Böbrekte Salgılanan Proteinlerin Kaynağının Brefeldin A Enjeksiyonu ile Belirlenmesi

Tekniğimiz, yaralı böbreklerde sitokin üreten hücrelerin kaynağını ve göreceli katkısını belirlememizi sağlar. Protein salgılanmasını önlemek için Brefeldin A'nın kullanılması, hücre tipi ve bu hücrelerin durumu gibi katı organlarda sitokin üreten hücreler hakkında daha fazla bilgi toplamamızı sağlar.

Protokolümüz birçok organ sistemine kolayca uyarlanabilir olmalıdır. Brefeldin A, hücre geçirgen küçük bir molekül olduğundan, çoğu hücre tipinde salgılanmayı inhibe etmeli, sitokinlerin ve diğer salgılanan proteinlerin saptanmasına izin vermelidir.

Kuyruk kemiği enjeksiyonu, fare kuyruk kemiği oldukça küçük olduğu için teknik olarak en zorlu adımdır. Protokolümüzü deney hayvanları üzerinde gerçekleştirmeden önce bu adımı uygulamanızı öneririz.

[Öğretim Görevlisi] Farelerin sıcak olduğundan emin olmak için kafesin yarısını açık, yarısını ısıtma yastığının yarısını koyarak başlayın. Fareyi bir kısıtlama cihazına yerleştirdikten sonra, kuyruğu bir povidon iyot ve alkollü çubuk kullanarak üç kez dezenfekte edin. Kuyruğu yatay olarak tutun ve yanal kuyruk damarlarını görselleştirin. Ardından, iğneyi ve şırıngayı damara paralel olarak başın yönüne doğru tutarak 28 gauge bir iğne yerleştirin. Mililitre BFA çözeltisi başına 1.25 miligramın 200 mikrolitresini enjekte edin. Kan enjeksiyon solüsyonu ile değiştirildiği için damar berraklaşmalıdır. Ardından iğneyi çıkarın ve kanama durana kadar kuyruğu hafifçe bastırın. Fareleri kafese geri koyun ve ek kanama veya sıkıntı belirtileri açısından izleyin. 20 mililitrelik bir şırınga kullanın ve fareyi sol ventrikülden 10 ila 20 mililitre PBS ile perfüzat berraklaşana kadar dakikada iki ila dört mililitre akış hızında perfüze edin. Renal arter ve veni papillaya yakın tutarak ve böbrekten uzakta yan taraftaki damarı keserek böbrekleri çıkarın. Daha sonra böbrek kapsülünü elle veya bir çift ince steril forseps ile soyarak nazikçe çıkarın. Hidrofobik bir bariyer işaretleyici kalem kullanın ve dokudan hidrofobik bariyer taslağına en az beş milimetre mesafeyi koruyarak doku bölümlerini ana hatlarıyla belirtin. Daha sonra bölümün üstüne %3 eşek serumu ve %0.1 sığır serumu albümin TBS içinde %1 triton içeren 50 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığını bir saat inkübe edin. Birincil antikorları uygun konsantrasyonda PBS ile seyreltin. Sitokinleri tespit etmek için, 50 mikrolitre PBS'de TGF beta one, PDGF-D veya CTGF'ye yönelik antikorları seyreltin. Miyofibroblastları etiketlemek için 1:200 dilüsyonda birincil antikor çözeltisine Cy3 ile konjuge Anti-Alfa SMA birincil antikoru ekleyin. Bloke edici tamponu çıkarın ve birincil antikorları bölüme ekleyin, böylece dairesel hidrofobik anahattan sızmamasını sağlayın. Nemlendirilmiş bir odada gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Nemlendirilmiş odayı inkübatörden çıkarın ve slaytları PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, uygun ikincil antikorları PBS ile bir ila 200 arasında seyreltin. Numuneleri 50 mikrolitre ikincil antikor solüsyonu ile nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Slaytları nemlendirilmiş hazneden çıkarın ve beş dakika boyunca PBS ile yıkayın. PBS'de floresein ile konjuge edilmiş lotus tetragonolobus lektini, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda kalsiyum ve magnezyum ile seyreltin. Daha sonra dokuları 50 mikrolitre LTL çözeltisi ile nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Slaytları nemlendirilmiş hazneden çıkarın ve beş dakika boyunca kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ile yıkayın. DNA çekirdeklerini oda sıcaklığında beş dakika boyamak için dokuları 50 mikrolitre DAPI ile inkübe edin. PBS ile bir kez yıkayın. Kapak fişlerini monte etmek için dokuya 20 mikrolitre antifade montaj reaktifi ekleyin ve ardından kapak fişini yavaşça yerleştirin. Görüntülemeden önce antifade reaktifinin katılaşması için 24 saat bekleyin. Otomatik bir XY aşaması ile ters çevrilmiş mikroskobu açın ve 20x objektifi seçin. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin ve doku bölümünü bulun. Ardından görüntü alma yazılımını açın ve canlı görüntü penceresini açmak için canlı'ya tıklayın. Odakta olduğundan emin olarak doku bölümünü bulun. Edinme menüsüne tıklayın ve büyük resmi tara'yı seçin. Sahneyi joystick'i kullanarak doku bölümünün en sol kısmına hareket ettirerek taranacak alanı ayarlayın ve ardından sol oka tıklayın. Bunu en üst, en sağ ve alt doku segmentleri için tekrarlayın. Edinme menüsüne tıklayın ve çok kanallı yakalama için onay kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Çok kanallı görüntüler yakalamak için lambda sekmesine tıklayın, her bir kanala tıklayın ve pozlama süresini, görüntünün herhangi bir bölümünü doygunlaştırmadan lekelenmenin belirgin olduğu bir seviyeye ayarlayın. Toplanacak her kanal için bunu tekrarlayın. Ardından Tara'ya tıklayın. Görüntü alma yazılımını açın ve Dosya'ya tıklayın. Ardından Aç'a tıklayın ve resmi seçin. Görüntü penceresine sağ tıklayın ve Polygonal ROI'yi seçin. Yatırım getirisini serbest bir araçla ana hatlarıyla belirtin. Daha sonra LTL pozitif tübül hücrelerini veya alfa SMA pozitif interstisyel hücreleri ana hatlarıyla belirtin. Ölçüm sekmesine ve ardından eşiğe tıklayın. Kaydırıcıları pozitif sinyal alanının her iki tarafına ayarlayarak üst ve alt eşik sınırlarını ayarlayın. Ardından ROI sekmesine tıklayın. Son olarak, değerleri kaydetmek için dışa aktar simgesine tıklayın. ROI alanına göre pozitif sinyal alanının yüzdelerini hesaplamak için elektronik tablo yazılımını kullanın.

[Sunucu] Sisplatin veya salin uygulamasından sonraki üçüncü günde TGF beta pozitif veziküller temsili görüntülerde gösterilmektedir. BFA varlığında sisplatin ile tedavi edilen böbreklerde LTL ile işaretlenmiş PTC'lerde TGF beta pozitif veziküller gözlenir. Bununla birlikte, bu veziküller yaralanmamış veya BFA tedavi edilmemiş böbreklerde gözlenmemiştir.

[Öğretim Görevlisi] Modifikasyon, sisplatin ile indüklenen akut böbrek hasarında BFA tedavisi ile TGF beta pozitif alanda bir artış olduğunu gösterdi. TGF beta'ya benzer şekilde, sisplatin ile indüklenen ABH'de BFA tedavisi ile PTGF-D pozitif veya CTGF pozitif veziküller de birikmiştir. Kantifikasyon, PDGF-D pozitif ve CTGF pozitif alanların da BFA ile önemli ölçüde arttığını gösterdi: LTL pozitif proksimal tübül hücrelerinde BFA enjeksiyonu, sisplatin enjeksiyonundan sonraki üçüncü günde plazma BUN seviyelerini önemli ölçüde artırmadı. BFA tedavisi ile sisplatin ABH'de alfa SMA işaretli interstisyel hücrelerde TGF beta pozitif veziküller gözlendi. Modifikasyon, sisplatin ABH'de BFA tedavisi ile alfa SMA pozitif alandaki TGF beta pozitif alanların önemli ölçüde arttığını ortaya koydu. TGF beta pozitif veziküllere benzer şekilde, CTGF pozitif veziküller de BFA tedavisi ile artmıştır. Kantitasyon, BFA tedavisinin, sisplatin ile indüklenen AKI'de CTGF pozitif alanın alfa SMA pozitif alana oranını arttırdığını gösterdi. Sisplatin kaynaklı yaralanma ile karşılaştırıldığında, PTC'lerdeki TGF-beta pozitif veziküller AA'nın kronik fazında çok daha küçüktü. LTL pozitif PTK'larda minimal pozitif boyanma vardı. Bununla birlikte, böbrek hasarı molekülü bir pozitif PTC'deki TGF beta'nın sinyal yoğunluğu BFA tedavisi ile artmıştır. TGF beta'nın ortalama yoğunluk seviyesi, BFA enjeksiyonu ile BFA olmayana göre üç kat daha yüksekti.

En kritik adım, kuyruk damarı enjeksiyonunun başarılı olmasını sağlamaktır. Başarısız bir enjeksiyon sonuçları atar. Bu yüzden lütfen enjeksiyonla damarın belirginleşmesi gibi başarı belirtilerini arayın ve lütfen kuyrukların şişmesi gibi başarısızlık belirtilerini arayın.

Brefeldin A enjeksiyonu, bir organ veya tek hücre ölçeğinde sitokin üretimini değerlendirmek için western blot veya akış sitometrisi dahil olmak üzere bir dizi testle birleştirilebilir.

Bu tekniği kullanarak, daha önce diğer hücre tiplerinden geldiği düşünülen böbrek epitel hücreleri tarafından salgılanan yeni sitokinleri tanımlayabildik. Belirli hücre tiplerinin yaralanmaya katkısı hakkında uzun süredir devam eden tartışmaları çözmek için kullanılabilir.