici uç filtreler üzerinde santimetre kare başına 71.500 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Astrosit ortamını kuyu başına 1,5 mililitre sıcak ECM ile değiştirin.Daha sonra tohumlanmış kesici uç filtrelerini astrositleri içeren kuyucuklara aktarın. Üç kültürlü hücre sistemlerini nemlendirilmiş bir inkübatöre% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede yerleştirin. Bir aspirasyon sistemine bağlı bir cam pipet kullanarak ortamı üst ve alt bölmeden dikkatlice çıkarın.Ortamı, üst bölmede 500 mikrolitre ve alt bölmede 1,5 mililitre hacimde ılık ECM ile değiştirin. Aynı prosedürü tekrarlayarak ortamı altıncı güne kadar her gün yenileyin. Son olarak, hücreleri% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen altında 37 santigrat derecede nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.İmmünositokimya verileri, perisitler için trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta ve Desmine ve astrositler için glial fibriler asidik protein gibi geleneksel belirteçlerin ekspresyonunu doğruladı. Bu nedenle, perisitler ve astrositlerle altı günlük kültürden sonra, Ve-Kadherin'in yapışkan bağlantı boyaması ile görselleştirilen beyin benzeri endotel hücrelerinin veya BLEC'lerin tek katmanı, hücre sınırlarında TJ proteinleri CLD5 ve Z-01'in sürekli bir lokalizasyonunu gösterir. BLACS'ın floresan BBB bütünlük belirteçlerine, sodyum floreseine ve FITC dekstrana parasellüler geçirgenliği burada gösterilmiştir.BLEC'lerde R123 hücre içi birikim, efflux pompa inhibitörü Elacridar'ın varlığında, yokluğu ile kontrol durumuna kıyasla önemli bir artış göstermiştir. Bu, BLEC'lerde aktif efflux pompa moleküllerinin, yani P glikoprotein ve meme kanseri direnç proteininin veya BCRP'nin varlığını gösterir. RPLP0 ekspresyonu ile normalleştirilen sıkı bağlantı proteinleri, taşıyıcılar ve büyük molekül reseptörlerinin gen ekspresyonu burada gösterilmiştir.Burada, birden büyük değerler, üçlü kültür modelinde daha yüksek gen ekspresyonuna karşılık gelir. Kırmızı çizgi, iki modelin ifade düzeyinin eşdeğer olduğu bir değere karşılık gelir. Temsili görüntü, beta aktin ekspresyonu ile normalleştirilen büyük molekül reseptörlerindeki sıkı bağlantı proteinlerinin, taşıyıcıların protein seviyesini göstermektedir.Floresan etiketli NIPAM esaslı nötr polimerik nano jellerin taşınması değerlendirildi. Sıfır zamanında, polimerik nano jeller luminal bölmeye mililitre başına 0.1 miligram konsantrasyonda yerleştirildi. 24 saatlik inkübasyondan sonra, polimerik nano jellerin% 5.82'si abluminal bölmede bulundu ve BLEC'leri geçme yeteneklerini kanıtladı.Geri döndürülen filtre üzerindeki perisitlerin doğru kaplanması ve tohumlanması çok önemlidir. Önemli olan, hücre kültürü sisteminin kirlenmesini önlemek için yapıların sterilitesinin ve bütünlüğünün korunmasıdır.

a-triple-culture-cell-system-modeling-the-human-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, insan beyni perisit, astrosit ve endotel hücrelerinin birlikte kültürlenmesini göstermektedir. Her hücre katmanı ayrı ayrı oluşturulur ve daha sonra birlikte kültürlenir, böylece kan-beyin bariyerinin hücresel düzenlemesini taklit eden üç katmanlı bir sistem...

İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Hücre Kültürü Modelinin Geliştirilmesi

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Koroid pleksusun (CP) epitel hücreleri kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini (BCSFB) oluşturur. BCSFB'nin in vitro modeli, insan koroid pleksus papilloma (HIBCPP) hücrelerini kullanır. Bu makale, bir hücre kültürü filtre ekleme sistemi kullanılarak HIBCPP hücrelerinin kültürlenmesini ve bazolateral enfeksiyonunu açıklamaktadır.

İnsan Kan BOS Bariyer A Koroid Pleksus Epitel Hücre bazlı Modeli bazolateral Side Bakteriyel Enfeksiyon Eğitim için

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Biz Lucifer Sarı (LY) hCMEC / D3 hücre monolayers, insan kan-beyin bariyerinin bir in vitro modeli görünür parasellüler geçirgenlik belirlemek için sağlam bir belirteç olduğunu göstermek için bir floresan tahlili salıyoruz. Bu analizi, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde etkili bir monolayer oluşumunun kinetiklerini belirlemek için kullandık.

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

Burada bir içinde cellulo BBB (kan beyin bariyerini) ayarını açıklayan bir iletişim kuralı mevcut-Minibrain polyester geçirgen membran kültür taşıma biomolecules veya enfeksiyöz ajanlar arasında bir insan BBB değerlendirmek için sistem eklemek ve onların komşu beyin hücreleri üzerinde fizyolojik etkisi.

Bariyer geçişleri patojenler veya ilaçlar ve onların etkileşim beyin ile çalışmak için bir insan kan-beyin arabirim modeli

İnsan kan-beyin bariyeri seçici hidrofilik moleküllerin ve patojenlerin beyne penetrasyon engeller. Menenjit ve postoperatif deliryum da dahil olmak üzere çeşitli patolojiler, kan-beyin bariyerinin artan geçirgenliği ile ilişkilidir. Burada, bariyer geçirgenliğini mikrobiyal geçiş le test etmek için bir endotel hücre kültür modelini tanımlıyoruz.

Mikrovasküler Endotel Hücreleri Ile Mikrobiyal Traversal ile Kan-Beyin Bariyerinin Geçirgenliğinin Analizi

Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Keşfedin kan-beyin bariyeri modellemesi için üçlü hücre kültürü yöntemini. Endotelyal hücreler, perisitler ve astrositler kullanılarak nanopartikül taşınımı ve ilaç teslimatı mekanizmaları incelenir.

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

Daha fazla video keşfet