Name: Tripozomatid Enfeksiyonunu İncelemek için Kimyasal Kartografi Yaklaşımları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Keşfedin tripozomatid enfeksiyonunda metabolit dağılımını 3D modelleme ile. Bu yöntem, doku metabolik değişiklikleri ile parazit yükü arasındaki ilişkiyi canlı ölçekte haritalamanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laura-Isobel McCall, PhD, Burroughs Wellcome Fonu'ndan Bulaşıcı Hastalık Patogenezi Ödülü'nde bir araştırmacıya sahiptir. Yazarlar ayrıca NIH ödül numarası R21AI148886, Oklahoma Solunum ve Bulaşıcı Hastalıklar Merkezi'nden (OCRID) NIH ödül numarası P20GM103648 altında bir pilot hibe ve Oklahoma Üniversitesi'nden (LIM'e) başlangıç fonlarından destek almak istemektedir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve fon sağlayıcının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar ayrıca bu protokolde kullanılan araçların geliştiricilerine teşekkür etmek istiyor. İlgili tüm yayınlar, uygun olduğu durumlarda atıf alınmıştır.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri Oklahoma Üniversitesi veya Kaliforniya Üniversitesi San Diego Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Enfeksiyöz malzemeyi işleyen tüm adımlar bir biyogüvenlik kabini içinde (sınıf II, tip A2) ve yerel yönetmeliklere göre gerçekleştirildi.
1. Doku toplama
<ol><li>Uygun tripozosomatid enfeksiyon hayvan modellerini, genellikle fareleri veya hamsterları enfekte edin. NOT: Üretilen istenen semptomlara, hastalığın ilerleme hızına, hastalık şiddetine vb. Kullanıcılar kendi rahatlıklarında seçim yapabilirler.<ol>
<li>Cutaneous leishmaniasis enfeksiyon modelleri için, ayak altlığında veya kulakta intradermally olarak enfekte15.</li>
		<li>Viseral leishmaniasis enfeksiyon modelleri için intravenöz olarak enfekte edin1,17.</li>
		<li>Chagas hastalığı ve uyku hastalığı enfeksiyon modelleri için intraperitoneally enfekte6,12,18,19. Parazit suşuna ve planlanan zaman noktalarına göre kullanılacak parazit dozunu belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bölümleme pozisyonlarını planlayın.<ol>
<li>Bölüm başına en az 10 mg doku içeren bölümler oluşturmayı planlayın. 30-50 mg kullanmak en iyisidir.</li>
		<li>Chagas hastalığı enfeksiyon modelleri için, kardiyak ve gastrointestinal segmentleri sistematik olarak toplamayı planlayın.</li>
		<li>Cutanenöz leishmaniasis enfeksiyon modelleri için lezyonel doku ve lezyona bitişik örnekleri toplayın.</li>
		<li>Viseral leishmaniasis enfeksiyon modelleri için dalak ve birden fazla karaciğer lobu toplamayı planlayın. Yağ dokusu gibi ek doku bölgelerinin toplanması da ilgi çekici olabilir. DİkKAT: Enfekte hayvanlardan alınan numuneler uygun, kurumsal olarak onaylanmış biyogüvenlik protokolü kapsamında ele alınmalıdır. Bu genellikle kişisel koruyucu ekipman (KKD) gereksinimlerini ve sadece tüplerin açılmasını ve biyogüvenlik kabini içinde numunelerin toplanacağını (sınıf II, tip A2) içerecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Homojenizasyon için etiket ve tartım tüpleri.<ol>
<li>Mevcut homojenizasyon sistemine uygun tüp tipini kullanın. Bir TissueLyser için 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanın.</li>
		<li>Kurumsal IACUC tarafından onaylandığı gibi veya IACUC onaylı protokole göre isoflurane aşırı doz kullanarak istenen enfeksiyon zaman noktalarında fareleri ötenazi.</li>
		<li>Bölüm dokusu sistematik olarak planlandığı gibi, tüp başına bir bölüm ile.</li>
		<li>Numune toplama ekipmanlarını ekstraksiyon çözücülü numuneler arasında yıkamayı unutmayın (bu protokolde% 50 metanol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüp kapağını açık tutun, dondurma örneklerini sıvı nitrojene hemen tutturun. DİkKAT: Tüpe giren herhangi bir sıvı azot, azot genişledikçe tüplerin patlamasını önlemek için tamamen buharlaşana kadar tüpleri kapatmayın. Cildin sıvı nitrojenle temas etmediğine emin olmak için yeterli adımları atın (tüpleri tutmak için kriyo eldivenleri ve tokmaklar kullanın). Güvenlik yüz siperliği takın.</li>
	<li>İstenilen tüm numuneler toplanana kadar tüpleri kuru buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>Duraklatma noktası: numuneleri ekstraksiyon yapmaya hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Doku numune ağırlığını belirlemek için tüpleri tartın. Elektronik tabloya kaydetme.<ol>
<li>Tartım işlemi sırasında numuneleri donmuş tutun: tüpleri kuru buzda tutun, hızla tartın, hemen kuru buza geri koyun. Tartım yaparken numunelerin çözülmesine izin vermeyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Metabolit ekstraksiyonu
NOT: Boyunca sadece LC-MS sınıfı sıvılar ve reaktifler kullanılmalıdır. Bu yöntem Reference20'den uyarlanmıştır.
<ol><li>Özel cam eşyalar kullanarak 1 L cam şişelerde tüm ekstraksiyon çözücülerini (LC-MS sınıfı H2O, LC-MS sınıfı metanol, 4 μM sülfalorpirilazin, LC-MS sınıfı diklorometan ile çivilenmiş) hazırlayın. NOT: Hazırlanacak hacim numune ağırlıklarına göre hesaplanmalıdır, 50 mg numune başına 500 μL su, 50 mg numune başına 4 μM sülfalorpiridazin ve 1.000 μL önsezili dikloromethane ile çivilenmiş 500 μL metanol: metanol, 50 mg numune başına 2 μM sülfalorpyridazine ile çivilenmiştir, pipetleme yanlışlığına izin vermek için hesaplanan hacmi % 10 artırmak. Ekstraksiyon çözücüsüyü en az bir gecede 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Aşağıda belirtilen adımlara göre doku örneklerinin su bazlı homojenizasyonunu gerçekleştirin.<ol>
<li>Boncuk dağıtıcısı kullanarak doku örnekleri içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinin her birine bir adet 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu). Tüpleri buzda tut.</li>
		<li>Tüm adımlardan geçecek ve bir ekstraksiyon boş olarak hizmet edecek LC-MS sınıfı H2O içeren bir boş tüp yapın. Numune ekstraksiyonlarından ortalama H2O hacmini kullanın. Donmuş doku örneklerine soğutulmuş LC-MS sınıfı H2O ekleyin.<ol>
<li>Adım 1.7'de hesaplanan numune ağırlıklarını kullanarak 500 μL su / 50 mg numune ekleyerek doku ağırlığına su hacmini normalleştirin. DİkKAT: Biyolojik tehlike numunelerinin işlenmesi durumunda, uygun, kurumsal olarak onaylanmış biyogüvenlik protokolünü takip etmeye devam edin. Bu genellikle kişisel koruyucu ekipman (KKD) ve sadece biyogüvenlik kabininin içindeki (sınıf II, tip A2) tüpleri açma gereksinimlerini içerecektir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Örnekleri bir doku homojenizatör kullanarak 3 dakika boyunca 25 Hz hızında homojenize edin (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>İşleme sırasında reaktiflerin dökülmesini önlemek için tüpleri sıkıca kapatın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>DNA ekstraksiyonu, qPCR, protein bazlı analizler veya diğer analizler için homojenizasyon hacminin yaklaşık 1/10'u toplayın (istenirse). DNA ekstraksiyon deneyleri farklı bir günde yapılacaksa, -80 °C'de 6 aya kadar bir mikrosantrifüj tüpünde veya 96 kuyu plakasında (toplanan hacme bağlı olarak) saklayın. Daha uzun depolama süreleri mümkün olabilir, ancak test edilmiş olmayabilir.<ol>
<li>Referans13'te açıklandığı gibi dokulardan memeli DNA ekstraksiyonu için herhangi bir standart ticari kit kullanarak DNA ekstraksiyonları gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). DNA verimini ölçün ve çıkarılan DNA'yı -20 °C'de saklayın. qPCR için kabul edilebilir DNA miktarı ve kalitesi 3 yıl sonrasına kadar bile gözlenmiştir. NOT: Bu adım metabolit ekstraksiyonundan sonraki bir günde dondurulmuş homojenat üzerinde gerçekleştirilebilir.</li>
			<li>180 ng ayıklanmış DNA kullanarak Referans13'te açıklandığı gibi qPCR gerçekleştirin. NOT: Bu, önceki gün toplanan ve -20 °C'de dondurulan DNA üzerinde yapılabilir.<ol>
<li>T. cruzi enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda, aşağıdaki astarları kullanın: parazit seviyelerini ölçmek için ASTCGGCTGATCGTTTTCGA ve AATTCCTCCAAGCAGCGGATA21 ve DNA seviyelerine ev sahipliği yapmak için normalleştirmek için aşağıdaki astarlar: TCCCTCATCAGTTTATGGCCCA ve CAGCAAGCATCTATGCACTACCCC22 (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Önerilen qPCR döngüleri aşağıdaki gibidir: 10 dakika boyunca 95 °C'de denature; 30 s için 95 °C'de 40 döngü ve ardından 60 s için 58 °C ve son olarak 60 s için 72 °C döngü gerçekleştirin. Mevcut termosikleyici için uygun şekilde erime eğrisi analizi yapın. Örnekleme bölgeleri arasında göreli parazit yükü elde etmek için ΔΔCt method23'ü kullanarak verileri işleyin. Mutlak niceleme, örnek türetilmiş ΔΔCt değerlerinin bilinen parazit miktarlarından oluşturulan, enfekte olmayan doku örneklerine çivilenen ve 2.2 ila 2.2.4.1 adımlarında olduğu gibi çıkarılan standart bir eğri ile karşılaştırılarak elde edilebilir.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Depolanan homojenasyonda Reference13'te açıklandığı gibi çok katlı sitokin kitleri veya standart ticari ELISA kitleri (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak bağışıklık yanıtlarının protein bazlı karakterizasyonunu gerçekleştirin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Metabolit ekstraksiyonu için homojenizasyon hacminin 500 μL'lik kısmının en az yarısını kaydedin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sulu metabolit ekstraksiyonu gerçekleştirin. NOT: Solvent seçimi, ilgi çekici metabolitlerin kimyasal özelliklerine göre uyarlanabilir.<ol>
<li>Suda 2 μM sülfalorpiridazin ile% 50 metanol nihai konsantrasyonu elde etmek için homojenat içine 4 μM sülfalorpirilazin çivilenmiş buz gibi LC-MS sınıfı metanol ekleyin. DİkKAT: Metanol yanıcı ve tehlikelidir. Duman kaputunun veya biyogüvenlik kabininin içinde kullanım dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini kullanın.</li>
		<li>Örnekleri 3 dakika boyunca 25 Hz hızında bir doku homojenizatörinde homojenize edin. 10 dakika boyunca 4 °C'de 16.000 x g'da santrifüj örnekleri.</li>
		<li>96 kuyu plakasına eşit miktarda süpernatant toplayın. Tüm numunelerde birleştirilen en küçük metanol + su hacmine uyacak hacmi seçin. Bu sulu bir kesir.<ol>
<li>Kalan sulu homojen süpernatantı yedek olarak -80 °C'de bir kenara koyun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Süpernatantları toplarken katı kalıntıyı buzda tutun.</li>
		<li>Sulu ekstraksiyon süpernatant kuruyana kadar kurutun (~ 3 saat veya gece). Maksimum hız kullanın ve ısıtma yok.</li>
		<li>Kurutulmuş 96 kuyu plakasını -80 °C'de dondurun.</li>
	</ol></li>
	<li>Organik metabolit ekstraksiyonu gerçekleştirin. NOT: Solvent seçimi, ilgi çekici metabolitlerin kimyasal özelliklerine göre uyarlanabilir.<ol>
<li>Ön-önsezili diklorometan örneğinin 50 mg'ı başına 1.000 μL ekleyin: metanol, 2.3.4 adımından katı kalıntıya 2 μM sülfalorpiridin ile çivilenmiştir. DİkKAT: Çözücüleri işlerken, iyi bir debiye sahip bir duman davlumbazın içinde kullanım da dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini kullanın.</li>
		<li>Örnekleri 5 dakika boyunca 25 Hz hızında bir doku homojenizatörinde homojenize edin. Numuneleri 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.</li>
		<li>96 kuyu plakasına eşit miktarda süpernatant toplayın. En küçük dikloromethane hacmine uyacak hacmi seçin: tüm örneklerde metanol. Bu organik fraksiyon.</li>
		<li>Peleti yedek olarak -80 °C'de saklayın. Kalan organik özü yedek olarak -80 °C'de saklayın. Organik özü bir gecede duman kaputunda havayla kurulayın.</li>
		<li>Kurutulmuş 96 kuyu plakasını -80 °C'de dondurun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS veri toplama
<ol><li>Sulu ve organik özleri% 50 metanol + 2 μM sülfadimethoxine'in her biri 60 μL'ye yeniden atın ve birleştirin. 10 dakika için sonicate; ardından, 10 dakika santrifüj ve süpernatantı temiz bir 96 kuyu plakasına aktarın. Bölge içermeyen plaka contası ile kapatın ve plakayı bir LC otomatik örnekleyiciye yerleştirin. DİkKAT: Çözücüleri işlerken, iyi bir debiye sahip bir duman davlumbazın içinde kullanım da dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini kullanın.</li>
	<li>Uygun mobil aşamaları LC sistemine bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Pozitif mod ters fazlı LC için yazarlar, mobil faz A ve LC-MS sınıfı asetonitril olarak LC-MS sınıfı H2O + %0,1 formik asit + 0,5 mL/dk debi ve 7,5 dk LC gradyanı ile mobil faz B olarak %0,1 formik asit önermektedir. Önerilen degrade adımları Referans6'da</li><li><li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><li> <ol><li><li></ol></li><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li></ol></li><li> <ol><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li><li><ol><li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li> </li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li> </li><li></li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li><li></li><li></li><li><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63255/63255eq01.jpg"></li></ol>

Rapor etmek için çıkar çatışması yok.

Tripozomatid enfeksiyonlarını anlamak, yeni ilaç geliştirme ve tedavi yaklaşımlarına rehberlik etmek için gereklidir. Bu kimyasal kartografi yöntemi, metabolizma ve tripozomatid hastalığı patogenez arasındaki ilişki hakkında eyleme dönüştürülebilir içgörüler sağlamak ve böylece bu çevirisel ihtiyacı gidermek için benzersiz bir şekilde hazırlanmıştır.
Arka plan kontaminasyonini hafifletmek için metabolit ekstraksiyonu ve MS analizleri sırasında sadece LC-MS sınıfı çözücüler önerilir. Genellikle parafin filmi ve/veya diğer plastiklerden elde edilen polimerik kontaminasyon35'ten mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Özellikle parafilm asla kullanılmamalıdır. LC-MS veri kalitesi numune hazırlama ve metabolit ekstraksiyonu sırasında kullanılan malzemelere bağlı olduğundan bu hususlar çok önemlidir. 'ili çizimleri oluşturulmadan önce veri kalitesi sağlanmalıdır. Ek olarak, bu kapsamlı uzamsal metabolomik haritaların oluşturulması, tüm bitişik doku örneklerinin toplanmasını ve bu haritalardaki boşlukları önlemek için toplanan tüm örneklerden metabolit ekstraksiyonu gerektirir. Toplama prosedürleri, metabolit ekstraksiyon lojistiği ve LC-MS analizi ve maliyetler bu şekilde düşünülmeli ve buna göre planlanmalıdır.
Bu iletişim kuralı, kullanıcı gereksinimlerini birden çok şekilde karşılayacak şekilde değiştirilebilir. Örneğin, metabolit ekstraksiyonu sırasında kullanılan çözücülerin polaritesi ve çözünürlüğü, metabolitlerin tespit edildiği şeyi etkileyecektir39. Hedefsiz kimyasal kartografi analizleri için tespit edilen metabolit özelliklerinin çeşitliliğini en üst düzeye çıkarmak için, birden fazla ekstraksiyon adımı ve çözücülerin birleştirilmesi önerilir. Örneğin, bu yöntem dikloromethane, metanol ve suyu ekstraksiyon çözücüleri olarak kullanır, çünkü kutupsal olmayan ve kutup moleküllerinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar20,40. Bununla birlikte, bu çözücüler her MS deneyi için evrensel olarak uygun değildir ve araştırmacılar projelerinin hedeflerine göre ekstraksiyon çözücüleri seçmelidir. Aynı şekilde, ters faz kromatografisini normal faz kromatografisi ile değiştirmek gibi farklı LC-MS/MS koşulları kullanılabilir. Alternatif sütunlar, C8 kromatografisi yerine ters fazlı veri toplama için de kullanılabilir, ancak ampirik olarak, C8 kromatografisi doku lipitlerine karşı daha sağlamdır ve daha düşük tıkanma sıklığına sahiptir. Kavramsal olarak, bu protokoller gaz kromatografisi-kütle spektrometresi gibi diğer kütle spektrometresi yöntemlerine de uygulanabilir.
Alternatif bir yaklaşım kütle spektrometresi görüntülemedir. Nitekim, kütle spektrometresi görüntüleme yaklaşımlarının aksine, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi doğal olarak mekansal bilgileri korumaz10. Kimyasal kartografi yaklaşımları, proje kavramsallaştırması anında, örnek meta verilerde ve veri işleme adımlarında örnekleme konumunu dahil ederek bu boşluğu kapatır. Bu kimyasal kartografi yaklaşımının bir gücü, kütle spektrometresi görüntülemenin aksine, uygulamaların büyük kısmının yalnızca ek açıklama için doğru kütleye dayandığı kütle spektrometresi görüntülemenin aksine, kendinden emin ek açıklamalar (Metabolomics Standards Initiative seviye 1 veya seviye 2 ek açıklama güveni41) sağlama yeteneğidir. Kütle spektrometresi görüntüleme, ince taneli uzamsal haritalamayı mümkün kılacak, bazen tek hücre seviyesine kadar, örneğin,42,43. Buna karşılık, kimyasal kartografi yaklaşımları, son derece uzmanlaşmış tam hayvan kriyoseksiyon becerileri gerektirmeden metabolit dağılımının büyük ölçekli çapraz organ haritalanmasını sağlar. Kimyasal kartografi, 'fenotip'45'e en yakın 'omik tabakasına' odaklanma avantajı ile 44 gibi geliştirilmekte olan birçok mekansal transkriptomik yaklaşıma tamamlayıcı kanıt sağlar. Parazit yükü ölçümü için alternatif yöntemler arasında numune toplama anında biyolüminesansı ölçmek yer almaktadır6. Konfokal veya elektron mikroskopisi ile lokalize parazit yükünü ve doku hasarlarını değerlendirmek için ince segmentler de toplanabilir. Bu protokolde ve önceki yayınlarda sitokin nicelemesi için kullanılan su homojenatı, doku hasarının protein bazlı belirteçlerini ölçmek için de kullanılabilir.
Elde edilen LC-MS verilerini çizmeye uygun 3D modeller elde etmenin birden fazla yolu da vardır. Burada önerilen yönteme ek olarak, modeller çeşitli çevrimiçi satıcılardan önceden yapılmış olarak satın alınabilir. Kullanım koşullarının, özellikle yayınla ilgili olarak amaçlanan kullanımla eşleştiğından emin olun. Büyük organlar için modeller, tarayıcı talimatlarına göre 3D tarayıcılar kullanılarak de novo üretilebilir. Matlab gibi alternatifler kimyasal kartografi46 için 3D modeller üretmek ve görselleştirmek için mevcuttur, ancak bunlar öncelikle 'ili16' geliştirilmeden önce uygulanmıştır. MATLAB, birçok alanda çok çeşitli uygulamalar sunan bir veri analizi ve programlama araç paketidir. Bununla birlikte, MATLAB ne özgür ne de açık kaynaklıdır ve matlab'ın kütle spektrometresi verilerini işlemek için geliştirilmediği düşünüldüğünde MATLAB arayüzlerine aşinalık gerektirir. Bu önerilen yöntemin alternatifleri, yani SketchUp, Meshlab ve 'ili, serbestçe erişilebilir, kullanıcı dostudur ve kimyasal kartografi amacıyla MATLAB ile benzer işlevler sunar.
Bu yöntem numune hazırlama ve metabolit ekstraksiyonu ile ilgili sağlamdır. Sorun giderme en sık LC-MS veri toplama adımında gereklidir. Bu, bu makalenin kapsamı dışındadır. Okuyucular, 20,47 de dahil olmak üzere LC-MS veri toplama sorun giderme konusunda mükemmel yayınlara yönlendirilir. Aynı şekilde, metabolit ek açıklamanın karmaşıklıkları, bu yöntemin 3D model üretimine odaklanmasının kapsamı dışındadır. Bu konudaki yararlı referanslar arasında 24.25.48.49 bulunur.
Bu yöntem hastalık patogenezini etkili bir şekilde araştırırken, bazıları herhangi bir metabolomik deneyde yaygın olan bu yaklaşımın sınırlamaları vardır. Bu sınırlamalardan biri, referans spektral kütüphanelerin kullanılabilirliğine ve kalitesine bağlı olarak LC-MS özellikleri50'nin düşük ek açıklama oranıdır. Diğer bir sınırlama, bu protokolün RNAlater gibi RNA koruma reaktiflerinin LC-MS/MS analizi ile uyumsuzluğu nedeniyle mRNA'yı korumamasıdır. Bununla birlikte, protein kalitesi aşağı akış analizleri için yeterlidir ve bu nedenle mRNA tabanlı analizlerin yerini alabilir.
Enfeksiyon patogenezine kimyasal kartografi yaklaşımı, organ sistemlerinde bakteriyel, viral veya parazitik enfeksiyonların nasıl geliştiğini ve lokalize hastalığa neden olduğunu doğrudan yansıtır. Bu bölgesel alt örneklemelerin analizi ve 3D modellerin üretilmesi, metabolitlerin üç boyutlu uzayda nasıl çalıştığını ve moleküler biyolojinin daha önce tanınmayan bu mekansal boyutlarına ışık tutturmaktadır. Bu protokol kullanılarak, örneğin metabolit lokalizasyonu Trypanosoma cruzi parazit yükü ile karşılaştırıldı. Sonuçlar patojen ve konak doku arasındaki ilişkiyi netleştirdi ve ayrıca Chagas hastalığı semptom ilerlemesinin metabolik dinamiklerini gösterdi6. kimyasal kartografi yöntemleri, insan yapımı çevre etkileşimi51,52,53, insan derisi46 ve akciğerler gibi organ sistemlerinin kimyasal makyajı54, bitki metabolizması ve çevre etkileşimleri55 gibi çeşitli konulara da uygulanmıştır. Gelecekteki uygulamalar lokalize hastalık toleransı ve dayanıklılığının veya tripozomatid enfeksiyon dışındaki modellerde lokal metabolit düzeyleri, patojen tropizmi ve hastalık tromizmi arasındaki ilişkinin değerlendirilmesini içerebilir. Bu yaklaşım ayrıca mevcut farmakokinetik protokolleri genişletmek, yerel doku ilaç seviyeleri ve ilaç metabolizması arasındaki ilişkiyi genel metabolik bağlam, doku hasarı ve patojen temizliği ile değerlendirmek için geniş bir uygulanabilirliğe sahip olmalıdır. Genel olarak, kimyasal kartografi, hastalık patogenez, insan sağlığı, insan-çevre etkileşimleri ve mikrobiyal dinamikler gibi uygulamalarla çeşitli örnek türlerinde metabolit dağılımlarının benzersiz keşiflerine izin verir.

Tripozosmatid parazitleri Leishmania türleri, Afrika tripanozomları (Trypanosoma brucei) ve Amerikan tripanozomlarından (Trypanosoma cruzi) oluşur. Leishmania protozoa, kendi kendini iyileştiren ve kendini sınırlayan lokalize kutanöz leishmaniasis, ağız, burun ve boğazın mukozal dokularının zarar gördüğü mukokütanöz leishmaniasis ve ateş ve hepatosplenomegaly'ye neden olan visseral organlarda parazit tromizmi ile visseral leishmaniasis içeren leishmaniasis'e neden olur1,2. T. brucei, çoğunlukla Afrika ülkelerinde bildirilen uyku hastalığı olarak da bilinen İnsan Afrika tripanosomiasisine (HAT) neden olur3. Klinik belirti ve semptomlar hepatatosplenomegali, ateş, baş ağrısı, kas-iskelet sistemi ağrıları, lenfadenopatiler ve parazitlerin kan dolaşımına ve lenfatiklere lokalize olduğu hemo-lenfatik evrede anemiyi içerir. Bunu, parazitlerin merkezi sinir sistemine lokalize olduğu ve uyku bozukluğuna, davranış değişikliğine ve sonunda ölümcül komaya neden olduğu meningo-ensefalitik aşama takip eder4. T. cruzi, Amerika'da endemik olan Chagas hastalığına neden olur. Enfekte bireyler, genellikle asemptomatik, geniş parazit tromizmi ile ilk akut aşamayı yaşarlar. Enfekte bireylerin yaklaşık% 10-30'u, megaofagus, megakolon ve kardiyovasküler komplikasyonlarla karakterize edilen onlarca yıllık enfeksiyondan sonra kronik evre semptomları yaşar5,6.
Metabolomik, birincil veya ikincil metabolizmadan biyolojik bileşikler ve ilaçlar veya gıda kaynaklı moleküller gibi dışarıdan türetilmiş bileşikler de dahil olmak üzere küçük moleküler türleri (50-1.500 Da) inceler. Konak-patojen etkileşimleri bağlamında, metabolomik, patojenin konak üzerindeki etkisine erişimde çok önemli olan enfeksiyonun konak metabolit ortamları üzerindeki etkisini araştırabilir. Ayrıca konak beslenme ve immünolojik ortama patojen adaptasyonlarını değerlendirebilir7,8,9. Kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi metabolitleri tanımlamak, ölçmek ve karakterize etmek için kullanılan yaygın metabolomik araçlardır. Bu "omiks" yaklaşımı biyobelirteç keşfi ve ilaç geliştirme10,11 için de uygulanabilir.
Tripozomatid parazitlerin spesifik doku trompisi göz önüne alındığında, mekansal metabolomik analizler neden oldukları hastalıkların patogenezine dair önemli bir içgörü sağlayabilir. Metabolitlerin mekansal dağılımının haritalandırılması, fare kalp dokusunda kronik Tripanosoma cruzi enfeksiyonundan ve fare gastrointestinal sisteminde akut ve uzun süreli Tripanosoma cruzi enfeksiyonundan lokal olarak etkilenen metabolitleri ortaya çıkardı6,12,13. Özellikle, 3D kimyasal kartografi, kronik olarak Tripanosoma cruzi enfekte farelerin kalp dokusunda parazit kalıcılığı ve metabolik değişiklikler arasında bir kopukluk olduğunu göstermiştir. Metabolizma en çok kalbin alt ve apikal segmentlerinde, Chagas hastalığı semptomları (kardiyak apikal anevrizmalar) ile eşleşerek pertüre edildi. Belirli kardiyak bölgelerde enfeksiyondan etkilenen ve hastalık şiddeti ile ilişkili metabolit aileler arasında acylcarnitines ve gliserofosfokolinler12,13,14 sayıldı. Gastrointestinal sistemde, kalıcı metabolik değişiklikler Chagas hastalığı semptomlarının yerleriyle aynı anda gelir: yemek borusu ve kolon. Buna karşılık, metabolizma ince bağırsak gibi Chagas hastalığı semptomlarıyla ilişkili olmayan yerlerde yeniden normalleştirilir. Gastrointestinal sistemde enfeksiyon nedeniyle lokal olarak rahatsız edilen metabolitler arasında acylcarnitines, gliserofosfokolinler, kynurenine, triptofan ve korlik asit bulunur. Ek olarak, bu analizler Chagas hastalığına karşı yeni bir metabolik tolerans mekanizmasının tanımlanmasını sağladı6. Bu yöntemlerin cutaneöz leishmaniasis çalışmasına uygulanması, lezyon bölgesinde önemli metabolik pertürbasyonlar, aynı zamanda lezyona bitişik, makroskopik olarak sağlıklı dokuda spesifik metabolik değişiklikler ortaya koydu. Örneğin, lezyon bölgesinde glutamin tükenirken, m/z'deki glisefosfosfokolinler (kütle-yük oranı) 200-299, 400-499, 500-599 ve 600-699 lezyon bölgesinde önemli ölçüde artmıştır. PC (O-34:1) sadece lezyona bitişik sitelerde arttırıldı15.
Bu makalenin amacı, tripozomatiid parazit enfeksiyonu modellerine uygulandığı gibi metabolit dağılımının 3D modellerini ("kimyasal kartografi") oluşturmak için gerekli adımları göstermektir (Şekil 1). Bu yaklaşım, metabolomics ve metabolomics veri işleme bağlamında birkaç kritik ilerlemeye, özellikle de metabolomics verilerini kolayca 3D modellere çizmek için 'ili yazılımının geliştirilmesine' dayanmaktadır16.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Eppendorf tüpleri</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi</td></tr><tr><td>1 L şişe, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi</td></tr><tr><td>1 L dereceli silindir, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi</td></tr><tr><td>2 mL SafeLock Eppendorf tüpleri</td><td>VWR</td><td>20901-540</td>, <td>mevcut doku homojenizatörü</td></tr> <tr><td>için uygun tüp modelini kullanır3D model (protokol adımlarına göre de-novo oluşturulur veya satın alınır)</td><td>İncelenen sistem için uygun olarak</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>5 mm paslanmaz çelik boncuk</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA astar</td><td>NA</td><td>NA</td><td>mevcut olduğu gibi herhangi bir marka; Piron, M. ve ark. Kan örneklerinde Trypanosoma cruzi tespiti için gerçek zamanlı bir PCR testinin geliştirilmesi. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>analitik terazi</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td><td>NA</td><td>NA herhangi</td><td>bir marka, mevcut olduğu gibi; Piron, M. ve ark. Kan örneklerinde Trypanosoma cruzi tespiti için gerçek zamanlı bir PCR testinin geliştirilmesi. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash; 200 (2007).</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj, falcon tüpü ve 96 kuyulu plaka kapasiteli tezgah üstü santrifüj</td><td>NA</td><td>NA mevcut</td> biyogüvenlik kabini <td>olarak herhangi bir marka</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>sınıf</td><td>II, tip A2; mevcut olduğu gibi herhangi bir marka</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC astar</td><td>NA</td><td>NA mevcut</td><td>olduğu gibi herhangi bir marka; Cummings, K.L., Tarleton, R.L.'de yayınlandı. Konak dokuda Trypanosoma cruzi 'nin hızlı kantitasyonu gerçek zamanlı PCR. Moleküler ve biyokimyasal parazitoloji. 129 (1), 53&ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>kamera</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi. Bu protokol için bir cep telefonu kamerası yeterlidir</td></tr><tr><td>kemilüminesan özellikli görüntüleme sistemi</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir sistem, mevcut</td></tr><tr><td>pamuk topları</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut</td></tr><tr><td>kriyoeldiven</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>herhangi bir marka ile değiştirin, mevcut</td></tr><tr><td>diseksiyon makası</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut kuru</td></tr><tr><td>buz</td><td>NA olarak</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olarak</td></tr><tr><td>ekstra uzunluk forseps</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olarak</td></tr><tr><td>yanıcı sınıf buzdolabı</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mikrosantrifüj</td></tr><tr><td>tüpleri için mevcut dondurucu saklama kutuları</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olarak</td></tr><tr><td>çeker ocak</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut</td></tr><tr><td>yüksek çözünürlüklü kütle olarak spektrometre</td><td>NA</td><td>NA</td><td>, ThermoFisher Q-Exactive Plus (katalog numarası 0726030) gibi herhangi bir marka, buz</td></tr> <tr><td>kovası</td><td>NA</td><td>NA herhangi</td><td>bir marka, mevcut ili</td></tr><tr><td>yazılımı</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td>,</tr><tr><td>isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr>, <tr><td>büyük tupperware</td>, <td>NA</td><td>NA herhangi</td><td>bir marka, mevcut olduğu gibi; rahatça içerebilecek kadar büyük fare, pamuk topu</td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı asetonitril</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı dikolorometan</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı formik asit</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı metanol</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı su</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>sıvı kromatografi kolonu</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>, ilgilenilen metabolitlere uygun şekilde diğer marka ve modellere değiştirilebilir</td></tr>; <tr><td>sıvı kromatografisi kolon koruyucu kartuşu</td>, <td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>, ilgilenilen metabolitlere uygun olarak diğer marka ve modellerle değiştirilebilir;</td></tr><tr><td>sıvı kromatografisi, kolon koruyucu, kartuş tutucu,</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>ilgilenilen metabolitler için uygun olan diğer marka ve modellere değiştirilebilir</td></tr><tr><td>sıvı nitrojen</td><td>NA</td><td>NA mevcut</td><td>olduğu gibi herhangi bir marka</td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>MeshLab yazılımı</td><td>https://www.meshlab.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer yazılımı</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS kalibrant</td><td>NA</td><td>NA</td>, <td>mevcut cihaz için uygun olanı</td></tr><tr>,<td>MS veri işleme yazılımı</td>, <td>NA</td><td>NA</td><td>, çoklu seçenekler mevcuttur; yazarlar MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert yazılımını</td><td>önermektedir http://proteowizard.sourceforge.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>, ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W,</td><td>diğer nanodrop modelleri de uygundur</td></tr>: <tr><td>p1000 pipet uçları</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Mevcut pipetleyicilere uyacak uygun markayı kullanın</td></tr><tr><td>p1000 pipetatör</td><td>NA</td><td>NA</td> mevcut <td></td></tr><tr><td>p20 pipet uçları</td><td>gibi</td> herhangi bir marka NA <td>NA</td><td>mevcut pipetleyicilere uyacak uygun markayı kullanın</td></tr><tr><td>p20 pipetleyici</td><td>NA</td><td>NA</td><td>mevcut olduğu gibi herhangi bir marka</td></tr><tr><td>p200 pipet uçları</td><td>NA</td><td>NA</td><td>mevcut pipetatörlere uyacak uygun markayı kullanın</td></tr><tr><td>p200 pipetör</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut</td></tr><tr><td>kişisel koruyucu ekipman olarak (eldiven, laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük/gözlük; yüz siperi)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi</td></tr><tr><td>Q-Plex Fare Sitokini - Ekran (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>, diğer ticari sitokin ELISA kitleri gibi diğer protein bazlı sitokin testleriyle değiştirilebilir</td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Plus Kiti (200 hazırlık)</td><td>Zymo</td><td>D4069</td>, mevcut gerçek zamanlı termosikler NA NA herhangi bir marka, mevcut tuzluk veya çay demlik NA NA herhangi bir marka <td>olarak, herhangi bir marka memeli DNA ekstraksiyon kiti ile değiştirin</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>; izofluran ile ıslatılmış pamuk topu içermek ve fare derisi ile teması önlemek için</td></tr><tr><td>SketchUp yazılımı</td><td>https://www.sketchup.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>örneği forseps</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka,</td></tr><tr><td>mikrosantrifüj tüplü ve 96 kuyulu plaka kapasiteli speedvac</td><td></td> olarak <td></td><td>herhangi bir marka NA NA, mevcut</td></tr><tr><td>elektronik tablo yazılımı</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td>, <td>uygun olduğu gibi diğer elektronik tablo yönetim yazılımlarıyla değiştirilebilir, uygun olduğu gibi</td></tr><tr><td>sülfalopiridazin</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>sülfadimetoksin</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr yeşil qPCR reaksiyon karışımı</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>, istenildiği gibi diğer Sybr yeşil qPCR reaksiyon karışımları ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA astar</td><td>NA</td><td>NA herhangi bir</td><td>marka, mevcut olduğu gibi; Cummings, K.L., Tarleton, R.L.'de yayınlandı. Gerçek zamanlı PCR ile konak dokuda Trypanosoma cruzi 'nin hızlı kantitasyonu. Moleküler ve biyokimyasal parazitoloji. 129 (1), 53&ndash; 59 (2003).</td></tr><tr><td>doku homojenizatörü</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olduğu gibi; örneğin, Qiagen TissueLyser II, katalog numarası 85300, TissueLyser Adaptör Seti ile (2 x 24), katalog numarası 69982</td></tr><tr><td>doku örnekleri</td><td>NA</td><td>Uygun</td><td>enfeksiyon modelinden</td></tr><tr><td>NA NA TissueLyser tek boncuklu dağıtıcı</td><td>Qiagen</td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ThermoFisher Vanquish (katalog numarası IQLAAAGABHFAPUMBHV) gibi mevcut olan herhangi bir marka,</td></tr> <tr><td>ultra düşük sıcaklıklı dondurucu (-80)</td> <td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut ultrasonik</td></tr><tr><td>banyo</td><td>NA</td><td></td><td>NA herhangi bir sistem, mevcut ıslak</td></tr><tr><td>buz</td><td>NA</td><td>NA</td><td>herhangi bir marka, mevcut olarak</td></tr><tr><td>bölgesiz sızdırmazlık filmi</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

tripozomatid enfeksiyonunu İncelemek için kimyasal kartografi yaklaşımları

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Patojen tromizmi ve hastalık tromizmi, patojenler tarafından seçici olarak kolonize edilen veya hasar gören doku konumlarını ifade eder ve lokalize hastalık semptomlarına yol açmaktadır. İnsan-enfektif tripozomatid parazitleri Arasında Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi ; Uyku hastalığının etken maddesi olan tripanosoma brucei ; ve Leishmania türleri, leishmaniasis'in etken ajanları. Ortaklaşa, dünya çapında 20 milyon insanı etkiliyorlar. Bu parazitler spesifik tropizm gösterir: kalp, yemek borusu, T. cruzi için kolon, yağ dokusu, pankreas, cilt, dolaşım sistemi ve T. brucei için merkezi sinir sistemi, dermotropik Leishmania suşları için cilt ve visserotropik Leishmania suşları için karaciğer, dalak ve kemik iliği. Bu nedenle tripozosatomatid hastalığı patogenezini anlamak için mekansal bir bakış açısı gereklidir. Kimyasal kartografi, mikrobiyolojik ve immünolojik parametrelere kıyasla sıvı kromatografi-kütle spektrometresi yoluyla üretilen küçük molekül bolluğunun 3D görselleştirmelerini oluşturur. Bu protokol, sistematik doku örnekleme ve metabolit ekstraksiyonundan başlayarak, sistematik doku örneklemesi ve metabolit ekstraksiyonundan başlayarak, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi veri toplama ve metabolit dağılımının 3D haritalarının üretilmesiyle sonuçlanan tripozomatid enfeksiyonu sırasında patojenik süreçleri incelemek için kimyasal kartografinin nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, T. cruzi, T. brucei veya Leishmania tarafından doku kolonizasyonu için besin gereksinimleri, enfeksiyon bölgelerinde immünomabolizm ve lokal doku metabolik pertürbasyon ve klinik hastalık semptomları arasındaki ilişki gibi birden fazla araştırma sorusu için kullanılabilir ve tripozomatid hastalığı patogenezine kapsamlı bir şekilde dair kapsamlı bir içgörüye yol açar.

Elde edilen metabolit özelliklerinin sayısı analiz edilen doku tipine ve veri işleme parametrelerine bağlıdır. Örneğin, bu protokol T. cruzi enfeksiyonunun gastrointestinal sistem metabolom üzerindeki mekansal etkisini T. cruzi enfeksiyonunun fare modelinde analiz etmek için kullanılmıştır. Daha önceki çalışmalarda erkek C3H/HeJ intraperitoneally olarak 1.000 CL + luc T. cruzi parazitleri ile enjekte edildi32,6. Hayvanlar enfeksiyondan 12 veya 89 gün sonra ötenaziye tabi tedavasyona tabi tedavasyon edildi ve bu protokolde açıklandığı gibi gastrointestinal sistemin 13 bitişik segmentinin kimyasal kartografi analizi yapıldı. Bu analiz, daha sonra bu protokolde açıklanan adımlar kullanılarak 3D olarak görselleştirilen 5.502 özellikli bir özellik tablosuna yol açtı. Bu yaklaşım, doku bölgeleri arasında diferansiyel dağılımı olan metabolitlerin (glutamin, Şekil 2C) ve ince ve kalın bağırsaklar arasında karşılaştırılabilir seviyelerde bulunan metabolit özelliklerinin yüksek parazit yükü (kynurenine, Şekil 2B ve parazit yükü, Şekil 2A) bölgesinde yüksek olan bireysel hayvanlarda metabolit özelliklerinin görselleştirilmesini sağlar (LPE 16:0 Şekil 2D ). Kynurenine, inflamasyonla bilinen ilişkisi ve kynurenine türevi metabolitlerin T. cruzi yükünü düzenleme yeteneğine ilişkin önceki yayınları nedeniyle görselleştirme için seçildi33. Rastgele orman tabanlı makine öğrenimi modelleri daha önce kynurenine düzeyleri ile enfeksiyon durumu arasında bir ilişki olduğunu ortaya ortaya koydu6. Glutamin, in vitro glutamin mevcudiyeti ile T. cruzi ilaç duyarlılığı arasında bir ilişki olduğunu gösteren önceki yayınlara dayanan bir görselleştirme için seçildi34. Diferansiyel dağılımı lojistik regresyon kullanılarak doğrulandı, s &lt; 0.05. LPE 16:0, doku bölgelerinde karşılaştırılabilir seviyelerde bulunan metabolit özelliklerini keşfetmek için verilerin görsel incelemesinden sonra seçildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> Şekil 1: Protokole genel bakış. Çizim BioRender.com ile oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> Şekil 2: Kimyasal kartografi analizi. Erkek C3H/HeJ farelerine intraperitoneal olarak 1.000 CL+luc T. cruzi paraziti enjekte edildi32. Hayvanlar enfeksiyondan 12 veya 89 gün sonra ötenaziye tabi tedavasyon edildi ve gastrointestinal sistem sistematik olarak toplandı ve bölümlere alındı (adım 1)6. Metabolitler adım 2'deki gibi ayıklandı ve LC-MS/MS tarafından analiz edildi.3D model üretimi SketchUp yazılımı (adım 5) kullanılarak gerçekleştirildi ve veriler 6. (A) Belirli bir farede parazit dağılımı, enfeksiyon sonrası 12 gün. (B) Kynurenine metabolit dağılımı aynı farede, enfeksiyon sonrası 12 gün. (C) Enfekte fareler arasında ortalama glutamin dağılımı, enfeksiyon sonrası 89 gün. (D) Karşılaştırılabilir m/z seviyeleri 454.292 tutma süresi 2.929 dk, 2-heksadecanoyl-sn-glisero-3-fosephoethanolamine (LPE 16:0), ince bağırsak ve kolonda A ve B ile aynı farede. Örnekler ve veriler in6 olarak oluşturulmuştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, örnek toplama, metabolit ekstraksiyonu, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi veri toplama, 3D model oluşturma ve son olarak veri görselleştirme dahil olmak üzere trypanosomatid enfeksiyonu sırasında metabolit dağılımının 3D modelini oluşturma adımlarını açıklar.

Tripozomatid Enfeksiyonunu İncelemek için Kimyasal Kartografi Yaklaşımları

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Bu protokol, metabolit ve parazit dağılımının 3D modellerini oluşturmak için kullanılabilir. Bu, lokal doku metabolik pertürbasyonu, parazit dağılımı ve klinik hastalık semptomları arasındaki ilişkiyi anlamada yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, patojen dağılımına karşı metabolit dağılımının canlı ölçekli organlar arası haritalanmasını ve istatistiksel analizini sağlamasıdır.Teorik olarak, kimyasal haritacılık, patogenezden sorumlu metabolitleri ve tedavinin etkilerini doğrudan inceleyerek hastalığın gelişimini ve konakçı üzerindeki etkisini araştırabilir. Tüpleri tartarak ve etiketleyerek başlayın. Dokuları sistematik olarak tüp başına bir bölüm ile kesitleyin.Numune ağırlığını belirlemek ve ağırlığı kaydetmek için doku örnekleri içeren tüpleri tartın. Doku numunelerinin su bazlı homojenizasyonunu gerçekleştirmek için, doku numuneleri içeren iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine bir adet beş milimetre paslanmaz çelik boncuk ekleyin. LCMS sınıfı su içeren boş bir tüp yapın.Soğutulmuş LCMS sınıfı su ekleyerek numunenin 50 miligramı başına 500 mikrolitreye kadar hacmi oluşturun, ardından numuneleri üç dakika boyunca 25 hertz'de homojenize edin. Numuneler iyice homojenize edilmelidir. DNA ekstraksiyonu ve diğer analizler için homojenizasyon hacminin 1 / 10'unu toplayın.Homojenata dört mikromolar sülfakloropiridazin ile çivilenmiş buz gibi soğuk LCMS sınıfı metanol ekleyin. Numuneleri bir doku homojenizatöründe 25 hertz'de üç dakika boyunca homojenize edin, ardından 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın. 96 kuyucuklu bir plakaya eşit miktarda süpernatant toplayın ve süpernatantları toplarken buz üzerinde katı kalıntı tutun.Sulu ekstraksiyon süpernatantını maksimum hız kullanarak ve ısıtma olmadan tamamen kurutun. 50 miligram katı kalıntı numunesi başına iki mikromolar sülfakloropiridazin ile çivilenmiş 1.000 mikrolitre önceden soğutulmuş diklorometan metanol ekleyerek organik ekstraksiyon gerçekleştirin. Numuneleri beş dakika boyunca 25 hertz'de homojenize edin, ardından 10 dakika boyunca santrifüjleme yapın.96 kuyucuklu bir plakaya eşit miktarda süpernatant toplayın. İlgilenilen organın fotoğrafını çekin. İlgilenilen organların bir resmini içe aktarmak için Dosya'ya ve ardından SketchUp yazılımında İçe Aktar'a tıklayın.Çizgiler aracına tıklayın ve serbest el seçeneğini seçin. İlgilenilen organların ana hatlarını izlemek ve çizmek için kalem aracını kullanın. İtme/çekme aracını seçin ve çizimi 2B'den 3B'ye dönüştürmek için gölgeli alanda yukarı çekin.Dosya Dışa Aktarma'ya ve ardından 3B modele tıklayarak dosyayı dae biçiminde dışa aktarın. Modelin gerçekçiliğini geliştirmek için Dosya'yı seçip Mesh'i İçe Aktar'a tıklayarak modeli MeshLab yazılımına aktarın. Üst menüden Tel Kafes'i seçin, ardından Filtreler'i seçin, Yeniden Örgüleme Basitleştirme ve Yeniden Yapılandırma'ya ve ardından Alt Bölüm Yüzeyleri Orta Noktası'na tıklayın.Tüm değerleri varsayılan olarak bırakın ve iki kez Uygula'yı seçin. Dosya'ya, ardından Mesh Farklı Dışa Aktar'a tıklayarak ve ardından dosya türü açılır menüsünden SDL Dosya Biçimi'ni seçerek modeli sdl biçiminde dışa aktarın. Bunu kaydedin ve bir sonraki açılır menüden Tamam'ı seçin.Meshmixer yazılımını açın ve önceki adımda oluşturulan sdl dosyasını içe aktarın. Yuvarlanması gereken model yüzeylerini çıkarmak için heykel, fırçalar, ejderha heykeli, fırçalar, şişirme araçlarını kullanın. Model istenen görünüme kavuştuğunda Dosya ve Dışa Aktar'a tıklayarak sdl formatında kaydedin.Dosyayı istediğiniz gibi adlandırın, SDL İkili Biçimi'ni seçin ve kaydedin. 3B modeli MeshLab yazılımında açın. Açık işlem sonrası açılır penceresinde Tamam'a tıklayın.Seçim noktaları aracını seçerek her örnekleme noktası için X, Y ve Z koordinatlarını elde edin ve ardından 3B model yüzeyinde düzenli aralıklarla sağ tıklayın. İstediğiniz tüm koordinatlar seçildikten sonra, form açılır penceresindeki en üstteki Kaydet düğmesine tıklayın. Elektronik tablo yazılımında, önceki adımda oluşturulan pp dosyasını açın.Veri Metni'ni Sütunlar'a, ardından Sınırla'ya tıklayarak veri görüntüsünü ayarlayın. İleri'ye tıklayın ve ardından Boşluk'u seçin ve Son'a tıklayın. Ana Sayfa Bul ve Değiştir'i seçerek elektronik tablo hücrelerinde yalnızca sayısal değerler kalacak şekilde yeniden biçimlendirin.Aranan kutusuna Y eşit kat girin ve değiştir kutusunu boş bırakın. Tümünü Değiştir'e ve ardından Tamam'a tıklayın. X eşit kat ve Z eşit kat ve kat eğik çizgi için daha büyük tekrarlayın. Elektronik tablo yazılım tablosunda, satırlar her konuma ve sütunlar verilere karşılık gelir.Uygun meta verileri ve metabolit özelliği bolluğunu sonraki e-tablo sütunlarına yapıştırın. Yarıçap sütununa, modelde görselleştirilecek örnekleme noktalarının istenen boyutunu girin. Yarıçap değerlerini ampirik olarak belirleyin ve dosyayı CSV biçiminde kaydedin.ELI Plot yazılımına gidin, Yüzey'i seçin, ardından oluşturulan 3B modeli tarayıcı penceresine sürükleyip bırakın. Oluşturulan özellik tablosunu aynı tarayıcı penceresine sürükleyip bırakın. İstediğiniz veri sütununu 3B modele yansıtmak için sağ alt köşedeki göstergeyi kullanın.Bu metabolit özelliğinin 3B modeldeki dağılımını değerlendirmek için her veri sütununu ardışık olarak seçin. Bu analiz, 5.502 özellikten oluşan bir tabloya ve bunların 3D olarak görselleştirilmesine yol açtı. Bu yaklaşım, yüksek parazit yükü bölgesinde yüksek olan bireysel hayvanlarda metabolit özelliklerinin, doku bölgeleri arasında diferansiyel dağılıma sahip metabolitlerin ve ince ve kalın bağırsaklarda karşılaştırılabilir seviyelerde bulunan metabolit özelliklerinin görselleştirilmesini sağlar.Sadece LCMS çözücülerini kullanmayı ve tüm bitişik dokuları toplamayı ve uzamsal haritalardaki boşlukları önlemek için toplanan tüm örnekler için metabolitleri çıkarmayı hatırlamak önemlidir. Bu teknik, 3D metabolit dağılım haritalarını enfeksiyon üzerine karşılaştırarak hastalık patogenezini anlamak için Tripanosomatid parazitler tarafından doku kolonizasyonu için besin gereksinimlerini araştırmak için kullanılabilir.

chemical-cartography-approaches-to-study-trypanosomatid-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

İn vitro olarak yetiştirilen Afrika tripanozomları, düşük bir oranda antijenik varyasyona uğrar, öyle ki popülasyonlar, baskın bir varyant yüzey glikoprotein (VSG) tipini ifade eden parazitlerden ve küçük bir "anahtarlamalı" varyant popülasyonundan oluşur.  Bu protokol, bu popülasyonları tespit etmek ve ölçmek için hızlı bir yöntemi tanımlar.

Algılama<em&gt; Trypanosoma brucei</emManyetik Aktif Hücre Sorting ve Akış Sitometrisi ile&gt; Varyant Yüzey Glikoprotein Değiştirme

Bu iletişim kuralı, fluorescently etiketli T. cruzi şeffaf Zebra balığı larva enjekte ve parazit hareketliliği hafif levha Floresans mikroskobu kullanılarak vivo gözlendi.

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Trypanosoma cruzi Ajan Chagas hastalığının klinik olarak tanınan patoloji aniden geliştirmek uzun ömürlü asemptomatik enfeksiyondan üretir. Aşağıdaki araştırma Protokolü cinsel üst nesneden döl için aktarılan T. cruzi enfeksiyon çözülmeye bir kısa vadede ailesi tabanlı epidemiyolojik çalışma açıklar.

Naive arkadaşları için kadın ve erkek üzerinden Amerikan Tripanozomlar cinsel iletim

Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

Mevcut protokol, bozulmamış, temizlenmiş organ ve dokulardaki çoğalan ve uykuda olan Trypanosoma cruzi parazitlerini ve T hücrelerini görselleştirmek ve hassas bir şekilde ölçmek için ışık tabakası floresan mikroskopisi ve otomatik yazılım destekli yöntemleri açıklamaktadır. Bu teknikler, tedavi sonuçlarını değerlendirmek için güvenilir bir yol sağlar ve parazit-konakçı etkileşimlerine yeni bakış açıları sunar.

Sağlam Berraklaştırılmış Organlarda Tripanosoma Cruzi ile Enfekte Hücrelerin, Uykuda Olan Amastigotların ve T Hücrelerinin Kantitatif 3D Görüntülenmesi

Bu çalışma, Chagas hastalığından sorumlu patojen olan Trypanosoma cruzi'nin üç in vitro yaşam döngüsü aşamasında ultrayapı genişletme mikroskobunu gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Hücre iskeleti proteinleri ve pan-proteom etiketleme için optimize edilmiş tekniği dahil ediyoruz.

Ultrastrüktürel Genleşme Mikroskobu in Üç İn Vitro Yaşam Döngüsü Aşamaları Trypanosoma cruzi

Dünya çapında tıbbi kan parazitleri, düşük kodlu bir yapay zeka platformunda basit adımlar kullanılarak otomatik olarak tarandı. Kan filmlerinin prospektif tanısı, hibrit bir derin öğrenme modelinde bir nesne algılama ve sınıflandırma yöntemi kullanılarak geliştirilmiştir. Aktif izleme ve iyi eğitilmiş modellerin işbirliği, tripanozom iletiminin sıcak noktalarının belirlenmesine yardımcı olur.

Hibrit bir derin öğrenme modeli kullanarak tripanozom parazitlerinin üstün otomatik tanımlanması

PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Burada sağlanan protokol, veri toplama, analiz ve yorumlamaya odaklanarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans modelinde ilaç etkinliği çalışmaları gerçekleştirmek için ayrıntılı adımları açıklamaktadır. Teknik sorunları en aza indirmek için sorun giderme ve kalite kontrol prosedürleri de sağlanmaktadır.

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

Keşfedin tripozomatid enfeksiyonunda metabolit dağılımını 3D modelleme ile. Bu yöntem, doku metabolik değişiklikleri ile parazit yükü arasındaki ilişkiyi canlı ölçekte haritalamanızı sağlar.

Tripozomatid Enfeksiyonunu İncelemek için Kimyasal Kartografi Yaklaşımları

Daha fazla video keşfet