Name: Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, Escherichia coli ve diğer bakterilerden hücre dışı vezikülleri ölçeklenebilir bir yöntemle izole etme ve saflaştırma tekniklerini. Bu protokol, büyük hacimli kültürlerden tekrarlanabilir EV izolasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yukarıda açıklanan araştırma NIH TL1 TR002549-03 eğitim desteği ile desteklenmiştir. Dr. John C. Tilton ve Zachary Troyer'e (Case Western Reserve University) partikül boyutu analizörü cihazına erişimi kolaylaştırdıkları için teşekkür ederiz; Lew Brown (Spectradyne), partikül boyutu dağılım verilerinin analizinde teknik yardım için; Cornell Üniversitesi'nden Dr. David Putnam, pClyA-GFP plazmid14'ü sağladığı için; ve bize E. coli MP113'ü sağladığı için Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. Mark Goulian.

<ol><li>Yanez-Mo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Das, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+observations+on+the+excretion+of+cell-wall+material+by+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae.</a> Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).</li>
<li>Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+beta-lactamase+is+packaged+into+membrane+vesicles+and+secreted+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).</li>
<li>Yonezawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Helicobacter+pylori+TK1402+are+involved+in+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation.</a> BMC Microbiology. 9, 197(2009).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Petousis-Harris, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+group+B+outer+membrane+vesicle+meningococcal+vaccine+against+gonorrhoea+in+New+Zealand%3A+a+retrospective+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study.</a> Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).</li>
<li>Kim, O. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+suppress+tumor+by+interferon-gamma-mediated+antitumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response.</a> Nature Communications. 8 (1), 626(2017).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+enhanced+tumor+delivery+of+engineered+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 105, 195-205 (2016).</li>
<li>Watson, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+cGMP-compatible+purification+of+extracellular+vesicles+carrying+bioactive+human+heterodimeric+IL-15%2Flactadherin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088(2018).</li>
<li>Lasaro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+isolate+for+studying+colonization+of+the+mouse+intestine+and+its+application+to+two-component+signaling+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts.</a> Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Reimer, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+outer+membrane+vesicle+isolation+methods+with+an+Escherichia+coli+tolA+mutant+reveals+a+hypervesiculating+phenotype+with+outer-inner+membrane+vesicle+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 628801(2021).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yukarıdaki protokolde, ölçeklenebilir ve EV'leri çeşitli gram-negatif / pozitif ve aerobik / anaerobik bakterilerden güvenilir bir şekilde izole eden bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür boyunca birkaç potansiyel durma noktasına sahiptir, ancak EV'leri şartlandırılmış bakteri kültürü ortamından izole etmek için 48 saatten daha uzun sürmekten kaçınmak daha iyidir.
İlk olarak, şartlandırılmış bakteri kültürü ortamı oluşturmak için bakteri kültürlemesinden oluşur. Kültür süresini en az 48 saate ç...

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler tarafından salgılanan lipitler, proteinler, glikanlar ve nükleik asitlerden oluşan nanometre boyutunda, lipozom benzeri yapılardır1. EV'lerin gram-negatif bakterilerden salınımını görselleştiren ilk çalışmalardan bu yana, bakteriyel EV'lere (çapı 20-300 nm) atfedilen biyolojik fonksiyonların sayısı son yıllarda sürekli artmaktadır. İşlevleri arasında antibiyotik direncinin aktarılması3, biyofilm oluşumu4, çekirdek algılama5 ve toksin dağıtımı6 bulunur. Bakteriyel EV'lerin terapötik olarak kullanılmasına, özellikle aşıbilimi 7 ve kanser tedavisi8'de artan bir ilgi vardır.
EV araştırmalarına artan ilgiye rağmen, izolasyon yöntemleriyle ilgili hala teknik zorluklar var. Spesifik olarak, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve çeşitli EV üreten organizmalarla uyumlu izolasyon yöntemlerine ihtiyaç vardır. EV izolasyonu ve araştırma yöntemlerini planlamak ve raporlamak için birleşik bir ilkeler kümesi oluşturmak için, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği, MISEV pozisyon makalesi9'u yayınlar ve günceller. Ayrıca, EV-TRACK konsorsiyumu, şeffaflığı artırmak için yayınlanan makalelerde kullanılan EV izolasyonu için ayrıntılı metodolojileri raporlamak için açık bir platform sağlar10.
Bu protokolde, EV'lerin memeli hücre kültüründen izolasyonu için kullanılan önceki metodolojiler, EV'lerin bakteriyel hücre kültüründen izole edilmesini sağlamak için 11,12 uyarlanmıştır. Ölçeklenebilir olabilen çeşitli mikroplardan EV izolasyonunu sağlayan ve EV saflığını ve verimini dengeleyen yöntemler kullanmaya çalıştık (MISEV pozisyon kağıdı9'da tartışıldığı gibi). Santrifüjleme ve filtreleme yoluyla bakteri hücrelerini ve kalıntıları temizledikten sonra, kültür ortamı ya santrifüj cihazı ultrafiltrasyonu (~ 100 mL'ye kadar bir hacim için) veya pompa tahrikli TFF (daha büyük hacimler için) ile konsantre edilir. EV'ler daha sonra küçük EV'lerin saflaştırılması için optimize edilmiş sütunlar kullanılarak SEC tarafından izole edilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63155/63155fig01.jpg"> Şekil 1: Bakteriyel EV izolasyonu iş akışı şemasına genel bakış. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; TFF = teğetsel akış filtrasyonu; SEC = boyut dışlama kromatografisi; MWCO = moleküler ağırlık kesme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63155/63155fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Escherichiacoli'nin bir fare-kommensal suşu (yani, E. coli MP113) model bir organizma olarak kullanılmış ve daha önce bildirildiği gibi sitolisin A'ya füzyon yoluyla EV-ilişkili nanolusiferazı eksprese etmek için modifiye edilmiştir14. Burada kullanılan yöntemler, en az birkaç litreye kadar bakteri kültürünü işleyebilir ve EV ile ilişkili olmayan proteinleri etkili bir şekilde ayırabilir. Son olarak, bu yöntem diğer gram-pozitif ve gram-negatif bakteri türleri için de kullanılabilir. Bildirilen deneylerin ilgili tüm verileri EV-TRACK bilgi tabanına (EV-TRACK ID: EV210211)10 sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL düz kapaklı, ince duvarlı PCR tüpleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>3430</td> Qubit %16 <td>ile doğru okumalar elde etmek için ince duvarlı PCR tüplerinin kullanılması önemlidir</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (formaldehit) sulu çözelti</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Fiberlite polipropilen santrifüj şişeleri</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1495</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Fiberlite polipropilen santrifüj şişeleri</td><td>ThermoFisher</td><td>010-1493</td><td></td></tr><tr><td>65 mm Polipropilen Yuvarlak Tabanlı/Konik Şişe Adaptörü</td><td>Beckman Coulter</td><td>392077</td><td>Vivacell'in rotor</td></tr><tr><td>Akkermansia mucinophila</td><td>ATCC</td><td>BAA-835</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-15 (100 kDa MWCO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-20 XPI santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Artık Beckman tarafından satılmamaktadır. Avanti J-26XP en yakın çağdaş modeldir.</td></tr><tr><td>Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482</td><td>ATCC</td><td>29148</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium breve</td><td>NCIMB</td><td>B8807</td><td></td></tr><tr><td>Bifidobacterium dentium</td><td>ATCC</td><td>27678</td><td></td></tr><tr><td>Beyin Kalp infüzyonu (BHI) suyu</td><td>Himedia</td><td>M2101</td><td>Otoklavlamadan sonra, Hem BHI suyu hem de agar, Menadione (1 & mikro; g / L), hematin (1.2 ve mikro; g/L) ve L-Sistein Hidroklorür (%0,05). Daha sonra anaerobik bakteri suşları ile aşılamadan önce anaerobik koşullar altında en az 24 saat inkübe edildiler.</td></tr><tr><td>C-300 mikroakışkan kartuş</td><td>Spektradin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>MP Biyomedikal</td><td>ICN19032105</td><td></td></tr><tr><td>Elektron mikroskobu</td><td>FEI şirketi</td><td>Tecnai G2 SpiritBT</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HST08 (Steller yetkin hücreler)</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MP1</td><td>Dr. Mark Goulian (hediye)</td><td></td><td>fare bağırsağından elde edilen kommensal bakteriler</td></tr><tr><td>Fiberlite 500 mL ila 250 mL adaptör</td><td>ThermoFisher</td><td>010-0151-05</td>, <td>250 mL'lik şişelerin daha küçük boyutlu başlangıç bakteri kültürü için kullanılmasını sağlamak üzere Fiberlite rotor ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Fiberlite sabit açılı santrifüj rotoru</td><td>ThermoFisher</td><td>F12-6x500-LEX</td><td>6 x 500 mL şişelere uyar</td></tr><tr><td>Formvar Karbon Film 400 Mesh, Bakır Elektron</td><td>mikroskobu bilimleri</td><td>FCF-400-CU</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehit (EM dereceli,% 10 aqeous çözelti)</td> <td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>Hematin</td><td>ChemCruz</td><td>207729B</td><td>Stok çözeltisi 0.2 M L-histidin çözeltisinde &nbsp; 1.2 mg / mL</td></tr><tr><td>Sonsuz M Nano + Mikroplaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td></td><td>Bu ekipman, mCherry floresan</td></tr><tr><td>In-Fusion&nbsp'yi ölçmek için kullanıldı; HD Klonlama Plus</td><td>Takara</td><td>638909</td><td>PCR fragementlerinin PCR ile lineraize edilmiş vektörlere klonlanması için</td></tr><tr><td>JS-5.3 AllSpin Sallanan Kova Rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Lauria Bertani (LB) et suyu, Miller</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein Hidroklorür</td><td>J.T. Baker</td><td>2071-05</td><td>Tartılmalı ve doğrudan anaerobik içindeki otoklavlanmış BHI ortamına eklenmelidir. hazne</td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Dişi Luer - Hortum Barb Adaptörü, 1/8" ID; 25/PK</td><td>cole-parmer - filtrasyon</td> boru devresi için özel <td>HV-30800-08</td><td>bağlantı adaptörleri</td></tr><tr><td>Masterflex Bağlantı Elemanı, Polipropilen, Düz, Erkek Luer - Hortum Dikeni Adaptörü, 1/8" ID; 25/PK</td><td>cole-parmer - filtrasyon</td><td>boru devresi</td><td></td></tr> <tr><td>için özel HV-30800-24 bağlantı adaptörleriMasterflex L/S Analog Değişken Hızlı Konsol Sürücüsü, 20 ila 600 rpm</td><td>Masterflex</td><td>HV-07555-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Hassas Boru için Kolay Yükleme Başlığı, 4 Silindirli, PARA Muhafaza, SS Rotor</td><td>Masterflex</td><td>EW-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Hassas Pompa Hortumu, PharmaPure, L/S 16; 25 ft</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06435-16</td><td>düşük bağlayıcı/düşük sızıntılı boru</td></tr><tr><td>Menadione (Vitamin K3)</td><td>MP</td><td>102259</td><td>Stok çözeltisi etanolde 1 mg/mL</td></tr><tr><td>MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK</td><td>Repligen</td><td>D04-E100-05-N</td><td>TFF cihazı olarak 2 L'ye kadar E. coli kültür süpernatantını filtrelemek için kullandık</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Test Sistemi</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Bu tahlil kiti, nluc raportör proteini</td></tr><tr><td>NanoLuc (Nluc) Luciferase Antikoru'nun lüminesansını ölçmek için kullanıldı, klon 965808</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>MAB10026</td><td></td></tr><tr><td>nCS1 mikroakışkanlar dirençli darbe algılama cihazı</td><td>Spektradin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCS1 Görüntüleyici</td><td>Parçacık boyutu dağılımı için</td><td>spektrin</td><td></td> Analiz yazılımı</tr><tr><td>Standart Tamponlu OneTaq 2x Master Mix NEB</td><td></td><td>M0482</td><td>DNA polimeraz ana karışımı, koloni kontrolü için rutin PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Protein LoBind, 2.0 mL, PCR temiz tüpler</td><td>Eppendorf</td><td>30108450</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492</td><td>DNA polimeraz ana karışımı, qEV orijinalini klonlamak için gereken PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılır</td></tr><tr><td>, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td><td>maksimum yükleme hacmi 0,5 mL</td></tr><tr><td>qEV raf</td><td>Izon</td><td></td><td>qEV-orijinal SEC sütunları</td></tr><tr><td>qEV-2, 35 nm</td><td>Izon</td><td></td> <td>ile kullanım içinmaksimum yükleme hacmi 2 mL</td></tr><tr><td>Qubit florometre</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Ürünü artık mevcut değil. Mevcut en yakın ürün Qubit 4.0 Florometre (kat. Hayır. Q33238)</td></tr><tr><td>Qubit protein test kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33211</td><td>Kitini oda sıcaklığında saklayın. Standartlar 4 ° C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 santrifüj</td><td>ThermoFisher</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x Mikroplaka okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td>Bu ekipman, nanolusiferaz biyolüminesansını ölçmek için kullanıldı</td></tr><tr><td>Stericup Hızlı Açılan GP Steril Vakum Filtrasyon sistemi (150, 250 veya 500 mL)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE</td><td>Çalışma hacimlerini barındırmak için bir veya birden fazla filtre kullanılabilir. Deneyimlerimize göre, ürün boyutunda listelenen hacmin iki katını filtreleyebilirsiniz.</td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>Elektron mikroskobu bilimleri</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Vinil anaerobik oda</td><td>Coy Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivacell 100, 100.000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VC1042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 Plus şırınga filtreleri (0.02 mikron)</td><td>MilliporeSigma</td><td>MRPS seyrelticiyi filtrelemek için</td> <td>WHA68093002</td></tr></tbody></table>

Ölçeklenebilir İzolasyon ve escherichia coli ve diğer bakterilerden hücre dışı veziküllerin saflaştırılması

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Çeşitli bakteri türleri, lipitler, proteinler, nükleik asitler, glikanlar ve ebeveyn hücrelerden türetilen diğer moleküllerden oluşan ~ 20-300 nm hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılar. EV'ler, türler arası ve türler arası iletişim vektörleri olarak işlev görürken, aynı zamanda enfeksiyon ve kolonizasyon bağlamında bakteri ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşime katkıda bulunur. Sağlık ve hastalıkta EV'lere atfedilen çok sayıda fonksiyon göz önüne alındığında, EV'leri in vitro ve in vivo çalışmalar için izole etmeye yönelik artan bir ilgi vardır. EV'lerin fiziksel özelliklere, yani boyuta göre ayrılmasının, veziküllerin çeşitli bakteri kültürlerinden izolasyonunu kolaylaştıracağı varsayılmıştır. 
İzolasyon iş akışı, EV'lerin bakteri kültürlerinden izolasyonu için santrifüjleme, filtreleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisinden (SEC) oluşur. Ölçeklenebilirliği artırmak için pompa tahrikli teğetsel akış filtrasyonu (TFF) adımı dahil edildi ve malzemenin litre başlangıç hücresi kültüründen izole edilmesini sağladı. Escherichia coli , EV ile ilişkili nanolusiferaz ve EV ile ilişkili olmayan mCherry'yi muhabir proteinler olarak ifade eden bir model sistem olarak kullanılmıştır. Nanolusiferaz, N-terminusunu sitolisin A ile kaynaştırarak EV'lere hedeflendi. İlişkili sitolisin A - nanoLuc ile ilişkili 20-100 nm EV'ler içeren erken kromatografi fraksiyonları, serbest proteinleri içeren daha sonraki fraksiyonlardan farklıydı. EV ile ilişkili nanolusiferazın varlığı, immünogold etiketleme ve transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulandı. Bu EV izolasyon iş akışı, diğer insan bağırsağı ile ilişkili gram-negatif ve gram-pozitif bakteri türlerine uygulanabilir. Sonuç olarak, santrifüjleme, filtrasyon, ultrafiltrasyon / TFF ve SEC'nin birleştirilmesi, EV'lerin çeşitli bakteri türlerinden ölçeklenebilir izolasyonunu sağlar. Standartlaştırılmış bir izolasyon iş akışının kullanılması, türler arasında mikrobiyal EV'lerin karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştıracaktır.

EV'ler için hangi SEC kromatografi fraksiyonlarının zenginleştirildiğini değerlendirmek için, SEC kolonuna TFF tarafından 1.000 kat konsantre edilmiş 2 mL E. coli MP1 şartlandırılmış kültür ortamı yüklendi ve sıralı fraksiyonlar toplandı. MRPS kullanılarak, Fraksiyonlar 1-6'nın en fazla EV'yi içerdiği bulunmuştur (Şekil 2A). Sonraki fraksiyonlar, EV-içermeyen proteinler yerine çok az sayıda EV içeriyordu (Şekil 2B). EV'ler öncelikle &lt;100 nm çapındayd...

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Bu protokol önemlidir, çünkü hücre dışı vezikülleri çeşitli bakterilerden yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde izole etmenin bir yolunu sağlar. Bu teknikle ilgili en güzel şey, EV'leri in vivo çalışmalara olanak sağlayacak oldukça geniş bakteri kültürü ortamlarından izole etmek için kullanılabilmesidir. Gösterdiğimiz veriler klinik öncesi uygulamaları yansıtırken, bu protokolün terapötikler için bakteriyel EV'lerin üretimine uyarlanabileceği öngörülebilir.Bu yöntem, küçük değişikliklerle herhangi bir ölçeklenebilir hücre kültürü sistemine uygulanabilir. Protokol ölçeklenebilirliği nedeniyle, bakteri hücre kültürünün istenen başlangıç hacimlerini işlemek için uygun boyutta filtrelere ve SEC sütunlarına sahip olmak önemlidir. Prosedürleri gösterenler, Dr. Justin Lathia'nın laboratuvarında yardımcı teknoloji uzmanı olan Sadie Johnson, Dr. Justin Lathia'nın laboratuvarında onkoloji araştırmacısı olan Dionysius Watson ve laboratuvarımda bir araştırma teknolojisi uzmanı olan Akeem Santos.Tek bir Escherichia coli kolonisini, steril bir döngü kullanarak 250 ila 1000 mililitre Luria-Bertani veya LB suyuna aşılayarak başlayın. Daha sonra, kültürü dakikada 300 rotasyonda ve 37 santigrat derecede titreyen bir inkübatörde aerobik olarak inkübe edin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, 500 mililitrelik polipropilen santrifüj şişelerini temizlemek için hücre kültürlerini 15 dakika boyunca dört santigrat derece ve 5.000 kez G'de büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda santrifüje aktararak bakteri kültürü ortamını netleştirin.Süpernatantı temiz santrifüj şişelerine 15 dakika boyunca 10.000 kez G'de dikkatlice dökerek aktarın. Daha sonra, süpernatantı uygun boyutta 0,2 mikronluk bir polietersülfon vakum tahrikli filtre cihazına aktarın ve filtreleme cihazını bir vakum duvarı beslemesine bağlayın. Filtreleme hızı önemli ölçüde düşerse, filtrelenmemiş malzemeyi yeni bir cihaza taşıyın.Filtrelenmiş ortam gece boyunca dört santigrat derecede saklanabilir veya hemen işlenebilir. Canlı hücrelerin tamamen çıkarılmasını kontrol etmek için, filtrelenmiş süpernatantın bir alikotunu uygun agar plakalarına yayın ve bakteri suşu için optimum koşullarda inkübasyondan sonra herhangi bir koloninin bulunmamasını sağlayın. Filtrelenmiş ortamı 100 mililitre hacimle yoğunlaştırmak için, 90 mililitre filtrelenmiş kültür ortamını santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 100 kilodalton moleküler ağırlıklı bir kesimle yükleyin ve üst rezervuardaki hacim 0,5 mililitreden daha az yoğunlaşana kadar 15 ila 30 dakikalık aralıklarla sallanan kova rotorunda ortamı dört santigrat derece ve 2.000 kez G'de santrifüj edin.Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurmak için, yeniden dengelemek üzere cihazın altındaki akışı kaldırın. Rezervuardaki konsantre ortamın viskozitesi gözle görülür şekilde artarsa, ortamı PBS ile seyreltin ve 100 kilodaltonluk moleküler ağırlık kesiminden daha küçük olan hücre dışı vezikülleri veya EV proteinlerini azaltmak için santrifüjleme yoluyla yeniden konsantre edin. Daha sonra, konsantre ortamı gece boyunca dört santigrat derecede saklamak için düşük proteinli bir bağlama tüpüne aktarın Filtrelenmiş ortamı 100 mililitreden daha büyük bir hacimle yoğunlaştırmak için, 100 kilodaltonluk bir moleküler ağırlık kesimine sahip uygun boyutta bir teğetsel akış filtrasyonu veya TFF cihazı seçin.Makalede açıklandığı gibi bir filtreleme devresini monte ettikten sonra, istenen akış hızına karşılık gelen uygun hızı belirlemek için 200 mililitre PBS'yi dereceli bir kaba pompalayın. Hız ayarlandığında, filtrelenmiş şartlandırılmış ortamı oda sıcaklığında dakikada yaklaşık 200 mililitrede dolaştırın ve 100 kilodaltondan küçük molekülleri toplayın, ultrafiltrasyon membranını ayrı bir kapta atık olarak geçerek şartlandırılmış ortamın hacmi 100 ila 200 mililitreye düşürülene kadar. Filtrelenmiş hacmi PBS ile sırayla iki kat seyreltin ve hacmi 75 ila 100 mililitreye ve daha sonra 25 mililitre ve 10 mililitreye konsantre etmek için ortamı pompayla daha küçük kaplarda dolaştırmaya devam edin.Besleme borusunu numune haznesinden çıkarın ve maksimum numune miktarını geri kazanmak üzere filtreyi boşaltmak için pompalayın. Konsantre numuneyi, 100 kilodaltonluk moleküler ağırlık kesimine sahip 15 mililitrelik bir santrifüj ultrafiltrasyon cihazına taşıyın ve üst rezervuardaki ortamın hacmi iki mililitreden az olana kadar 15 ila 30 dakikalık aralıklarla dört santigrat derece ve 2.000 kez G'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj yapın. Konsantre ortamı, gece boyunca dört santigrat derecede saklamak için düşük proteinli bir bağlayıcı tüpe aktarın.EV'lerin izolasyonu için, 100 mililitreden az başlangıç malzemesi için 10 mililitrelik yatak hacmine sahip küçük bir sütun ve 100 mililitreden fazla başlangıç malzemesi için 47 mililitrelik yatak hacmine sahip daha büyük bir sütun kullanarak boyut hariç tutma kromatografisi veya SEC gerçekleştirin. Deneyden birkaç saat önce, SEC kolonunu ve PBS'yi oda sıcaklığına getirin, ardından standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak sütunu dikey konumda stabilize edin. SEC kolonuna bağlanmadan önce, beş mililitre PBS'nin fritten bir atık kabına akmasına izin vererek numune haznesini nemlendirin.Ardından, numune haznesine iki mililitre PBS eklemek için kolonun giriş kapağını sökün ve PBS fritten damlarken rezervuarı dikkatlice kolona bağlayın. Kolonun dengelenmesi için, numune haznesine 47 mililitre PBS ekleyin, ardından SEC sütununun alt kısmını açın. Ardından, yüklenen tüm numune arabelleğinin sütundan akmasına izin verin ve akışı atın.Numunenin iki mililitresini numune rezervuarına yükledikten sonra, numunenin kolona tamamen girmesine izin verin ve akışı toplayın. PBS'yi derhal numune rezervuarına 14,25 mililitre eksi numune hacminde ekleyin, böylece çözeltinin kolondan akmasına izin verirken, kolon boşluk hacmine eşit miktarı atın. Daha sonra, iki mililitre PBS'nin sütundan geçmesine izin verdikten sonra ilk akışı veya fraksiyonu toplamak için iki mililitrelik düşük bağlayıcı bir mikrotüpü doğrudan SEC sütununun altına yerleştirin.Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına iki mililitre PBS eklemeye devam edin. Toplanan fraksiyonları kısa süreli depolama için dört santigrat derecede veya uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede saklayın. EV'lerin toplanan fraksiyonlarının sterilite testi için, kültür ortamının üç mililitresini, tahlillerde kullanılacak fraksiyonların 100 mikrolitresi ile aşılayın.Daha sonra, en az üç gün boyunca bulanıklığı gözlemlerken ortamı en uygun koşullar altında kültürleyin. Alternatif olarak, fraksiyon örnekleri, üreten bakterileri büyütmek için kullanılan ortamı içeren agar plakalarına uygulanabilir, daha sonra koloni oluşumunu kontrol edebilir. Daha sonra, donma-çözülme döngülerini önlemek için bireysel veya havuzlanmış fraksiyonların% 25 ila% 50'sini eksi 80 santigrat derecede düşük proteinli bağlayıcı tüplere aktararak EV'leri saklayın.Temsili analiz, erken kromatografi fraksiyonlarında Escherichia coli MP1 EV'lerin elüsyonunu göstermektedir. Bir ila altı fraksiyon, ortalama çapı 100 nanometreden düşük olan en fazla EV'yi içeriyordu. Aynı zamanda, sonraki fraksiyonlar EV-içermeyen proteinler ve çok az sayıda EV içeriyordu.EV zenginleştirmesi ve boyutu, özellikle iki ila altı fraksiyonda, iletim elektron mikroskobu ile doğrulandı. İki ila yedi EV-ile zenginleştirilmiş fraksiyonların yüksek nanolusiferaz aktivitesine sahip olduğu, ancak daha sonraki fraksiyonlarınkine kıyasla EV ile ilişkili olmayan mCherry'den sadece çok düşük bir floresan sinyaline sahip olduğu gözlenmiştir. İmmünogold etiketleme, nanolusiferazın EV ilişkisini iki ila beş fraksiyonda doğruladı.Protokolün diğer bakteri türlerine uygulanabilirliği, EV'lerin çeşitli anaerobik bakteri kültürlerinden izole edilmesiyle değerlendirildi. Bir ila dört arasındaki erken kromatografi fraksiyonlarının, çap boyutu 100 nanometreden daha düşük olan EV'ler için zenginleştirildiği gözlendi. Kompleks beyin-kalp infüzyonu veya BHI, toplam EV veriminin% 25'inden daha azında EV boyutlu parçacıkları içeriyordu.Bakteriyel hücre kültürünün başlangıç hacmini işleyebilen TFF cihazlarının kullanılması önemlidir. Bu teknik, karmaşık hayvan modellerindeki işlevleri hakkında biyolojik sorular sormak için yeterli EV üretmemizi sağlar.

scalable-isolation-purification-extracellular-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Watson, DC, et.al. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, genetiği değiştirilmiş bakterilerin dış zarından türetilen hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonunu ve konsantrasyonunu göstermektedir. İşlem, EV'leri serbest bırakmak için bakterilerin kültürlenmesini, ardından hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için sıralı santrifüjleme ve filtreleme adımlarını içerir. Son olarak,...

Dış Zar Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Bakterilerden İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Kaynak: Watson, D.C., ve diğerleri. Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Ölçeklenebilir İzolasyonu ve Saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2021)Bu video, bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) bir bakteri kültürü filtratından izole etmek için gözenekli reçine boncukları ile boyut dışlama kromatografisinin kullanımını göstermektedir. Daha büyük EV'ler reçine gözeneklerini atlayarak erken ayrışırken, daha küçük proteinler gözeneklere girer ve daha sonra ayrışır.

Boyut Dışlama Kromatografisi Kullanılarak Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu 

Bu video, karakterizasyon çalışmaları için uygun hücre dışı veziküllerin alt popülasyonlarını izole etmek için yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüjleme tabanlı saflaştırma yöntemini göstermektedir.

Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarının Saflaştırılması: Yoğunluk Gradyanlı Ultrasantrifüjleme Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Alt Popülasyonlarını Saflaştırma Tekniği

Bu videoda, bakterilerden türetilen heterojen bir dış zar vezikülleri veya OMV popülasyonunu ayırmak için bir teknik olan boyut dışlama kromatografisini gösteriyoruz. Bu veziküller nano boyutlu küresel yapılardır ve Boyut Dışlama Kromatografisi ile boyutlarına göre büyük ve küçük alt popülasyonlara ayrılır.

Bakteri hücre dışı veziküllerin boyut dışlama kromatografisine dayalı ayrılması: Gram negatif bakteriyel dış zar veziküllerinin heterojen popülasyonunu boyutlarına göre ayırmak için bir teknik

Bu video, Mycobacterium tuberculosis'in (Mtb) kültür süzüntüsünden bakteriyel hücre dışı vezikülleri (EV'ler) saflaştırmak için boyut dışlama kromatografisi (SEC) tekniğini göstermektedir. Teknik, EV'lerin saflaştırılmış fraksiyonlarını elde etmek için gözenekli reçine dolgulu bir kolon kullanır. Gözenekli parçacıklar seçici olarak daha küçük proteinlerin gözeneklere girmesine izin vererek daha yavaş elüsyona neden olur. Aynı zamanda, EV'lerin daha büyük boyutları nedeniyle gözeneklere girmesi...

Mikobakteriyel hücre dışı vezikülleri saflaştırmak için bir boyut dışlama kromatografisi tekniği

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Bu protokol, ev çökeltme, yoğunluk gradyan ultracentrifugation ve parçacık yakalama birleştirerek yüksek verimlilik ve verim ile virions uzak hücre dışı veziküller (EVs) izole aerodinamik bir iş akışı ve başlangıç bir azalma sağlamak için tüm EV araştırmalarında kullanılmak üzere tekrarlanabilir preparatlar ile sonuçlanan hacim gereksinimleri.

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

Bakteriyel veziküller patogenezde önemli roller oynar ve umut verici biyoteknolojik uygulamalara sahiptir. Veziküllerin heterojenliği analiz ve kullanımı zorlaştırır; bu nedenle, değişen boyutlarda vesikleleri ayırmak için basit, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Burada, Aggregatibacter actinomycetemcomitanstarafından üretilen heterojen vezikülleri ayırmak için boyut dışlama kromatografisinin kullanımını gösteriyoruz.

Bakteriyel Dış Zar Vezikül Heterojenliğini Analiz Etmek için Boyut Dışlama Kromatografisi

Buradaki protokol, hücre dışı veziküllerin, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak şartlandırılmış hücre kültürü ortamından yeterince ayrılabileceğini göstermektedir.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Bu protokol, hücre dışı membrana bağlı veziküller içinde paketlenmiş, tipik olarak çözünmeyen veya disülfür bağı içeren proteinler de dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin bakteriyel üretimi için ayrıntılı bir yöntem açıklamaktadır. Bu, uygulamalı biyoteknoloji ve tıp da dahil olmak üzere çok yönlü bilimsel araştırma alanlarına uygulanma potansiyeline sahiptir.

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi

Bu çalışma, yoğunluk gradyanlı santrifüjleme (DGC) yoluyla insan dışkısından zenginleştirilmiş bakteriyel hücre dışı vezikülleri (BEV'ler) izole etmek ve saflaştırmak için bir yöntemi açıklamakta, BEV'lerin fiziksel özelliklerini morfoloji, partikül boyutu ve konsantrasyondan tanımlamakta ve DGC yaklaşımının klinik ve bilimsel araştırmalardaki potansiyel uygulamalarını tartışmaktadır.

Yoğunluk Gradyanlı Santrifüj Kullanılarak İnsan Dışkısından Bakteriyel Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Öğrenin, Escherichia coli ve diğer bakterilerden hücre dışı vezikülleri ölçeklenebilir bir yöntemle izole etme ve saflaştırma tekniklerini. Bu protokol, büyük hacimli kültürlerden tekrarlanabilir EV izolasyonu sağlar.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet