Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu
8 Mart 2022
Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.
Bu protokol, melanom metastazının aday düzenleyicilerinin in vivo etkilerini ve aynı zamanda diğer solid malignitelerin metastazını değerlendirmek için kullanılabilecek sürekli bir iş akışı içindeki bir dizi tekniği açıklamaktadır. Sistematik iş akışımızın temel avantajı, sağlam ve standartlaştırılmış in vivo modeller ve teknikler sayesinde verilerin tekrarlanabilirliğinin artmasıdır. Bu boru hattı, Omics verilerinden veya in vitro tahlillerden çıkarılan adayları in vivo bir ortamda test ederek hedef keşfi ve terapi geliştirme için bir yol sunar.
Bu protokolde sunulan tekniklerle ilişkili öğrenme eğrisi, sağlanan materyaller kullanılarak ve adımları uygularken ayrıntılı açıklama izlenerek kısaltılır. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olmak, Preklinik Görüntüleme Çekirdeği'nde bir araştırma bilimcisi olan Orlando Aristizabal ve laboratuvarımda bir eğitmen olan Ran Moubarak olacak. İntradermal enjeksiyonlar için, aseptik koşulları korurken biyogüvenlik kabini içinde sekiz ila 10 haftalık bir fareyi anestezi altına alın ve tıraş edin.
Daha sonra cildi iğne bıçağının yörüngesine karşı geriye doğru kavrayın ve geri çekin ve altı milimetre uzunluğunda, 31 gauge insülin şırınga iğnesi kullanarak, eğim yukarı bakacak şekilde cildi keskin bir açıyla hafifçe delin. Kubbe şeklinde bir tekerlek gözlenene kadar tümör hücresi süspansiyonunun 30 mikrolitresini yavaşça enjekte edin. Tümör büyümesinin, kilo kaybının ve genel sağlık durumunun ilerlemesini izleyin.
Bu izleme seansları sırasında, kaliperlerle ölçümler yapın ve hacmi hesaplamak için tümörün uzunluk ve genişlik boyutlarını kullanın. İntrakardiyak enjeksiyonlar için, anestezi uygulanmış bir fareyi ultrason makinesinin ısıtılmış platformuna aktarın. Daha sonra hipoalerjenik bant kullanarak, fareyi burun konisine sabitleyin.
Toraksı düz bir tıraş bıçağı veya neşter bıçağı ile tıraş edin, 30 derecelik bir açıyla eğin ve prosedür alanının etrafındaki cildi% 10 povidon iyot ile temizleyin. Ardından, sol ventrikülün kesitsel bir görünümünü elde etmek için yönlendirilmiş yatay bir pencere yakalamak için ultrason probunu farenin sol tarafındaki toraksın ortasına yerleştirin. Probun uzun ekseni yukarı bakacak şekilde, probu 50 derecelik bir açıyla ve ısıtılmış platformu 20 derecelik bir açıyla sabitleyin, ardından probu ve destek çerçevesini pozisyonda kilitleyin.
Güvenlik kabininin içinde çalışırken, hücre süspansiyonunu 30 gauge bir inç iğne ile bir mililitrelik bir tüberkülin şırıngasında hazırlayın. Şırıngada bulunan hava kabarcıklarını çıkarın. Şırıngayı stereotaktik enjektöre kilitleyin.
Daha sonra ultrason rehberliğinde, iğneyi torasik duvardan kalbin sol ventrikülüne ilerletin ve tümör hücresi süspansiyonunun 100 ila 250 mikrolitresini yavaşça enjekte edin. Aşamalı hayatta kalma ameliyatı için, anestezi uygulanan fareyi ısınma pedine yerleştirin ve% 10'luk bir povidon iyot çözeltisi ile prosedür alanının etrafındaki cildi temizleyin. Steril kişisel koruma ekipmanı ve eldiven giydikten sonra, hayvanın vücudunun üzerine steril bir örtü koyun.
Daha sonra, İris makası veya neşter kullanarak, tümörün kenarından beş ila yedi milimetrelik bir rezeksiyon marjını koruyarak cildi kesin. İntradermal tümörler durumunda, tümörü çevresel cilt ile birlikte rezeke edin. Subkutan tümörler için, tümörü deri altında disseke edin ve çıkarın.
Tümör rezeksiyonundan sonra, yarayı dokuz milimetrelik zımbalama cihazıyla kapatın. İn vivo görüntüleme için, bir mililitre insülin şırıngası ve 28 gauge iğne ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla fareye d-luciferin substratı uygulayın, ardından fareyi uyuşturun ve biyolüminesans görüntüleme tarayıcısının içindeki bir burun konisine yerleştirin. Başlat'a basarak cihazı başlatın ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın.
Arka plan çıkarma için boş bir görüntü yakalamak üzere, edin'i tıklatın ve alma sırası tamamlandıktan sonra görüntüyü kaydedin. Veri analizi ve aynı in vivo görüntüleme yazılımı için, görüntülerin kaydedildiği klasöre gidin ve tek bir deneyden tüm farelerin görüntülerini açın. Birimleri ışımaya ayarlayın ve bireysel sinyalin gruplar arasında normalleşmesini engelleyeceğinden ilgili onay kutusunun işaretli olmadığından emin olun.
Daha sonra, ilgi alanı veya ROI çizim aracını kullanarak, beyin bölgesi için dairesel ROI'ler ve vücut için dikdörtgen ROI'ler çizin, beyin YG'sindeki kulakları ve burnu hariç tutun, çünkü spesifik olmayan parlaklık yayma eğilimindedirler. Önyargıyı en aza indirmek için, ışıldayan sinyal üst üste bindirilmemiş farelerin fotoğraflarına YG'ler çizin, ardından sinyali ölçmek ve verileri bir elektronik tabloya aktarmak için YG'leri ölç'ü seçin. İlgilenilen vücut bölgelerindeki toplam ışıldayan akıyı çizerek gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin.
Yazılım kullanarak bir NuMA boyamasından sonra, diğer organ parankimi ve boş alanlar hariç, organ dokusundaki tüm NuMA boyalı hücreleri içerecek şekilde bir ROI çizin. Her organ için uygun pozitif ve negatif denetimleri kullanırken NuMA pozitif ve NuMA negatif hücrelerini kategorilere ayırmak için ayarları yapın. Her örnek için NuMA pozitif hücrelerinin toplam yüzdesi sayısını ölçmek için yerleşik bir yazılım algoritması kullanın.
Biyolüminesans, parlak alan, ex vivo floresan ve hematoksilin ve eozin boyama görüntüleri, aday genlerin melanom metastazı üzerindeki etkilerinin analizinde çok yönlü yaklaşımı göstermektedir. Fukoziltransferaz susturulması, melanom hücrelerinin metastatik yayılımını bozmuştur. Kontrol Linda virüsü ile enfekte olmuş melanom hücrelerinin NuMA lekeli akciğer bölümleri ve Linda virüsünü eksprese eden bir metastaz baskılayıcı ile burada gösterilmiştir.
Metastatik melanom hücreleri yeşil olarak etiketlenir ve organ alanı yeşil kapaklı bir çizgi ile sınırlandırılır. İntradermal enjeksiyonlar yaparken ciltte uygun gerginliği korumak, şırıngalar hazırlarken hava embolisinden kaçınmak ve hayvanın hareketine müdahale etmemesi veya yara komplikasyonlarına yatkın hale getirmemesi gereken yeterli rezeksiyon marjları elde etmek, başarı oranını ve tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olur. İmmün filtrasyonu incelemek için multipleks görüntülemenin daha fazla kullanılması, gen ekspresyon analizi için tek hücreli RNA dizilimi ve mekansal transkriptomiklerin tümü, intratümöral heterojenliği incelemek için ücretsiz yollar sağlayabilir.
Bu protokolde açıklanan tekniklerin kombinasyonu, melanom beyin metastazında, melanom salgılanan amiloid beta'nın nöroinflamasyonu baskılamadaki ve beyin metastazını teşvik etmedeki rolü gibi yeni düzenleyicileri tanımlamamıza yardımcı oldu.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, melanom metastazının yeni aday mediatörlerini ve bunların etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışını açıklamaktadır. Sistematik iş akışı, sağlam in vivo modelleriyle tekrarlanabilirliği artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Metastaz Araştırması
Arka Plan
- Melanom metastazı, kanser tedavisinde önemli bir zorluktur.
- Metastazin mediatörlerini anlamak, daha iyi terapötik stratejilere yol açabilir.
- In vivo modelleri, in vitro çalışmaların gösteremediği içgörüler sağlar.
- Standartlaştırılmış teknikler veri güvenilirliğini artırır.
Çalışmanın Amacı
- Melanom metastazının aday düzenleyicilerinin in vivo etkilerini değerlendirmek.
- Mediatörleri test etmek için tekrarlanabilir bir iş akışı oluşturmak.
- Hedef keşfi ve tedavi geliştirmeyi kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Aday düzenleyicilerin in vivo değerlendirmeleri.
- Standartlaştırılmış intradermal enjeksiyon teknikleri.
- Tekrarlanabilirlik için sağlam hayvan modellerinin kullanımı.
- Prosedürel rehberlik için deneyimli araştırmacılarla işbirliği.
Ana Sonuçlar
- Mediatörleri değerlendirmede iş akışının etkinliğini gösterdi.
- Tekrarlanabilirlik için standartlaştırılmış tekniklerin önemini vurguladı.
- Melanom metastazının mekanizmaları hakkında içgörüler sağladı.
- Omik verilerden türetilen adayların testini kolaylaştırdı.
Sonuçlar
- İş akışı, melanom araştırması için değerli bir araçtır.
- Standartlaştırma, in vivo çalışmaların güvenilirliğini artırır.
- Bu yaklaşım, diğer solid maligniteler için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This workflow addresses the critical need for reproducible in vivo validation of metastasis regulators, reducing false positives from in vitro assays. By enabling precise phenotypic characterization of candidate genes in physiologically relevant models, it supports target de-risking and improves predictive confidence in early discovery. The platform’s adaptability across solid tumor types enhances portfolio-wide applicability for metastasis-focused programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of therapeutic hypotheses in physiologically relevant metastasis models.
- Operational Value: Standardized engraftment and monitoring protocols improve reproducibility across experimental batches.
- Predictive Value: Quantifiable endpoints such as tumor volume and bioluminescent flux support data-driven go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Harvested tissues and sorted tumor cells are compatible with downstream omics platforms like single-cell RNA sequencing.
- Quantitative Outputs: Metastatic burden and anatomic mapping via imaging and immunohistochemistry provide measurable phenotypes for hit validation.
- Scalability: Standardized procedures for intracardiac, intradermal, and subcutaneous injections enable consistent application across cell lines and models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models capture organ-specific metastasis, including brain and lung, enabling mechanistic insights into tropism and microenvironment interactions.
- Translational Continuity: Integration of imaging, histology, and molecular analysis supports biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Longitudinal monitoring allows early detection of efficacy signals, informing prioritization of candidates for further development.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the discovery continuum, bridging initial target identification from omics or in vitro screens to functional in vivo validation before lead optimization.
- Discovery Biology: Tests candidates inferred from omics data in a physiological context to clarify role in metastatic dissemination.
- Screening: Standardized injection and imaging techniques ensure reproducible compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Bioluminescent flux, tumor volume, and immunohistochemical quantification enable objective comparison across conditions.
- Translational Research: Anatomic mapping of metastases supports correlation with clinical patterns and biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Standardized workflows can be applied across tumor types and therapeutic areas, maximizing infrastructure investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking genetic or pharmacological perturbations to metastatic phenotypes in vivo.
- Operational Value: Standardized protocols minimize variability, enhancing cross-lab and cross-project consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering non-functional targets early, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on validated in vivo efficacy and mechanistic insight.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, anesthesia, and aseptic technique for intracardiac and intradermal injections.
- Dependence on imaging infrastructure (ultrasound, bioluminescence) and trained personnel for longitudinal monitoring.
- Necessitates standardized tissue processing pipelines for histology, immunofluorescence, and omics compatibility.
- Adaptation considerations include model-specific engraftment efficiency and metastatic tropism across cancer types.
- Practical limitations include animal welfare monitoring and endpoint-defined survival constraints affecting study duration.
